D-GLUCOSIO/D-FRUTTOSIO D-GLUCOSE/D-FRUCTOSE

D-GLUCOSE/D-FRUCTOSE
COD 12800 120 mL
D-GLUCOSIO/D-FRUTTOSIO
Soltanto per uso in vitro presso il laboratorio clinico
ESOCHINASI / FOSFOGLUCOSIO ISOMERASI
USO PREVISTO
Reagente per la misura del D-glucosio e del D-fruttosio in varie tipologie di campioni.
PRINCIPIO DEL METODO
Il D-fruttosio e il D-glucosio presenti nel campione generano, mediante la reazione descritta,
NADPH rilevabile mediante spettrofotometria. La configurazione di tali reattivi consente di
determinare il D-glucosio/D-fruttosio (zuccher total) se viene aggiunto l’enzima PGI o D-glucosio
se non aggiunto.1,2
HK
D-fruttosio + ATP
Fruttosio-6-fosfato + ADP
HK
D-glucosio + ATP
Fruttosio-6-fosfato
Glucosio-6-fosfato + NADP+
Glucosio-6-fosfato + ADP
PGI
G6P-DH
Glucosio-6-fosfato
CONTENUTO E COMPOSIZIONE
A1. Reattivo. 2 x 40 mL. Tampone 70 mmol/L, Esochinasi >15 U/mL, NADP >1.5 mM,
conservanti, pH 6,9.
A2. Reattivo. 2 x 10 mL. Tampone 70 mmol/L, fosfoglucosio isomerasi >50 U/mL, conservanti,
pH 6,9.
B. Reattivo. 2 x 10 mL. Tampone 150 mmol/L, ATP >15 mmol/L, glucosio-6-fosfato
deidrogenasi >10 U/mL, conservanti, pH 8,9.
S. Standard multizucchero: 1 x 5 mL. I valori di concentrazione assegnati a ogni componente
e alla rispettiva tracciabilità sono riportati nelle tabelle in allegato (Nota 1).
ATTENZIONE: H317: Può provocare una reazione allergica cutanea. P302+P352: IN
CASO DI CONTATTO CON LA PELLE: lavare abbondantemente con acqua e sapone.
P333+P313: In caso di irritazione o eruzione della pelle: consultare un medico.
Per maggiori avvertimenti e precauzioni, vedere la scheda di sicurezza del prodotto (SDS).
CONSERVAZIONE
Conservare a 2-8ºC.
I componenti sono stabili fino alla data di scadenza di cui all'etichetta del kit se conservati ben
chiusi ed evitandone la contaminazione durante l'uso.
Indicazioni di deterioramento: Assorbanza del bianco superiore al limite di cui ai "Parametri della
prova".
ATTREZZATURA AGGIUNTIVA
Analizzatore, spettrofotometro o fotometro con provetta termostatizzabile a 37ºC per letture a
340 nm.
PREDISPOSIZIONE DEI REATTIVI
Per la determinazione del D-glucosio/D-fruttosio senza differenziazione: preparare un reattivo A
(RA) svuotando il contenuto del Reattivo A2 nel flacone del Reattivo A1. Agitare dolcemente.
Per preparare altri volumi, miscelare secondo le seguenti proporzioni: 4 mL di Reattivo A1 + 1
mL di Reattivo A2. Stabile fino alla data di scadenza di cui all’etichetta, purché ben chiusi e
purché se ne eviti la contaminazione durante l’uso. Il reattivo B è pronto all’uso.
Per la determinazione del D-glucosio: i reattivi sono pronti all’uso.
PROCEDIMENTO
Procedimento manuale (Nota 2)
1. Prersicaldare i reattivi e il fotometro a 37ºC.
2. Pipettare in una provetta:
Standard / Campione
Acqua distillata
Reattivo A (A1+A2)
Reattivo A1
D-glucosio
Reattivo
bianco (RB)
Standard /
Campione
Reattivo
bianco (RB)
Standard /
Campione
12 µL
1000 µL
-
12 µL
1000 µL
-
10 µL
800 µL
10 µL
800 µL
3. Miscelare e incubare per 1 min a temperatura ambiente (16-25ºC) oppure a 37ºC. Leggere
l’assorbanza (A1) a 340 nm.
4. Pipettare in una provetta:
Reattivo B
200 µL
200 µL
200 µL
200 µL
5. Miscelare e incubare per 15 min a temperatura ambiente (16-25ºC) oppure 10 min a 37ºC.
Leggere l’assorbanza (A2) del bianco reattivo, dello standard e del campione a 340 nm.
Colore stabile almeno per 30 min.
6. Calcolare la concentrazione nel campione (C) con le formule seguenti:
(A2 – 0,84 x A1)Campione – (A2 – 0,84 x A1)RB
x CStandard (D-gluc/D-frutt) [g/L] = CCampione (D-gluc/D-frutt) [g/L]
(A2 – 0,84 x A1)Campione – (A2 – 0,84 x A1)RB
(A2 – 0,80 x A1)Campione – (A2 – 0,80 x A1)RB
(A2 – 0,80 x A1)Campione – (A2 – 0,80 x A1)RB
CCampione (g/L) x V (L)
x 100
x df = CT Campione
[g/100 g]
WCampione (g)
CALIBRAZIONE
Si consiglia di effettuare il bianco di reagente ogni giorno e di provvedere alla calibrazione
almeno ogni 3 mesi a sostituzione avvenuta del lotto di reagente o quando richiesto dalle
procedure di controllo della qualità.
CONTROLLO DELLA QUALITÀ
Gluconato-6-fosfato + NADPH+H+
D-glucosio/D-fruttosio
Nell'analisi dei campioni solidi e semisolidi pesati per relativa preparazione, il contenuto
(g/100 g) (CT) viene calcolato partendo dalla quantità di campione pesato (W), dal volume
utilizzato per preparare il campione pesato (V), dalla concentrazione ottenuta nel campione (C)
e dal fattore di diluizione (df) se necessario, come di seguito illustrato:
x CStandard (D-glucosio) [g/L] = CCampione (D-glucosio) [g/L]
Ogni laboratorio è tenuto a definire un programma di controllo interno della qualità nonché
procedimenti correttivi laddove i controlli non soddisfino le tolleranze accettabili.
CARATTERISTICHE METROLOGICHE1-3
Le caratteristiche metrologiche illustrate sono state ottenute con un analizzatore BA400. I dati di
valutazione sono disponibili su richiesta.
− Limite di rilevabilità: D-glucosio: 0,03 g/L / D-glucosio/D-fruttosio: 0,02 g/L.
− Limite di linearità: D-glucosio: 8,00 g/L / D-glucosio/D-fruttosio: 8,00 g/L
− Precisione:
Concentrazione media D-glucosio
Ripetibilità (CV)
Imprecisione totale
(CV)
0,51 g/L
2,04 g/L
0,5 %
0,5 %
1,2 %
0,8 %
Concentrazione media D-glucosio/Dfruttosio
Ripetibilità (CV)
Imprecisione totale
(CV)
1,03 g/L
4,05 g/L
0,9 %
0,3 %
2,0 %
0,8 %
− Veridicità: I risultati ottenuti con questi reagenti non evidenziano differenze sistematiche
significative se raffrontati con un procedimento di riferimento. I dati dello studio comparativo
sono disponibili su richiesta.
NOTE
1. Sebbene si consigli di calibrare ogni serie di misure con lo standard, la concentrazione del
campione (C) può essere calcolata anche utilizzando il fattore successivo:
[(A2 – 0,84 x A1)Campione – (A2 – 0,84 x A1)RB] x 2.92 = CCampione (D-gluc/D-frutt) [g/L]
[(A2 – 0,80 x A1)Campione – (A2 – 0,80 x A1)RB] x 2.60 = CCampione (D-glucosio) [g/L]
2. I volumi proposti prevedono l'uso di una cuvetta semimicro. Si possono utilizzare altri volumi
se si mantiene il rapporto tra i reagenti e il campione.
BIBLIOGRAFIA
1 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Evaluation of precision of quantitative
measurement methods; Approved guideline – Third edition. EP5-A3. Wayne: USA 2004.
2. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Evaluation of detection capability for
clinical laboratory measurement procedures; Approved guideline – Second edition. EP17-A2.
Wayne: USA 2012.
3. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Evaluation of the linearity of quantitative
measurement procedures: a statistical approach; Approved guideline – Third edition. EP6-A.
Wayne: USA 2003.
4. International organization of vine and wine (OIV), Compendium of international methods of
wine and must analysis Vol. 1 & 2, 2008.
5. Zoecklein BW, Fugelsang KC, Gump BH, Nury FS, Wine analysis and production. Van
Nostrand Reinhold; 1 edition (December 31, 1990).
6. A.O.A.C 17th Ed., 2000 Offitial method 920.180 Honey (liquid, strained or comb), preparation
of test sample.
CAMPIONI
PARAMETRI DELLA PROVA
Procedure di preparazione
Questi reagenti si possono utilizzare anche in altri analizzatori automatici. Rivolgersi al proprio
distributore per informazioni.
● Filtrare o centrifugare le soluzioni torbide.
● Degassare i campioni con diossido di carbonio in un bagno ad ultrasuoni o agitare il
campione in un becher per circa 1 min.
● Schiarire i campioni particolarmente colorati con polivinilpirrolidone (PVPP) (ad es. 1 g
PVPP/100 mL campione), agitare per 1 min. e filtrare o centrifugare per rimuovere PVPP.
● Diluire convenientemente con acqua distillata i campioni le cui concentrazioni superano il
limite di linearità indicato. Moltiplicare la concentrazione ottenuta per il fattore di diluizione.
BioSystems Y15
Reagente 1: Utilizzare el Reagente A (A1+ A2) per l'analisi del D-glucosio/D-fruttosio o
Reagente A1 per l'analisi del D-glucosio.
Reagente 2: Utilizzare il Reagente B.
GENERALE
GLUCOSE-FRUCTOSE
differenziale bireagente
g/L
crescente
2
GLUCOSE
differenziale bireagente
g/L
crescente
2
Lettura
Campione
Reattivo 1
Reattivo 2
Lavaggio
Fattore prediluizione
Filtri principale
Filtri riferimento
Lettura 1
Lettura 2
Reattivo 2
monocromatica
3
250
50
1,2
340
72 s
600 s
96 s
monocromatica
3
240
60
1,2
340
72 s
600 s
96 s
CALIBRAZIONE
Tipo di calibrazione
Curva di calibrazione
multicalibratore
-
multicalibratore
-
OPZIONI
Limite assorbanza del bianco
Limite bianco cinetico
Limite linearità
0,300
8,00
0,300
8,00
Tecnica
Modo analítico
Tipo di campione
Unità
Tipo di reazione
Decimali
● Triturare e/o omogenizzare i campioni solidi.
● Chiarificare con il reagente Carrez (BioSystems cod. 12837) aggiungendo 5 mL di Carrez-I e
5 mL di Carrez-II all'estratto liquido del campione in un matraccio tarato da 100 mL. Regolare
il pH 7.5 – 8.5 con idrossido di sodio. Mescolare dopo ogni aggiunta, aggregare acqua
distillata fino al segno del matraccio e filtrare.
● Estrarre i campioni contenenti materia grassa con acqua calda a una temperatura superiore
al punto di fusione dei grassi. Lasciar riposare a temperatura ambiente e riempire il matraccio
di acqua distillata fino al segno. Stoccare con ghiaccio o nel refrigeratore per 15-30 min.
Quindi, filtrare. Utilizzare il surnatante trasparente o leggermente opalescente per il saggio. È
possibile verificare anche con il reagente Carrez.
● Deproteinizzare i campioni contenenti proteine con il reagente Carrez.
Esempi campione:
Succhi di frutta e bevande analoghe: Filtrare, chiarificare e scolorire e/o diluire, all'occorrenza,
il succo come da "Procedure di preparazione".
Vino rosso e bianco4,5: Filtrare, chiarificare e scolorire e/o diluire, all'occorrenza, il vino come
da "Procedure di preparazione".
Si consiglia di utilizzare il vino di controllo (rosso) (BioSystems cod. 12822) e il vino di controllo
(bianco) (BioSystems il dell'ordine cod. 12821) per verificare la funzionalità della procedura di
misurazione.
Birra: Degassare come da "Procedure di preparazione".
Conserve e altri prodotti derivati di frutta e verdure: Pesare all'incirca 0,5 g del campione
omogeneizzato in un matraccio tarato da 100 mL e riempirlo di acqua distillata fino al segno.
Quindi, mescolare e filtrare. All'occorrenza, diluire il campione.
PROCEDIMENTO
Dolci e gelati: Pesare all'incirca 3 g di campione in un matraccio tarato da 100 ml. Aggiungere
60 mL di acqua e incubare per 15 min. circa a 70°C, agitando ogni tanto. Lasciar riposare a
temperatura ambiente. Riempire d'acqua fino al segno. Mescolare e filtrare. Chiarificare e/o
diluire il campione, all'occorrenza, come da "Procedure di preparazione".
BioSystems Y25
Cibi solidi: Triturare e/o omogenizzare i campioni solidi. Pesare un campione rappresentativo,
estrarre con acqua (all'occorrenza, riscaldare fino a 60°C) e filtrare. Chiarificare e/o diluire il
campione, all'occorrenza, come da "Procedure di preparazione".
Reactivo 1: Utilizar el Reactivo A (A1+ A2) para el análisis de D-glucosa/D-fructosa o Reactivo
A1 para el análisis de D-glucosa.
Reactivo 2: Utilizar el Reactivo B.
Miele6: Nel caso di campioni densi o cristallizzati, versare da 5 a 10 g di miele in un becher e
riscaldare per 5 min. a circa 60°C (non occorre riscaldare il miele liquido), agitando con la
spatola. Lasciar raffreddare. Pesare 3 g del campione liquido e sciogliere con 60 mL d'acqua in
un matraccio tarato da 100 mL. Quindi, riempire fino al segno e mescolare. Diluire 1/10 della
soluzione di miele al 3%.
Campioni di fermentazione e metodi di coltura cellulare: Centrifugare il campione a 5.000 g
per 5 min., filtrare il surnatante e utilizzare il liquido filtrato nel saggio, diluito se necessario. Si
consiglia di disattivare le reazioni enzimatiche sistemando il campione in un bagno d'acqua a
80ºC per 15 min. Si può anche deproteinizzare il campione come da "Procedure di
preparazione".
Altre applicazioni: Questo metodo può essere utilizzato anche con altre tipologie di campioni.
Per ulteriori informazioni, contattare il proprio fornitore.
M12800t-10
GENERALE
GLUCOSE-FRUCTOSE
differenziale bireagente
g/L
crescente
2
GLUCOSE
differenziale bireagente
g/L
crescente
2
Lettura
Campione
Reattivo 1
Reattivo 2
Lavaggio
Fattore prediluizione
Filtri principale
Filtri riferimento
Lettura 1
Lettura 2
Reattivo 2
monocromatica
3
250
50
1,2
340
75 s
600 s
90 s
monocromatica
3
240
60
1,2
340
75 s
600 s
90 s
CALIBRAZIONE
Tipo di calibrazione
Curva di calibrazione
multicalibratore
-
multicalibratore
-
OPZIONI
Limite assorbanza del bianco
Limite bianco cinetico
Limite linearità
0,300
8,00
0,300
8,00
Tecnica
Modo analítico
Tipo di campione
Unità
Tipo di reazione
Decimali
PROCEDIMENTO
07/2016