© 88-08-07275-4 Capitolo 5 • Il paradigma dell’espressione differenziale dei geni 105 Scoperte recenti hanno dimostrato che numerosi fattori di trascrizione agiscono reclutando le istone acetiltransferasi. Quando le proteine istoniche sono acetilate, il nucleosoma si disgrega, consentendo ad altri fattori di trascrizione e alla RNA polimerasi di accedere al sito. Alcuni TAF, come TAFII250, sono essi stessi istone acetiltransferasi, cosicché possono attivare la trascrizione sia destabilizzando il nucleosoma, sia permettendo alla proteina TBP di legarsi al DNA e di istituire così un sito di legame per la RNA polimerasi (Fig. 5.10; Mizzen et al. 1996). Tipo selvatico mitf–/– Mitf Tirosinasi Figura 5.8 Modello tridimensionale dell’omodimero di MITF (una proteina in rosso e l’altra in azzurro) che si lega a un elemento promotore nel DNA (bianco). Gli estremi aminoterminali sono situati in basso nella figura e formano il dominio di legame al DNA. Il dominio di interazione proteina-proteina è situato immediatamente al di sopra. Si ritiene che l’estremo carbossileterminale della molecola sia il dominio attivatore in trans, che lega il co-attivatore proteico p300/CBP. (Da Steingrímsson et al. 1994; fotografia per gentile concessione di N. Jenkins.) motore di geni che codificano tre proteine della famiglia delle tirosinasi, specifiche delle cellule pigmentate (Bentley et al. 1994; Yasumoto et al. 1997). In assenza di MITF queste proteine non vengono sintetizzate in modo corretto (Fig. 5.9) e la melanina non viene prodotta. Tali promotori contengono tutti la stessa sequenza di 11 coppie di basi, comprendente la sequenza centrale CATGTG riconosciuta da MITF. La terza regione funzionale di MITF è il suo dominio attivatore in trans. Questo dominio comprende una lunga sequenza di aminoacidi al centro della proteina. Quando il dimero MITF si lega alla sua sequenza target in un promotore o in un enhancer, la regione attivatrice in trans è in grado di legare un TAF detto p300/CBP, che è un enzima istone acetiltransferasi, capace di trasferire gruppi acetile a ogni istone del nucleosoma (Ogryzko et al. 1996; Price et al. 1998). L’acetilazione destabilizza i nucleosomi e permette che siano espressi i geni degli enzimi che fanno produrre il pigmento. Proteina tyrosinaserelated 1 Proteina tyrosinaserelated 2 Figura 5.9 Il MITF è necessario per la trascrizione dei geni per la pigmentazione. Sono presentate sezioni seriate dell’occhio di embrioni di topo di 15,5 giorni. Nell’embrione di tipo selvatico l’ibridazione in situ dimostra la presenza di mRNA Mitf (colorazione scura) nello strato dell’epitelio pigmentato della retina. Nell’embrione mutante mi (mitf – / –), il MITF non è presente. Il MITF riconosce il sito promotore di tre geni codificanti enzimi che prendono parte alla produzione di melanina. Nel mutante mitf – / – i geni che codificano questi enzimi non sono trascritti in modo accurato, in confronto al tipo selvatico. La trascrizione del gene della proteina tyrosinase-related 2 nel mutante è significativamente ridotta. (Da Nakayama et al. 1998; fotografie per gentile concessione di H. Arnheiter.) Capitolo 5 • Il paradigma dell’espressione differenziale dei geni 111 © 88-08-07275-4 tre gli stessi promotori sono altamente metilati nelle cellule che non producono globine. Inoltre il modello di metilazione si modifica nel corso dello sviluppo (Fig. 5.18B). Le cellule che producono emoglobina nell’embrione umano hanno promotori non metilati nei geni che codificano le globine ε («catene globiniche embrionali») dell’emoglobina embrionale. Questi promotori vengono metilati nel feto, quando vengono attivati i geni delle globine γ, specifiche dell’emoglobina fetale (al posto delle catene embrionali) (van der Ploeg e Flavell 1980; Groudine e Weintraub 1981; Mavilio et al. 1983). Analogamente, quando alle globine fetali subentrano quelle adulte (β), i promotori dei geni delle globine γ vengono metilati. La correlazione tra citosine metilate e repressione della trascrizione è stata confermata sperimentalmente. Inserendo nelle cellule transgeni con differenti modelli di metilazione, Busslinger e collaboratori (1983) dimostrarono che la metilazione del promotore o dell’enhancer di un gene è strettamente correlata con la repressione della trascrizione del gene. Nello sviluppo dei vertebrati l’assenza di metilazione del DNA mostra una buona correlazione con l’espressione tessuto-specifica di molti geni. (A) L1 promotore NRSE lacZ (B) L1 promotore Assenza di NRSE lacZ Figura 5.17 Silencer. Analisi del modello di colorazione per la β-galattosidasi in embrioni di topo di 11,5 giorni. (A) Embrione contenente un transgene costituito dal promotore L1, una parte del gene L1 e un gene lacZ fuso nel secondo esone (che contiene la regione NRSE). (B) Embrione contenente un transgene simile, ma privo della sequenza NRSE. Le regioni scure rivelano la presenza di β-galattosidasi (il prodotto del gene lacZ). (Da Kallunki et al. 1997.) principale di regolazione della trascrizione nei vertebrati; invece nella Drosophila, nei nematodi e probabilmente in molti invertebrati non si ha metilazione del DNA. Nei vertebrati, la presenza di citosine metilate nel promotore di un gene è in correlazione con la repressione della trascrizione di quel gene. Nel differenziamento degli eritrociti dell’uomo e del pollo il DNA dei promotori dei geni delle globine è quasi completamente non metilato, menFigura 5.18 Metilazione dei geni della globina in cellule embrionali del sangue nell’uomo. (A) Struttura della 5-metilcitosina. (B) L’attività dei geni della globina β umana mostra una correlazione inversa con la metilazione dei loro promotori. (Da Mavilio et al. 1983.) (A) N NH2 O N DNA Citosina Demetilazione CH3 N Metilazione Come vengono metilati certi geni e in che modo la metilazione impedisce l’espressione dei geni? Una risposta possibile è che vi sia un’interazione reciproca tra gli istoni della cromatina e il DNA che si avvolge attorno ad essi. Pare che esista una competizione per la modificazione del residuo di lisina in posizione nove dell’istone H3. Se questo sito viene acetilato, l’istone viene destabilizzato e può causare la dispersione del nucleosoma. Se il sito non viene acetilato, può essere metilato. La metilazione di questo istone aumenta la stabilità del nucleosoma, impedendone la dissociazione o lo spostamento. Così la modificazione della coda dell’istone H3 potrebbe agire come un «commutatore» tra lo stato attivato (nucleosomi disgregati) e quello inattivato (nucleosomi stabili) di un gene. L’istone metilato potrebbe essere capace di reclutare nelle sue vicinanze gli enzimi che operano la metilazione del DNA (Rea et al. 2000; Tamaru e Selker 2001). Una volta metilato, il DNA può stabilizzare ancora di più i nucleosomi. Una proteina detta MeCP2 si lega in modo selettivo alle regioni metilate del DNA e si lega anche alle istone deaceti- Promotore non metilato (B) NH2 Modificazioni della cromatina 5′ Promotore metilato Gene della globina ε Gene della globina γ 3′ DNA O N 6 settimane Attivo H DNA 5-metilcitosina Globina ε Inattivo 5′ 12 settimane 3′ Inattivo Attivo Globina γ