Scuola di Specialità

Scuola di Specialità
Argomento
• Immunità naturale
Recettori
8-10-12
Risposta immune innata
-E’ la prima linea di difesa
-L’approfondimento della ricerca di
quest’arma potente è stata sottovalutata
per la scoperta degli anticorpi,
cellule B e T.
Innate immunity

Immediate protection

Low specificity broad
reactivity

Important for first exposure
Tre linee di difese contro le infezioni
Difese dell’organismo
Barriere
Invasione
& infezione
Immunità Innata
+
+
Infiammazione
Immunita Adottiva
Cute e mucose
Superfici labili, movimenti peristaltici,
clearance mucociliare, vomito, urine lacrime,
tosse.
Difese Umorali e Cellulari Innate
Lisozima, secrezioni sebacee /mucose, acidità
stomaco, organismi commensali,
proteine del complemento,
fagocitosi, cellule NK
Difese Umorali e Cellulari Specifiche
Anticorpi, citochine,
Linfociti T helper, linfociti T citotossici
Infiammazione
Reazione della microcircolazione caratterizzata da movimento di
fluidi e leucociti dal sangue ai tessuti extravascolari con lo scopo
di bloccare e riparare i danni fisici (ferite, bruciature, traumi) o
eliminare agenti patogeni ( virus,batteri,funghi,cellule tumorali).
Comparison of Innate and Adaptive
immune system
Innate
Receptors/Ligands
Conserved
Immediate
Fully mature at birth
Adaptive
Diverse
Slow,
increase with time
(i.e. memory)
Immature at birth
Comparison of the adaptive and innate immune responses
innate
adaptive
Response time
hours
days
Response to
repeat infection
identical to primary
(no memory)
stronger response upon
second exposure (memory)
Receptors that
Mediate pathogen
Recognition
pattern recognition receptors
e.g. Toll-like receptors (TLR)
limited diversity,
fixed in germline
antibodies and T cell antigen receptors (TCR)
Ligands
Pathogen associated molecular
patterns (PAMPs)
virtually any component of pathogen
unlimited diversity
generated by V(D)J recombination
Comparison of innate and adaptive immune recognition
Receptors that mediate
innate immune recognition: Tolllike receptors (TLR)
Receptors that mediate adaptive immune recognition:
Antibody and the T cell receptor (TCR)
Cells of the immune system
• B cells
• T cells
• NK cells
• Monocytes/macrophages
• Neutrophils
• Eosinophils
• Basophils/Mast cells
Cell types of innate immunity
Immunità innata e acquisita
Takeda and Akira. Int Immunol 2005;17:1-14
Componenti dell’ immunità innata
• Humorale
Cellulare
• Systema del Complement
• Citochime/chemochine
• Diversi enzimi
Granulociti
Monociti/macrofagi
Cellule NK
Mastociti
Cellule Dendritic he
Cellule epiteliali
Fibroblasti
Adipociti
Recettori
Caratteristiche e meccanismi
dell’immunità innata
• Presente in tutti gli organismi multicellulari.
• Prima linea immunologica di difesa contro le infezioni.
• Funziona prima dello sviluppo dell’immunità specifica (adattativa).
• L’attivazione del sistema immune innato è cruciale per una protezione
adeguata dell’immunità acquisita (TH1 o TH2) (Kimbrell & Beutler 2001
Nature Rev 2).
• In alcuni casi è sufficente per controllare o eliminare l’infezione.
• Cooperazione vicina all’immunità specifica.
Riconoscimento dei
prodotti microbici

Conservato tra I microbi.

Conosciuto come “patroni molecolari associati ai
patogeni” (PAMPs).

PAMPs possono essere riconosciuti da sistemi immuni
di piante e di animali.

Soltanto I vertebrati hanno un sistema immune
adattativo.
•
I microrganismi patogeni vengono RICONOSCIUTI
dall'immunità innata grazie a molecole recettoriali dette
Pattern Recogntion Receptors (PRR). Sono in numero
limitato. Direttamente codificati nel genoma.
•
Riconoscono dei profili molecolari associati al patogeno
(PAMPs: Pathogen-associated molecular patterns)
Doan et al. Le basi dell’immunologia. Zanichelli
Pathogen / Danger
Associated Molecular Patterns
(PAMPs / DAMPs)

PAMPs: componenti unici dei microrganismi (non prodotte
dall'ospite) spesso essenziali per il patogeno.
es. LPS, acido lipoteicoico, GPI, CpG, RNA a doppia elica,
flagellina.

DAMPs: sono prodotte nel ospite durante l’infiammazione
o possono provenire dal esterno.
es. heat-shock proteins, RNA da cellule morte, proteina
BA, Mrp8/14, fosfolipidi ossidati, fibrinogeno, acido
ialuronico, silica, asbestos.
Amplificano la risposta infiammatoria
PAMPs:
Piccoli motivi invariati tra microrganismi della stessa classe
(zuccheri, proteine, lipidi, acidi nucleici o combinazioni).
Essempi:
LPS:
Carboidrati e Lipidi
Peptidoglicano:
Carboidrati e Proteine
Recettori dell'immunità innata
•
Possono essere
–
–
–
secreti (solubili),
localizzati sulla membrana plasmatica
intracellulari
•
Ogni cellula esprime più di un tipo di
recettore
•
Il numero dei recettori PRR è limitato
Recettori solubili
• Riconoscono strutture microbiche
• Riconoscono strutture alterate del self
Recettori solubili
•
–
•
Fattori del complemento
MBL: lectina legante il mannosio
Pentrassine
–
–
•
Corte (PCR) prodotte dal fegato
Lunghe (PTX3) prodotte dai tessuti
extraepatici
Aumentano fortemente durante la risposta
infiammatoria
Recettori localizzati
sulla membrana plasmatica
• Recettori del complemento (CR3, CR4)
• Recettori Fc (frammento cristallizzabile Ab)
• Recettore per il mannosio
• CLRs (C-type lectin receptor)
• SRCR
• Scavenger receptor cysteine rich
(acidi nucleici, acido lipoteicoico G+)
• TLR
• Toll-like receptor
Recettori della famiglia Toll
•
Costituiscono la classe più importante di recettori
dell'immunità innata
•
Possono riconoscere PAMPs sulla membrana cellulare o
da vescicole intracellulari quali gli endosomi
•
Scoperto in Drosophila melanogaster come gene
importante per l’orientamento dorso-ventrale dell’insetto
e per la resistenza ai funghi
•
Parola dal tedesco che significa: grande, magnifico.
Christiane Nüsslein-Volhard
Nobel laureate (Medicina 1995)
• Insieme a Wieshcaus ha identificato i geni coinvolti nello svillupo degli
embrioni della Drosophila melanogaster. (1985)
• Lei ha chiamato alla proteina: “Toll” (che in tedesco singifica grande,
magnifico).
Toll gene
1988 TOLL gen: importante per lo sviluppo di
polarità dorso-ventrale della Drosophila (Hashimoto)
1996 TOLL gen: controlla la risposta antifungica
nella Drosophila (Lemaitre)
1997 Toll umano omologo al toll delle proteine toll
d’attivazione dell’immunità nella Drosophila
(Medzhitov and Janeway)
1998 Si scopre che topi con un’alterata risposta al
LPS era dovuto ad una mutazione del gene TLR4
(Beutler)
L’osservazione che il recettore Toll aveva un
dominio in comune con il recettore dell’IL1 (IL-1R) portò all’ipostesi che Toll era
coinvolto nella immunità innata.
Esperimento su Drosophila
Aspergillus fumigatus
Source: www.darwin.museum.ru
• Infected Tl-deficient adult flies
with Aspergillus fumigatus
• All flies died after 2-3 days
• Flies use Toll to defend from fungi
• Thus, in Drosophila, Toll seems to
be involved in embryonic
development and adult immunity
Lemaitre et al., Cell 1996; 86: 973-83
Aspergillus
fumigatus
Recettori Toll-like
•
Sono codificati nella linea germinativa (non
sono prodotti per ricombinazione somatica
dei geni come i recettori dell'immunità
specifica)
•
La loro espressione è modulata dai patogeni,
dalle citochine e da vari stress ambientali
Recettori Toll-like
• Il recettore Toll è stato clonato da Schneider e
Anderson
• Sono i primi PRR ad esere identificati.
• Sono i PRR meglio caracterizzati e
riconoscono una ampia gama di PAMPs (Akira
et al. 2006, Beutler, 2009; Hoffmann, 2003;
Medzhitov, 2007).
La risposta dell’immunità innata è stata conservata tra la Drosophila
e gli umani
Conserved pathways in innate immunity in Drosophila and mammals
Examples chosen are, left: induction of the antifungal gene drosomycin by binding of
processed Spaetzle protein to the transmembrane receptor Toll
Right: activation of costimulatory protein genes by binding of a LPS-LBP-CD14 complex to a
human Toll homolog, TLR
Source: Hoffman 1999 Science 284
Recettori toll-like (TLR)
•
Si localizzano sia a livello
della membrana plasmatica
che a livello endosomiale
•
Sono proteine
transmembrana che hanno
un comune dominio
extracellulare, ricco di
leucina e un dominio
citoplasmatico comune.
Different mammalian Toll-like receptors (TLRs) are specific
for different classes of microbial products
Insert Fig 3-11
TLR
Omologo al IL-1R
Regione extracellulare:
• TLR: ricco in leucina
• IL-1R: 3 domini immunoglobulinici
Porzione citoplasmatica:
• dominio TIR (Toll/IL1receptor) nei
mammiferi, il dominio TIR è condiviso dai
recettori Toll e dai recettori di IL1
• conservato
all’uomo.
nell’evoluzione
dalle
piante
• attiva una cascata di eventi che porta
all’attivazione dei meccanismi di resistenza
innati
Due domini dei TLRs: Extracellulare-Citoplasmatico
Dominio extracellulare:
Leucin Reach Repeat motifs (LRR)
BINDING
Dominio citoplasmatico:
Toll-interleukin 1 resitance (TIR) domain
SIGNALING
Takeda and Akira. 2005. Int Immunol 2005;17:1-14
TLR Cell Type Distribution
Receptor
Cell Type
TLR1
Ubiquitous
TLR2
DCs, PMLs, and monocytes
TLR3
DC and NK cells, upregulated on epithelial and endothelial
cells
Macrophages, PMLs, DCs, ECs, but not on
lymphocytes
Monocytes, immature DCs, epithelial, NK, and T cells
TLR4
TLR5
TLR6
High expression in B cells, lower on monocytes and NK
cells
TLR7
B cells, plasmacytoid percursor DCs
TLR8
Monocytes, low in NK cells and T cells
TLR9
Plasmacytoid percursor DCs, B cells, macrophages,
PMLs, NK cells, and microglial cells
TLR10
B cells, plasmacytoid precursor DCs
TLR11
Not Determined
Different mammalian Toll-like receptors (TLRs) are specific
for different classes of microbial products
Tripanosoma
Micoplasmi,
micobatteri,
spirochete
Ancora GPI
Eterodimeri costituiti da TLR1 e TLR2
o TLR2 e TLR6 riconoscono i
peptidoglicani della parete batterica
Gram+
PGN
Lieviti
Zymosan
e costituenti di funghi, micoplasmi,
micolbatteri, spirochete e parassiti.
TLR2
TLR1
TLR2
T
I
R
T
I
R
TLR6
T
I
R
T
I
R
HSP60
LTA
RNA
Doppia elica
flagellina
LPS
TLR4
TLR3
TLR5
T
I
R
CD14
T
I
R
MD2
T
I
R
T
I
R
TLR3, TLR7, TLR8, TLR9
riconoscono acidi nucleici
derivati da virus e batteri
Si trovano in compartimenti
intracellulari e i loro
ligandi devono essere
internalizzati negli
endosomi per attivare il
segnale
La loro attivazione porta alla
produzione di IFNs di tipo
I oltre che di citochine
I recettori Toll portano all’attivazione di geni
proinfiammatori
Principale meccanismo è l’attivazione di NFkB
The NF-kB Family of Transcription
Factors
• Trovato in tutti i tipi di cellule
• Descritto per la prima volta nel 1986 come un fattore nucleare
• E’ fondamentale nell’induzione di molte proteine infiammatorie:
citochine, proteine di fase acuta, molecole di adesione
• NF-kB esiste nel citoplasma come un eterotrimero inattivo
composto da due proteine (p50 e p65) e un inibitore detto inibitore
di kB (IkB)
• Chinasi fosforilano IkB. IkB fosforilato si stacca dal complesso
proteico che quindi migra al nucleo dove si lega a siti di consenso
NFkB situati a monte di diversi geni infiammatori
patogeni
IL1
TLR
TNF
Radiazioni,
radicali liberi
IkB
p50 p65
P
IkB
P
p50 p65
NFkB
citochine
chemochine
Molecole di
adesione
NO sintasi
COX2
Fattori della
coagulazione
Funzioni effetrici dei TLRs:
-Produzione di citochine
e chemochine proinfiammatorie
-Reclutazione di
cellule fagocitiche
-Mobilizzazione di
cellule APC
-Attivazione del
complemento
Essempio: TLR4
MyD88 è costituita da un dominio TIR
(rosso) e da un dominio DD (death
domain, dominio di interazione
proteina-proteina; verde)
Grazie a DD, MyD88 recluta alcune
chinasi denominate IRAK
Le IRAK fosforilano un adattatore
(TRAF6) che recluta chinasi
diverse
TLR4
MyD88
IRAK
TRAF6
A valle di TRAF6 viene attivata una
via che attiva NFkB e una via che
porta all’attivazione delle chinasi
da stress (JNK, p38)
TAK1 MKK6
NF-kB JNK, p38
IL-1R
MyD88
IRAK
TRAF6
TAK1 MKK6
NF-kB JNK, p38
TLR 4 rileva la presenza
di batteri Gramattraverso la presenza
di LPS.
Il dominio extracellulare
di TLR4, cooperando
con CD14 e con la
proteina accessoria
MD-2, riconosce LPS.
TLR4
Topi con mutazioni o mancanti di TLR4 e topi
mancanti di MD2 sono altamente suscettibili a
infezioni da Gram- (Qureshi ST et al. J. Exp.
Med 1999; Nagai Y et al. Nat Immunol 2002)
Modulazione di TLR-4 come strategia
per trattare la sepsi
Overstimolazione di TLR-4 nella sepsi
Nell’uomo: elevati livelli di MD-2 si ritrovano nel
plasma e nelle urine di pazienti con infezioni gravi o
sepsi.
L’espressione di TLR4 è aumentata in monociti da
volontari a cui è stato somministrato LPS e nei
pazienti con sepsi
Modulatori di TLR-4
Mrp8/14 o S100A8/S100A9 o calprotectin
• Etrodimero rilasciato da neutrofili e monociti
(essempio di DAMPs)
• Diverse patologie infiammatorie (artrite reumoatoide,
fibrosi cistica, bronchite cronica) si associano a
elevati livelli di concentrazione plasmatica di
MRP8/14
• Marker di processi infiammatori
Mrp8/14 lega TLR4 e amplifica
l’infiammazione
Topi mancanti di Mrp8/14 hanno ridotti segni di infiammazione
sistemica quando infettati con E.coli e sono protetti da shock
Elevati livelli di Mrp8/14 si trovano nel plasma di pazienti con
peritonite e sepsi
•
•
Myeloid-related protein 8/14 complex is released by monocytes and
granulocytes at the site of coronary occlusion: a novel, early, and sensitive
marker of acute coronary syndromes
L.A. Altweggl et al., 2007, European Heart Journal, Vol 28, p.941-948
CONCLUSION
Figure 5 Percentage of patients with myocardial infarction (MI)
and levels above the respective cut-offs for MRP8/14 and the
classical markers of myocardial necrosis in relation to time (h;
hours) from symptom onset to blood sampling. The number of
patients for the three different time intervals are 4, 11, and 9,
respectively. Patients presenting after 12 h are not shown.
This study for the first time demonstrates
that MRP8/14, a heterodimeric protein
complex expressed by activated
monocytes and granulocytes, is elevated
in ACS (acute coronary syndromes) at
the site of coronary occlusion and in the
systemic circulation. Importantly,
MRP8/14 was increased prior to necrosis
markers such as myoglobin, CK-MB, and
troponin, and separated patients with
ACS from those with stable or no CAD
(coronary artery disease ). This makes
this protein a prime candidate and a novel
biomarker of unstable plaques in patients
with chest pain.
Toll come bersaglio terapeutico
Modulatori endogeni della risposta
infiammatoria possono indurre una mancata
regolazione della risposta immune come si
osserva nella sepsi.
Mpr8/14 potrebbe essere uno di questi
modulatori endogeni
Anticorpi Anti TLR4
Inibiscono in vitro la risposta di cellule
immunitarie a LPS o a batteri GramProteggono dalla morte topi esposti a
endotossina o a E.coli (Roger et al. PNAS,
2009)
Eritroran: antagonista del TLR4
Eritoran (molecola
sintetica, analoga del
lipide A) inibisce
l’attivazione di TLR4
legando MD-2 in una
tasca idrofobica.
(Esai Co.)
Crystal Structure of the TLR4-MD-2 Complex with Bound Endotoxin
Antagonist Eritoran
Kim HM et al. Cell 2007
ERITORAN
• In vitro blocca la produzione di citochine dal
sangue intero
• Nei pazienti diminuisce i sintomi clinici (per
ess. febbre) e la risposta infiammatoria (conta
leucociti, livelli di PCR, IL-6, TNF-a) indotta
da endotossina in volontari sani
TLR4 signaling pathway potrebbe costituire un
importante target terapeutico
Varie molecole potrebbero diventare nuove
terapie adiuvanti capaci di diminuire gli effetti
deleteri di una eccessiva risposta
infiammatoria
Recettori intracellulari
Recettori di membrana
Possono riconoscere PAMPs
sulla membrana cellulare
o da vescicole intracellulari (endosomi)
TLRs (Toll-like receptors)
(Takeda and Akira, 2005)
CLRs (C-type lectin receptors)
(Huysamen and Brown, 2009)
Recettori del citosolo:
Possono riconoscere molecole
microbiche nel citosolo
NLR family (Nod-like receptor)
(Meylan et al., 2006)
RLRs (RIG-like helicases)
sensori del RNA
(Yoneyama and Fujita, 2007)
Sensori del DNA
Burckstummer et al., 2009; Fernandes-Alnemri et al. 2009;
Hornung et al., 2009, Roberts et al.,
2009, Takaoka et al., 2007)
Attivazione intracellulare dei NLRs:
sensori di bacteri, virus, segnali di pericolo
Meylan 2006
Struttura dei NLRs
N-terminal domain
Meylan 2006
C-terminal domain
(recognize microbial agents)
L’Inflammasoma: un complesso multiproteinico
Tipi d’inflammasoma:
NALP1
NALP3
NLRC4
NLR
Adapter
Caspase-1
NALP3
NATCH
Cardinal
PYD
CARD
Promuove la secrezione di IL-1b,
una citochina pro-infiammatoria
CARD
PYD
CARD
ASC
CARD
L’inflammasoma NALP3 è un sensore generale
di stress cellurare:
la fagocitosi di particole inerti risulta
nell danno al fagolisosoma
• Monosodio urato
• Asbestos
• Beta amiloide
– Proteina insolubile asociata all’Alzheimer
• Ossido di silicio («silica»)
• Pigmento malarico (emozoina)
Il ossido di silicio causa la
Silicosi
• E’ una malattia polmonare grave, irreversibile, noncurabile, dovuta alla’inalazione del silicio.
• E’ caratterizzata per una infiammazione acuta e
fibrosi polmorane irreversibile alterandone così la
capacità respiratoria (cioè l’intercambio di anidride
carbonica ed ossigeno).
Chest x-rays – silicosis
silicosis -- diffuse
normal x-ray
SiO2 attiva l’inflammasoma per la
produzione di IL-1b
(Hornung J Immunology 2008)
Se è silicio,
non è solo polvere!