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Rivista Italiana di Genetica e Immunologia Pediatrica - Italian Journal of Genetic and Pediatric Immunology
Anno II numero 1 - gennaio 2010 | direttore scientifico: Carmelo Salpietro - direttore responsabile: Giuseppe Micali
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Analisi molecolare dei toll-like gene receptors in pazienti affetti da β-talassemia
Molecular analysis of toll-like receptor gene in patients with β-thalassemia
Giuseppina Lo Giudice, Maria Amorini, Petronilla Romeo, Alessia Micalizzi, Francesca Pugliatti, Chiara Di Bella, Vincenzo Procopio, Valeria Ferraù,
Federica Sancetta, Vincenzo Salpietro, Simona Cara, Luciana Rigoli
Dipartimento di Scienze Pediatriche, UOC di Genetica ed Immunologia Pediatrica, Università degli studi di Messina
Abstract
In this study, we investigated the frequencies of TLR4 gene D299G and T399I
SNPs in a group of 70 Italian patients affected by beta-thalassemia.
Toll-like receptor 4 (TLR4) functions as the main receptor for
lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria.
After the recognition of pathogen-associated molecular patterns, the TLRs
activate signal transduction pathways of the innate immune response genes
including inflammatory cytokines and the NFκB signalling pathway.
The recently characterised D299G and T399I single nucleotide polymorphisms
(SNPs) of TLR4 gene are probably associated with impaired LPS signalling and
increased susceptibility to Gram negative infections.
We supposed a potential role of TLR4 gene mutations in developing of
microbial infections in patients affected by beta-thalassemia.
METHODS: Allele and genotype frequencies of TLR4 (D299G and T399I) SNPs
were examined in 70 thalassemic patients, and in 70 healthy controls.
RESULTS: In our study, we found no difference in the prevalence of these
mutations in thalassemic patients and controls (allele frequencies: D299Gcontrols 0, 08 %, TP 0, 04 %, P: ns; T399I-controls 0, 08 %, TP 0, 06 %, P : n.s.).
CONCLUSION: TLR4 D299G and T399I SNPs were not found to be associated
with increased susceptibility to microbial infections in our thalassemic
patients.
Introduzione
Il nostro gruppo di ricerca dell’U.O. C. Materno Infantile, Sezione di Genetica ed
Immunologia Pediatrica dell’AUO di Messina ha avviato una ricerca orientata alla
valutazione di eventuali mutazioni a carico dei Toll-like gene receptors (TLRs), geni
dell'immunità innata, in pazienti con beta-talassemia major. Lo scopo della ricerca è
quello di valutare nuovi difetti molecolari a carico del sistema immunitario del
paziente talassemico, che trovi in una alterazione genetica dei TLRs una possibile e
nuova chiave di lettura della suscettibilità alle infezioni microbiche che caratterizza il
paziente talassemico.
Le complicazioni infettive rappresentano la seconda causa comune di mortalità e
una causa principale della morbosità nella beta-talassemia. Oltre al possibile, anche
se ormai marginale rischio infettivo, conseguente alle periodiche emotrasfusioni, il
maggior rischio di episodi infettivi in questi pazienti sembrerebbe essere correlato ad
una coesistente alterazione immunitaria. Le anomalie a carico del sistema
immunitario sono state inoltre giudicate responsabili della maggior incidenza nella
beta-talassemia di neoplasie, in modo particolare di leucemia e linfomi, rispetto alla
popolazione sana.
Recenti studi condotti sulla competenza immunologica della beta-talassemia hanno
messo in evidenza diversi difetti quantitativi e funzionali che coinvolgono i linfociti B
e T, la sintesi delle immunoglobuline, i neutrofili ed i macrofagi, la chemotassi e la
fagocitosi, così come il sistema del complemento. Per quanto riguarda la patogenesi,
il sovraccarico marziale, complicanza primaria sia della talassemia in quanto tale, sia
della terapia trasfusionale, si pensa sia il principale meccanismo determinante, viste
le proprietà immunoregolatrici del ferro e delle relative proteine ferro-dipendenti; il
sovraccarico di ferro altererebbe quindi l’equilibrio del sistema immunitario dell’ospite
con conseguente predisposizioni alle infezioni microbiche. Altri fattori importanti nel
determinismo di questa particolare suscettibilità sono rappresentati dalle trasfusioni
multiple, connesse con stimolo allo-antigenico costante, e con la potenziale, ma
ormai quasi nulla, trasmissione di virus immunosopressivi; la splenectomia, con
conseguente aumentata predisposizione ad infezioni sostenute da batteri provvisti di
capsula; i bassi livelli di zinco, oligoelemento anche questo regolatore del sistema
immune; la terapia ferrochelante, che predispone a gravi infezioni, specie da
Yersinia; e la circolazione degli eritrociti “talassemici” natali anormali, costituenti uno
stimolo immune permanente. Quindi lo squilibrio immunitario del paziente
talassemico, coinvolge inizialmente l’immunità innata e successivamente quella
acquisita.
La famiglia dei TLRs è coinvolta in vari meccanismi dell’immunità innata; i TLRs
possiedono una struttura omologa al recettore Toll, identificato nella Drosophila
melanogaster. Nei mammiferi, sono stati isolati dieci TLRs, molti dei quali coinvolti
nella risposta a molecole di derivazione patogena (LPS, peptidoglicani, DNA
batterico). Le cellule dell’immunità innata riconoscono strutture molecolari
caratteristiche dei microorganismi patogeni che rappresentano un segnale di
pericolo. Un tipico esempio di questa interazione si realizza tra i microrganismi e la
famiglia dei TLRs presenti nei monociti e nelle cellule dendritiche. I TLR sono
presenti nel corso dell'evoluzione e sono stati, inizialmente identificati nei moscerini
dove svolgono un ruolo di protezione verso le infezioni da funghi. L'interazione
innata tra microbi e ospite non si limita solamente ai monociti ed alle cellule
dendritiche, ma riguarda anche i linfociti dell'immunità innata con recettore T
e
che riconoscono strutture molecolari di natura non proteica. TLR4 è
responsabile del riconoscimento del LPS, mentre TRL2 riconosce un grado
maggiore di promiscuità, riconoscendo diversi componenti di batteri gram positivi,
lieviti e micobatteri. TLR1 e TLR6 possono partecipare all'attivazione dei macrofagi
indotta da batteri Gram-positivi, mentre TLR9 sembra rispondere a specifiche
sequenze di DNA batterico.
Infine, per quanto riguarda l'immunità acquisita, i linfociti T e B riconoscono
sequenze proteiche specifiche estranee all’ospite e rappresentano il principale
bersaglio per l’induzione di una memoria immunologica che deve essere “costruita”
nel neonato. La via di trasduzione del segnale mediata dai TLRs dà luogo
all’attivazione di NFkB e alla successiva produzione di importanti mediatori
dell’immunità innata quali citochine e chemochine. Contemporaneamente, attraverso
l’induzione di molecole co-stimolatorie, il segnale Toll è coinvolto anche nella
risposta immunitaria adattativa.
Tra tutti i TLR genes abbiamo scelto di genotipizzare il TLR4.
Il Toll-like receptor-4 (TLR4) è necessario per il riconoscimento del lipopolisaccaride
(LPS) presente nei batteri Gram-negativi. Differenze individuali della risposta al LPS
avrebbero un ruolo nel determinismo della suscettibilità, gravità e prognosi delle
malattie infiammatorie.
Scopo della nostra ricerca è stato quello di indagare sulla presenza dei polimorfismi
Asp299Gly e Thr399Ile del gene TLR4 in pazienti talassemici, perché ipotizziamo
che tali mutazioni possano determinare una significativa alterazione della risposta
infiammatoria e quindi conferire una maggiore suscettibilità alle infezioni in pazienti
talassemici.
Materiali e metodi
Lo studio è stato effettuato presso l'Unità Operativa Complessa Materno Infantile,
sezione di Genetica ed Immunologia Pediatrica dell'Azienda Ospedaliera
Universitaria di Messina, su pazienti affetti da β-talassemia major afferenti al centro
di Microcitemia della suddetta Unità Operativa e su un gruppo di soggetti sani
(gruppo di controllo).
Sono stati selezionati 70 pazienti di età compresa fra i 3 ed i 50 anni affetti da
β-talassemia major. Il gruppo di controllo era costituito da 70 soggetti sani.
Il DNA è stato estratto da sangue periferico. La genotipizzazione per i polimorfismi
Asp299Gly (D299G) e Thr399Ile (T399I) del gene TLR4, è stata effettuata
utilizzando la metodica PCR-RFLP. I campioni di DNA, estratto da sangue periferico,
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sono stati amplificati tramite PCR e successivamente sottoposti a digestione
enzimatica con gli enzimi di restrizione BsaBI (TLR4Asp299Gly) e HinfI
(TLR4Thr399Ile). Dopo digestione enzimatica, i prodotti PCR sono stati sottoposti ad
elettroforesi per essere visualizzati. I primers specifici per l’amplificazione di ciascun
polimorfismo e gli enzimi di restrizione sono mostrati nella tabella 1.
L'analisi statistica è stata effettata tramite il programma STATA 9
Risultati
Nessuna differenza significativa è stata riscontrata tra la frequenza dell’allele 299Gly
nel gruppo dei pazienti affetti da β-talassemia major (4, 9 %) e la frequenza nel
gruppo di controllo (4, 8 %) (p=n.s.).
Il medesimo risultato è stato ottenuto per la frequenza dell’allele 399Ile (6, 3% nei
controlli, 6, 1% nei pazienti talassemici, p=n.s.).
Nessun soggetto omozigote per D299G o per T399I è stato individuato in questo
studio.
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Su 70 pazienti : 64 wild-type per D299G, 6 eterozigoti
Su 70 controlli : 65 wild-type per D299G e 5 eterozigoti
Su 70 pazienti: 65 wild-type per T399I e 5 eterozigoti
Su 70 controlli: 66 wild-type per T399I e 4 eterozigoti
Conclusioni
I dati del nostro studio non confermano l’ipotesi secondo la quale alcune mutazioni
del gene TLR4 possono determinare una significativa alterazione della risposta
infiammatoria e quindi conferire una maggiore suscettibilità alle infezioni in pazienti
talassemici.
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Sommario 18 pagine
Direttore scientifico
Trimestrale di divulgazione scientifica dell'Associazione Pediatrica di Immunologia e Genetica
Legge 7 marzo 2001, n. 62 - Registro della Stampa Tribunale di Messina n. 3/09 - 11 maggio 2009
Carmelo Salpietro - Direttore responsabile
Giuseppe Micali - Segreteria redazione
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Direzione-Redazione: UOC Genetica e Immunologia Pediatrica - AOU Policlicnico Messina
