FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human Podoplanin
Clone D2-40
Ready-to-Use
(Link)
Code IR072
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Podoplanin, Clone D2-40, Ready-to-Use (Link) è destinato per essere
utilizzato nell’immunoistochimica congiuntamente a strumenti Autostainer Link. Questo anticorpo marca la
podoplanina, marker endoteliale linfatico, in tessuti normali e neoplastici. L'anticorpo può essere utile per
l'identificazione dell'invasione linfatica di molti tumori (1, 2). L’interpretazione clinica di un’eventuale colorazione o
della sua assenza deve essere integrata mediante studi morfologici avvalendosi di controlli adeguati e deve
essere valutata nell’ambito dell’anamnesi del paziente e di altri test diagnostici da parte di un patologo qualificato.
Cenni
e spiegazioni
La podoplanina è una sialoglicoproteina transmembranosa "O-linked" da ~38 kDa che è espressa nell'endotelio
dei capillari linfatici, ma non nei vasi sanguigni (3). A parte l'espressione nell'endotelio linfatico, la podoplanina si
trova anche in vari altri tessuti, fra cui le cellule mesoteliali, le cellule reticolari, le cellule dendritiche follicolari, le
cellule germinali dei testicoli e ovariche (4). È anche stato dimostrato che l'anti-podoplanina reagisce con
l'endotelio linfatico mentre non reagisce con l'endotelio vascolare (1, 2). Nel tessuto neoplastico
l'immunocolorazione dell'endotelio linfatico da parte dell'anti-podoplanina si è dimostrata utile nell'identificare
l'invasione linfatica di tumori primari (1, 2). È stato dimostrato che l'uso congiunto dei marcatori calretinina e
podoplanina migliora la differenziazione del mesotelioma rispetto all'adenocarcinoma metastatico (5). È stato
anche dimostrato che la podoplanina è un marcatore utile per l'identificazione differenziale di seminomi e tumori
delle cellule dendritiche follicolari (6).
Fare riferimento alle General Instructions for Immunohistochemical Staining (Istruzioni generali per la colorazione
immunoistochimica) della Dako o alle istruzioni sul sistema di rilevazione per le procedure IHC per: (1) Principio
della procedura, (2) Materiali necessari ma non forniti, (3) Conservazione, (4) Preparazione dei campioni,
(5) Procedura per la colorazione, (6) Controllo della qualità, (7) Risoluzione dei problemi, (8) Interpretazione della
colorazione, (9) Limiti generali.
Reagente fornito
Anticorpo di topo monoclonale pronto per l’uso fornito in forma liquida in un tampone contenente la proteina
stabilizzante e 0,015 mol/L sodio azide.
Clone: D2-40 (7). Isotipo: IgG1, kappa.
Immunogeno
Tessuto disgerminoma (7).
Specificità
L'anti-podoplanina, Clone D2-40 è stato sperimentato applicando la tecnica di Western blot su lisati cellulari
provenienti da una serie di linee cellulari tumorali. L'anticorpo ha identificato una banda ~40 kDa negli
immunoblot di cellule HEY del carcinoma ovarico epiteliale e ha rivelato un peso molecolare leggermente
superiore nei blot di cellule MGH-U3. L'immunoreattività è stata osservata anche nei Western blot eseguiti su
cellule SK-OV-3 e Caov-3 del carcinoma ovarico epiteliale, cellule PA-1PA-1 del teratocarcinoma ovarico, cellule
Tera-1 e Tera-2 del teratocarcinoma testicolare, cellule 833 del carcinoma embrionale, cellule RT-4 del
carcinoma transizionale della vescica e cellule U-2 OS dell'osteosarcoma. Non è stata osservata alcuna reattività
nei Western blot eseguiti su linee cellulari tumorali provenienti da altri tipi di tumore (7).
L'effetto della digestione enzimatica sull'immunoreattività del clone D2-40 è stato studiato utilizzando un antigene
purificato di affinità da cellule HEY e cellule HEY intatte. I risultati ottenuti con i Western blot di antigene purificato
e con le cellule sottoposte a citometria a flusso dimostrano che l'immunoreattività non cambia se vengono rimossi
i residui di acido sialico trattando le cellule o la proteina con neuraminidasi. Il trattamento della proteina o delle
cellule con O-sialoglicoproteasi distrugge l'immunoreattività del clone D2-40, sia nella tecnica di Western blotting,
sia nella citometria a flusso. Ciò dimostra che l'antigene riconosciuto è una glicoproteina legata all'estremità O (7).
Precauzioni
1.
2.
3.
4.
5.
Conservazione
(118650-002)
Per uso professionale.
Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura.
Sebbene non sia classificato come prodotto pericoloso, la sodio azide alle concentrazioni indicate può
reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo
smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l’eventuale accumulo di azide
metallica.
Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
Conservare a 2–8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti sono conservati
in condizioni diverse da quelle specificate, le loro condizioni dovranno essere verificate dall'utente. Non sono stati
307710IT_002 p. 1/4
Specimen preparation
(Allestimento tessuto)
compresi i materiali
necessari ma non
forniti
osservati segni evidenti che suggeriscano l'instabilità di questo prodotto, pertanto è opportuno analizzare un
controllo positivo e un controllo negativo insieme ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione
imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un
probabile problema dell'anticorpo, contattare l'Assistenza Tecnica di Dako.
L’anticorpo può essere utilizzato per marcare sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina.
I campioni di tessuto devono essere tagliati in sezioni di approssimativamente 4 µm.
È necessario pretrattare con smascheramento termoindotto dell'epitopo (HIER, Heat-Induced Epitope Retrieval).
Si ottengono ottimi risultati pretrattando i tessuti con EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x),
(Link) (codice K8000/K8004).
Sezioni deparaffinate: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto deparaffinate fissate in formalina, incluse
in paraffina, utilizzando Dako PT Link (Codice PT100/PT101). Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link.
Attenersi alla procedura di pretrattamento delineata nel foglietto illustrativo di EnVision FLEX Target Retrieval
Solution, High pH (50x), (Link) (codice K8000/K8004). Per PT Link, bisogna attenersi ai seguenti parametri:
Temperatura di preriscaldamento: 65 °C, temperatura e tempo di recupero dell’epitopo: 97 °C per 20 (±1 ) minuti;
lasciare raffreddare a 65 °C. Rimuovere ogni rack p er vetrini Autostainer con i vetrini dal serbatoio PT Link e
immergere immediatamente i vetrini in un vaso/serbatoio (ad es., PT Link Rinse Station, Codice PT109)
contenente EnVision FLEX Wash Buffer (20x), (Link) (codice K8000) diluito, a temperatura ambiente. Lasciare i
vetrini nel Wash Buffer per 1-5 minuti.
Sezioni incluse in paraffina: come preparazione alternativa del campione, è possibile effettuare sia la
deparaffinazione che il recupero dell’epitopo in PT Link utilizzando una procedura modificata. Per le istruzioni,
fare riferimento alla Guida Utente PT Link. Una volta completata la procedura di colorazione, le sezioni devono
essere disidratate, diafanizzate e montate utilizzando un mezzo di montaggio permanente.
Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante il trattamento o nella successiva fase di colorazione
immunoistochimica. Per fare in modo che le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente al vetro dei vetrini, si
consiglia di utilizzare i Dako Silanized Slides (codice S3003).
Procedura per la
colorazione
compresi i materiali
necessari ma non
forniti
Il sistema di visualizzazione consigliato è EnVision FLEX, High pH, (Link) (Codice K8000). Il ciclo di colorazione
e i tempi di incubazione sono preimpostati nel software Autostainer Link. Per istruzioni dettagliate sul
caricamento di vetrini e reagenti, consultare la guida utente di Dako Autostainer Link. Se i protocolli non sono
disponibili sulla piattaforma Autostainer utilizzata, rivolgersi ai Servizi Tecnici Dako. Tutte le fasi di incubazione
devono svolgersi a temperatura ambiente.
Le condizioni ottimali possono variare a seconda del tipo di campione e del metodo di preparazione adottato,
pertanto dovranno essere definite autonomamente da ogni laboratorio. Se il patologo che effettua la valutazione
desidera una diversa intensità di colorazione, è possibile contattare un Esperto delle Applicazioni/Esperto dei
Servizi Tecnici di Dako per ricevere informazioni su come riprogrammare il protocollo. Verificare che l’esecuzione
del protocollo ritoccato sia ancora valida valutando che lo schema di colorazione sia identico allo schema di
colorazione descritto in “Caratteristiche prestazionali”.
Si consiglia la colorazione di contrasto in ematossilina utilizzando EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (codice
K8008). Si consiglia di usare un mezzo di montaggio permanente e non acquoso.
I controlli positivi e negativi devono essere analizzati contemporaneamente utilizzando lo stesso protocollo dei
campioni dei pazienti. Il tessuto di controllo positivo deve comprendere cellule dell'appendice e della tonsilla e le
cellule/strutture devono evidenziare gli schemi di reazione descritti per i tessuti in questione in “Caratteristiche
prestazionali” in tutti i campioni positivi. Il controllo negativo consigliato è FLEX Negative Control, Mouse (Link)
(Codice IR750).
Interpretazione dei
risultati della
colorazione
Il pattern di colorazione cellulare è di tipo citoplasmatico e membranoso.
Caratteristiche
prestazionali
Tessuti normali: l'anticorpo marca fortemente l'endotelio linfatico, le cellule gangliari e i nervi in molti tipi di tessuto
normale. Le cellule endoteliali vascolari sono risultate negative in tutti i tessuti normali (8).
(118650-002)
Tipo di tessuto (n. di campioni)
Elementi del tessuto con colorazione positiva
Surrene (3)
2/3 citoplasmi dei fibroblasti capsulari;
1/3 citoplasma dei fibroblasti interstiziali;
1/3 citoplasma dei linfociti pericapsulari
Appendice (11)
9/11 citoplasmi delle cellule endoteliali
Midollo osseo (3)
0/3
Cervelletto, cerebellum (3)
3/3 citoplasma dei neuropili
Cervello, cerebrum (3)
3/3 nuclei degli astrociti rari
Mammella (3)
3/3 citoplasma delle cellule mioepiteliali
Cervice (3)
3/3 membrane e/o citoplasma di cellule epiteliali basilari,
3/3 citoplasma dei fibroblasti stromali
Colon (3)
2/3 linfociti
Esofago (3)
1/3 citoplasma di cellule gangliari nel muscolo;
1/3 citoplasma dell'epitelio basilare
307710IT_002 p. 2/4
Cuore (3)
2/3 citoplasma dei miociti
Rene (3)
1/3 citoplasma dei fibroblasti pericapsulari
Fegato (3)
0/3
Polmone (3)
2/3 citoplasma delle cellule epiteliali bronchiali;
3/3 bordo citoplasmatico delle cellule alveolari
Cellule mesoteliali (3)
1/3 citoplasma delle cellule mesoteliali
Ovaio (3)
3/3 citoplasma delle cellule stromali ovariche;
1/3 citoplasma dell'epitelio superficiale delle cisti da inclusione
Pancreas (3)
2/3 citoplasmi dei fibroblasti periduttali;
1/3 citoplasma delle cellule mioepiteliali duttali
Paratiroide (3)
0/3
Nervo periferico (3)
2/3 citoplasma del perinevrio
Ipofisi (3)
1/3 citoplasma dei fibroblasti pericapsulari nella neuroipofisi; 1/3
citoplasma dei neuropili nella neuroipofisi
Prostata (3)
3/3 citoplasma delle cellule basali dei dotti;
3/3 citoplasma dei fibroblasti stromali
Ghiandola salivare (3)
3/3 citoplasma delle cellule mioepiteliali acinose e duttali
Muscolo scheletrico (3)
3/3 citoplasma del perimisio
Cute (3)
3/3 citoplasma delle cellule mioepiteliali di strutture annesse
Intestino tenue (3)
3/3 citoplasma del plesso mioenterico
Milza (3)
0/3
Stomaco (3)
3/3 citoplasma dei fibroblasti perighiandolari;
1/3 citoplasma del plesso mioenterico;
1/3 citoplasma e membrana dei linfociti del centro germinale
Testicolo (3/3)
3/3 citoplasma dei fibroblasti peritubulari
Timo (3)
3/3 citoplasma e membrana dei linfociti midollari
Tiroide (3)
0/3
Tonsilla (3)
3/3 citoplasma e membrana delle cellule epiteliali basilari e dei
linfociti del centro germinale
Utero (3)
3/3 citoplasma del miometrio;
1/3 citoplasma delle ghiandole endometriali
Tessuti patologici (2, 7):
Tipo di tessuto (n. di campioni)
Tessuto con colorazione positiva
Sarcoma di Kaposi (24):
stadio a macchie, a placche e a noduli
24/24
Linfangioma (10)
10/10 endotelio che riveste gli spazi sinusoidali
Angiosarcoma (7)
3/7
Leiomiosarcoma (10)
3/10
Dermatofibroma (6)
2/6
Istiocitoma fibroso maligno (2)
1/2
Emangioma (10)
0/10
Tumore glomico (3)
0/3
Angiolipoma (2)
0/2
Granuloma piogeno (2)
0/2
Malformazione vascolare (2)
0/2
Emangiopericitoma (1)
0/1
Emangioendotelioma (1)
0/1
Dermatofibrosarcoma protuberans (4)
0/4
Neurofibromi (6)
0/6
Tumori puri delle cellule germinali
Seminomi (35)
34/35
Carcinomi embrionali (5)
1/5
Teratoma immaturo e maturo (1)
0/1
Tumori misti delle cellule germinali
(118650-002)
307710IT_002 p. 3/4
Bibliografia
Seminomi (12)
12/12
Carcinomi embrionali (21)
17/21
Teratoma immaturo e maturo (16)
5/16
Tumore del sacco vitellino (4)
1/4
Coriocarcinoma (2)
0/2
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Kahn HJ, Marks A. A new monoclonal antibody, D2-40, for detection of lymphatic invasion in primary
tumors. Lab Invest 2002;82: 1255-7.
Kahn HJ, Bailey D, Marks A. Monoclonal antibody D2-40, a new marker of lymphatic endothelium, reacts
with Kaposi's sarcoma and a subset of angiosarcomas. Mod Pathol 2002; 15:434-40.
Breiteneder-Geleff S, Soleiman A, Kowalski H, Horvat R, Amann G, Kriehuber E, et al. Angiosarcomas
express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker
for lymphatic endothelium. Am J Pathol 1999; 154:385-94.
Kalof AN and Cooper K. D2-40 Immunohistochemistry – So Far! Adv Anat Pathol 2009; 16:62-4.
Chu AY, Litzky LA, Pasha TL, Acs G, Zhang PJ. Utility of D2-40, a novel mesothelial marker, in the
diagnosis of malignant mesothelioma, Mod Pathol 2005, 18:105-110.
Yu H, Gibson JA, Pinkus GS, Hornick JL. Podoplanin (D2-40) is a novel marker for follicular dendritic cell
tumors. Am J Clin Pathol 2007; 128:776-82.
Marks A, Sutherland DR, Bailey D, Iglesias J, Law J, Lei M, et al. Characterization and distribution of an
oncofetal antigen (M2A antigen) expressed on testicular germ cell tumours. Br J Cancer 1999; 80:569-78.
IHC003 Report On File
Edizione 07/12
(118650-002)
307710IT_002 p. 4/4
