PRODA
Istituto di Diagnostica Clinica
Sezione di Citogenetica e Genetica Molecolare
Responsabile: Dott. Guglielmo Sabbadini
Specialista in Genetica Medica
Pannello PRENATALE 2 offerto in service a richiesta
Oltre agli esami standard richiesti in diagnosi prenatale su richiesta degli interessati o del medico
specialista, è eseguito dal nostro Centro un pannello PRENATALE 2 dove sono offerti esami
molecolari realmente diagnostici.
Gli esami effettuati nel pannello PRENATALE 2 sono:
•
Analisi del cariotipo
•
dosaggio dell’AFP
•
QF-PCR su cellule di liquido amniotico (o FISH sui nuclei in interfase)
•
analisi molecolare per fibrosi cistica sui genitori
(ed eventualmente sul feto se un genitore, od entrambi, portatori)
•
analisi molecolare per sordità di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita sui
genitori (ed eventualmente sul feto se un genitore, od entrambi, portatori).
•
test diagnostico in gravidanza per la distrofia muscolare di Duchenne/Becker su feto
maschio
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Via D.G.M. Russolillo, 63 - 00138 Roma
tel. 06 88522772 – 06885227 - fax 06 88524574
e mail: [email protected]
•
Analisi del cariotipo
Risoluzione di almeno 400 bande, finalizzato alla ricerca di anomalie cromosomiche costituzionali
o acquisite, numeriche o strutturali e di eventuali anomalie cromosomiche in mosaico nei limiti di
risoluzione delle tecniche utilizzate. Metodi utilizzati: bandeggio standard (bandeggio G e/o R) e
con diverse tecniche di colorazione differenziale (C, AgNOR e Da-DAPI). Tempi di risposta 18gg.
Si garantisce a) una elevata accuratezza diagnostica (ci permette di essere diagnostici su mosaici
molto diluiti) b) una elevata risoluzione (ci permette di caratterizzare finemente la stragrande
maggioranza dei riarrangiamenti) c) presa in carico dei casi complessi.
•
QF-PCR su cellule di liquido amniotico (o FISH su nuclei in interfase)
Per l’esclusione rapida nel feto delle aneuplodie più frequenti (aneuploidie dei cromosomi 21,13,18
e dei cromosomi sessuali o, per la FISH, aneuploidie del cromosoma 21 e dei cromosomi sessuali).
La risposta preliminare sarà comunicata per via telefonica entro circa due giorni dal prelievo e
fornisce informazioni sul sesso e sulla eventuale presenza di aneuploidie dei cromosomi del sesso e
dei cromosomi 21,13,18. Tale esame ha valore solo indicativo in quanto l’interpretazione clinica del
risultato del test deve essere sempre eseguita unitamente all’analisi citogenetica standard.
•
Fibrosi cistica (FC)
Analisi delle 36 mutazioni FC più frequenti nella popolazione italiana. Metodo utilizzato: PCR e
ibridazione inversa non radioattiva (LiPA). Campioni biologici: DNA estratto da sangue periferico,
sangue da funicolo, liquido amniotico, villi coriali. Le mutazioni analizzate costituiscono il 73%
delle mutazioni presenti nella popolazione italiana.
Analisi molecolare per FC in gravidanza
Il test viene innanzitutto effettuato sulla coppia per valutare l’eventuale stato di portatore per
ognuno dei genitori (possibilmente effettuare il prelievo 10gg prima dell’esecuzione
dell’amniocentesi, ma in caso di impedimento il prelievo di sangue periferico nei genitori per
l’analisi molecolare FC può essere effettuato contemporaneamente al prelievo del liquido
amniotico); solo successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori di una
delle mutazioni ricercate, viene effettuata la diagnosi prenatale molecolare per FC (diagnosi di
malattia sul feto e diagnosi di esclusione).
In questi casi si ritiene opportuno informare la coppia sulle implicazioni del test. Vi è la
disponibilità a fornire in sede o nella struttura inviante la consulenza genetica.
Il consenso informato deve essere chiaro ed esaustivo (l’Istituto PRODA è disponibile a fornire un
fac-simile) e deve essere firmato da entrambi i coniugi.
Il referto viene fornito unitamente a quello del cariotipo fetale e di QF-PCR (o FISH).
Vantaggi del test di coppia per FC
a) test per una malattia ad elevato impatto sociale (la FC è considerata infatti la più diffusa malattia
genetica a prognosi severa) b) il test di screening di coppia è un test valido per tutte le future
gravidanze c) il test è altamente specifico ed ha una elevata sensibilità d) il test effettuato sui
genitori oltre che sul feto (se genitore portatore) permette di fornire un test realmente diagnostico e
di associare quindi un rischio specifico ad ogni test effettuato sul feto; si ha infatti maggiore
accuratezza diagnostica nel test fetale se sono stati testati anche i genitori (il test di esclusione fetale
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permette di escludere al 100% la malattia se è disponibile il genotipo dei genitori e di associare un
rischio specifico certo,1/200, nel caso di non esclusione)
•
Sordita’ di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita
Si esegue l’analisi per la ricerca della mutazione 35delG nel gene GJB2 (Connessina 26) al locus
DFNB1 sul braccio lungo del cromosoma 13; l’analisi per la ricerca della mutazione 35delG viene
condotta effettuando una reazione di amplificazione molecolare (PCR; Polymerase Chain Reaction)
di una parte della regione codificante del gene GJB2 e successiva digestione del prodotto PCR con
l’enzima di restrizione BseLI (BsiYI) (Strorm et al.,1999). Non vengono ricercate altre mutazioni
nel gene GJB2 o mutazioni in loci diversi responsabili di forme diverse di sordità non sindromica.
Analisi molecolare per sordità di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita in
gravidanza (mutazione 35delGnel gene GJB2)
Il test viene innanzitutto effettuato sulla coppia per valutare l’eventuale stato di portatore della
mutazione 35delG nel gene GJB2 per ognuno dei genitori (possibilmente effettuare il prelievo 10gg
prima dell’esecuzione dell’amniocentesi, ma in caso di impedimento il prelievo di sangue periferico
nei genitori per l’analisi molecolare per sordità di tipo neurosensoriale bilaterale profondo
congenita in gravidanza può essere effettuato contemporaneamente al prelievo del liquido
amniotico); se un genitore è positivo al test per la 35delG e l’altro negativo al test per la 35delG
viene effettuato un test ulteriore per la ricerca di 66 mutazioni sul genitore non portatore della
mutazione 35delG. (L’eventuale analisi per la ricerca di ulteriori 66 mutazioni nel gene viene
condotta effettuando una reazione di amplificazione molecolare di una parte della regione
codificante e non codificante del gene GJB2 e successiva analisi per sequenziamento automatico del
prodotto di PCR purificato; Zelante et al., 1997).
Solo successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori della mutazione
35delG (o di altra mutazione al medesimo locus), viene effettuata la diagnosi prenatale molecolare
per sordità di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita (diagnosi di malattia sul feto e
diagnosi di esclusione fetale).
In questi casi si ritiene opportuno informare la coppia sulle implicazioni del test. Vi è la
disponibilità a fornire in sede o nella struttura inviante la consulenza genetica.
Il consenso informato deve essere chiaro ed esaustivo (l’Istituto PRODA è disponibile a fornire un
fac-simile) e deve essere firmato da entrambi i coniugi.
Il referto per viene fornito unitamente a quello del cariotipo fetale e QF-PCR (o FISH).
Vantaggi del test di coppia per sordità di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita
in gravidanza
a) test per una malattia molto diffusa (le ipoacusie interessano il 4% della popolazione di età
inferiore ai 45aa, il 60% delle sordità è di origine genetica, il 70% di queste sono forme non
sindromiche) b) le forme recessive rappresentano l’80% dei casi di sordità non sindromica c) la
maggior parte delle famiglie recessive di origine caucasoide è associata al locus DFNB1
(connessina 26, locus GJB2) d) anche se sono state identificati 75 loci diversi responsabili di sordità
genetica non sindromica, la mutazione 35delG nel gene GJB2 si ritrova nella maggior parte dei
soggetti affetti da sordità ereditaria in Italia ed in tutto il bacino del Mediterraneo ed è in grado di
spiegare il 50% di tutte le sordità e) Il test di screening di coppia è un test valido per tutte le future
gravidanze f) il test è altamente specifico g) il test effettuato sui genitori oltre che sul feto (se
genitore portatore) permette di fornire un test realmente diagnostico e di associare quindi un rischio
specifico ad ogni test effettuato sul feto; si ha infatti maggiore accuratezza diagnostica nel test fetale
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se sono stati testati anche i genitori (il test di esclusione fetale permette di escludere al 100% la
malattia se è disponibile il genotipo dei genitori)
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Distrofia muscolare di Duchenne/Becker (DMD/BMD)
Il test consiste nella ricerca di eventuali delezioni intrageniche nel gene della distrofina responsabili
della distrofia muscolare di Duchenne/Becker su campione di DNA fetale estratto da liquido
amniotico. Il test consiste nella amplificazione simultanea di almeno 18 esoni nel gene della
distrofina (PM, 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 60) con oligonucleotidi
primers-specifici (Multiplexs PCR, secondo Chamberlain et al., 1988 e Beggs et al.,1990); questo
metodo consente di evidenziare più del 95% delle delezioni fino ad oggi individuate nel gene della
distrofina. Il test permette di accertare esclusivamente la eventuale presenza di delezioni
intrageniche specifiche (le mutazioni più frequenti); le delezioni sono responsabili del 65% circa dei
casi di DMD/BMD.
Analisi molecolare in gravidanza per DMD/BMD su feto maschio
Il test è effettuato solo in presenza di feto di sesso maschile. Se l’analisi molecolare su campione di
DNA fetale isolato da amniociti dovesse evidenziare la presenza di eventuali delezioni negli esoni
analizzati si ritiene opportuno informare la coppia sulle implicazioni del test. Vi è la disponibilità a
fornire in sede o nella struttura inviante la consulenza genetica.
Il consenso informato deve essere chiaro ed esaustivo (l’Istituto PRODA è disponibile a fornire un
fac-simile) e deve essere firmato da entrambi i coniugi.
Il referto viene fornito unitamente a quello del cariotipo fetale e QF-PCR (o FISH).
Vantaggi del test la ricerca di delezioni intrageniche nel gene della distrofina su feto maschio
a) test per una grave patologia degenerativa della muscolatura scheletrica b) il test permette di
evidenziare le nuove mutazioni delezionali che per questo gene si ritiene siano molto frequenti (1/3)
c) se è vero che il test non consente di evidenziare il 30-35% dei casi DMD/BMD dovuti a
mutazioni diverse dalla delezione (duplicazioni intrageniche, mutazioni puntiformi piccole
delezioni ed inserzioni non identificabili con il presente test ma con altri metodi), la sua sensibilità
è elevatissima (casi delezionali riconosciuti > 95%).
•
Consulenza Genetica
L’Istituto di Diagnostica Clinica Proda è disponibile ad offrire presso la propria struttura, su
richiesta degli interessati o del medico richiedente, un servizio di Consulenza Genetica.
Eventuali altri esami di genetica molecolare in diagnosi prenatale, anche complessi, sono eseguibili
presso il nostro Centro. Questi test sono offerti come test sulla coppia o nell’ambito di in uno studio
familiare come test realmente diagnostici (cioè devono avere una elevata specificità e sensibilità e
deve venire offerta tutta la gamma dei test molecolari potenzialmente eseguibili) solo in presenza di
indicazioni all’analisi (precedente caso di ritardo mentale o nelle donne con POF per la FRAXA) e
valutati all’interno di un colloquio con il Medico Specialista in Genetica Medica. Una attenta
anamnesi familiare in consulenza genetica consente di valutare malattie genetiche segreganti e di
offrire alla coppia i test genetici più appropriati e realmente utili in diagnosi prenatale. I test
molecolari diretti sul feto sono eseguiti solo se è stata individuata la mutazione su uno o entrambi i
genitori e solo come test realmente diagnostici (esempi: per la FRAXA è effettuato solo quando un
test sulla madre abbia evidenziato una premutazione o una fullmutation).
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