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LA DIAGNOSI PRENATALE NON INVASIVA PER LA DETERMINAZIONE DEL FATTORE RH E DEL SESSO FETALE
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F. Gerundino , C. Giachini , S. Frusconi , C. Pescucci , G. Marseglia , E. Pelo , F. Torricelli
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SOD Diagnostica Genetica, AOU Careggi, Firenze
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Scopo di questo lavoro è l’ottimizzazione di protocolli per la determinazione del:
1)fattore Rh fetale, al fine di sottoporre a immunoprofilassi anti-D solo le donne con feto RhD positivo;
2)sesso fetale nelle patologie X-linked, per effettuare la diagnosi prenatale invasiva solo nel caso di feto maschio. E’ previsto l’arruolamento di 100 donne in gravidanza a partire dall’ottava settimana di gestazione. L’analisi molecolare viene
eseguita sul DNAfetale circolante estratto da 400 ul di plasma materno (QIAamp® DSP Virus Kit). La determinazione
del fattore Rh consiste nell’amplificazionedell’esone 5 e 7 del gene RHD mediante Real-Time PCR (TaqMan). L’analisi
di questi due esoni permette di evitare il rischio di falsi risultati nei soggetti Rh negativi che non presentano la delezione
completa del gene RHD. Infatti, mentre nella popolazione caucasica la maggior parte dei soggetti Rh negativi presentano
la delezione completa del gene RHD, in altre popolazioni l’inattivazione del gene può essere determinata da delezioni parziali, mutazioni o riarrangiamenti. La determinazione del sesso fetale consiste nell’amplificazione dei geni SRY e DSY14.
Come controllo si utilizza la B-actina (controllo di PCR) e per l’analisi dell’RHD anche il gene DSY14 (controllo interno utile
solo in caso di feto maschio). Dal momento che entrambi i protocolli si basano sulla valutazione della presenza/assenza di
amplificato, la mancanza di un controllo interno specifico per il DNA fetale pone il dubbio, in caso di assenza di segnale di
amplificazioneper tutti i target in analisi (es. feto Rh negativo femmina), circa la presenza/quantità sufficiente di DNA fetale.
Pertanto, al fine di evitare falsi negativi, l’ottimizzazione di entrambi i protocolli prevede l’amplificazione del promotore del
gene RASSF1A, che risulta ipermetilato nel DNA fetale ed ipometilato nel DNA derivato dai leucociti. Questo consente,
mediante digestione enzimatica metilazione-sensibileseguita da Real-Time PCR specifica per RASSF1A, di ottenere un
segnale di amplificazione specifico per il DNA fetale, indice della presenza di target nel campione. In assenza di amplificazione del gene RASSF1A il protocollo prevede un nuovo prelievo di sangue in epoca gestazionale più avanzata.