Controllo dell’espressione genica
negli eucarioti
Differenze della regolazione
genica fra procarioti ed eucarioti
•
•
•
•
•
•
Dimensione e complessità del genoma
Compartimentazione del genoma
Organizzazione strutturale del genoma
Stabilità dell’mRNA
Modificazione post-traduzionale delle proteine
Turnover delle proteine
La regolazione dell’espressione genica
• Nei procarioti:
– un’espressione genica selettiva permette alle
cellule di risparmiare energia
– La regolazione avviene prevalentemente a
livello trascrizionale
• Negli eucarioti:
– l’espressione genica selettiva permette alle
cellule di svolgere ruoli specializzati
– La regolazione avviene a vari livelli
La regolazione dell’espressione genica negli eucarioti
ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE
CELLULE DIFFERENZIATE
Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo
genomico (~40000 geni)
L’espressione genica tessuto specifica determina il
fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali
In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare
momento dello sviluppo è attivo solo un sottoinsieme
di geni
Restrizione spaziale e temporale
dell’espressione genica
Geni housekeeping (costitutivi)
Geni con espressione ristretta nello spazio
• Espressione in più organi/tessuti diversi
Stesso ruolo in più tessuti
Il gene codifica per diverse isoforme (promotori alternativi e/o splicing
alternativo tessuto specifico)
• Espressione specifica per tessuto, linea o tipo cellulare
• Espressione solo in singole cellule
• Distribuzione intracellulare o extracellulare
Geni con espressione ristretta nel tempo
Stadio di sviluppo
Stadio di differenziamento
Momento del ciclo cellulare
Espressione inducibile da parte di fattori ambientali o extracellulari
Proteine che regolano la trascrizione
• Componenti del macchinario generale
RNA polimerasi e proteine necessarie per il
riconoscimento del promotore: 5 fattori generali
(TFIIB/D/E/F/H)
• Fattori di trascrizione
• Coattivatori e corepressori
stabiliscono interazioni proteina-proteina senza legarsi direttamente
al DNA
FATTORI DI TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI
( trans-acting factors = fattori che agiscono in trans )
Possono essere distinti in:
- Fattori generali
- Fattori a monte
attivatori
- Fattori inducibili
FATTORI DI TRASCRIZIONE
I fattori di trascrizione sono PROTEINE.
In generale, sono in grado di diffondere nelle cellule e
interagire con elementi bersaglio che si trovano in punti
specifici della molecola di DNA (“trans-acting factors”)
Hanno una struttura modulare composta da differenti
domini
• legame al DNA
• transattivazione
• dimerizzazione
• legame al ligando
Zinc
Finger
bZIP
Homeodomain
bHLH
Esempio di promotore eucariotico
“fattori generali” e “fattori a monte”
-100
-80
box (modulo)
sequenza
CAAT
GGCCAATCT
Fattori proteici CTF
che legano
-60
GC
GGGCGG
Sp1
-40
-20
TATA
TATAAA
Fattori
generali
(Pol II)
1
20
Gal4
Controllo combinatorio
Meccanismi molecolari del controllo
trascrizionale negli eucarioti
La concentrazione e l’attività di attivatori e repressori regolano la struttura della
cromatina (acetilazione-deacetilazione degli istoni – diverso posizionamento dei
nucleosomi) e l’assemblaggio del complesso di inizio
• Attivazione per reclutamento del complesso di trascrizione
• Attivazione per alterazione della struttura della cromatina
Attivazione per reclutamento del complesso di trascrizione
Le proteine regolative aiutano il reclutamento e l’assemblaggio del
complesso di inizio
Interazione con la RNApol mediata dal legame con altre proteine
• Attivazione
trascrizionale per
interazione diretta
TAF- fattori associati
alle TATA binding
protein (TBP)
• Attivazione
trascrizionale
mediata
Attivazione per alterazione della cromatina
Chromatin
modulation
proteins to
induce
transcription
Enzimi che regolano la struttura della cromatina
Histone modifiers, DNA metiltrasferasi e Chromatin
remodelers
Histone modifiers
Non alterano la posizione dei nucleosomi ma generano
segnali (histone code) che sono letti da vari fattori.
Chromatin remodelers
Utilizzano ATP per rimodellare la struttura cromatiana,
spostando I nucleosomi e rendendo leggibili sequenze di
DNA regolatorie
Agiscono come complessi multiproteici permettendo un
controllo fine sulla attività rimodellante
Modifiche covalenti degli istoni
Modifiche covalenti degli istoni
Modifiche covalenti degli istoni
Modifiche covalenti degli istoni
Modifiche apportate da specifici fattori proteici (writers) e rimosse da altri
specifici fattori proteici (erasers)
Le modifiche vengono lette da appositi fattori (readers)
Acetilazione e metilazione delle lisine delle code istoniche (H3 e H4) sono
coinvolte nel controllo e la regolazione della trascrizione
H4K16ac -> favorisce la trascrizione
H3K4me3 -> attivazione trascrizionale
H3K27me3 -> inattivazione trascrizionale
H3K9me-> inattivazione trascrizionale (eterocromatizzazione)
La fosforilazione degli istoni è coinvolta in altri processi nucleari
H2A.X (S139) -> riparo del DNA
H3 (S10) -> stabilità cromosomi e divisione cellulare
H2B (S14) -> apoptosi
Modifiche covalenti degli istoni
H4K16ac
H3K9me
RUOLO DELL’ACETILAZIONE ISTONICA
HAT
HDAC
•Decondensa la fibra da 30nm
•Favorisce l’accesso dei fattori di trascrizione sulla cromatina
•Agisce come segnale per il legame di proteine non istoniche
EFFETTI DELL’ACETILAZIONE ISTONICA
Regolazione della trascrizione
mediata dalla acetilazione
istonica
L’acetilazione istonica:
richiama ulteriori fattori proteici
attrae direttamente TFIID
Bromodominio = lega istoni acetilati
Cromodominio = lega istoni metilati
Acetilazione al promotore
Metilazione degli istoni
H3K4me3
H4K27me3
Diversi tipi di struttura di ordine superiore dipendono dalla
concentrazione locale e dalla combinazione di nucleosomi
modificati differenzialmente
In pratica le modificazioni istoniche servono a definire particolari
stati della cromatina.
Metilazione del DNA
Metilazione del DNA
La metilazione del DNA comporta l’aggiunta di un gruppo metile in posizione 5’ della citosina.
La metilazione avviene
a livello di regioni
ricche in CpG (CpG
island) che si trovano
spesso nei promotori.
La metilazione ha un
ruolo importante
nell’espressione genica
La 5-aza-citosina,
analogo della citosina
che non può essere
metilato, è utilizzato
nella terapia
anticancro
La DNA (5-citosina)-metiltransferasi (DNMT) è responsabile della metilazione alla
posizione C5 della citosina presente nelle isole CpG
Le DNMT sono costituite da un dominio C-terminale catalitico ed un dominio Nterminale regolativo.
La metilazione è mantenuta nel corso della divisione cellulare (DNMT1 e 2) o può
essere introdotta ex novo (DNMT3)
Metilazione del DNA
La metilazione del DNA è principalmente localizzata in regioni del genoma che
includono elementi ripetitivi e trasposoni.
Le CpG islands che si trovano nei promotori di geni housekeeping sono
ipometilate e quindi trascrizionalmente attive.
Alterazioni nel pattern di metilazione del DNA modificano il livelli di espressione
e la stabilità genomica modificando la struttura della cromatina.
La metilazione costituisce il principale sistema di riprogrammazione epigenetica
Ondate di metilazione ex novo e di demetilazione avvengono durante la
gametogenesi e durante lo sviluppo embrionale
La metilazione degli istoni è collegata allo stato di metilazione del DNA
circostante.
Metilazione e silenziamento
La metilazione del DNA generalmente inibisce l’espressione genica o direttamente
bloccando il legame di attivatori trascrizionali, o legando delle metil-CpG-binding
proteins che reclutano complessi co-repressori
Deacetilazione della cromatina
Transcriptional Silencing — X-chromosome Inactivation
5 me
3’..pGpCp..5’
5 me
5’..pCpGp..3’
MeCP2
transcriptional repressor
co-repressor Sin3
Histone Deacetylase
RPD3
+
5meC CpG – La metilazione del DNA è presente nei geni
repressi e nel cromosoma X-inattivo
5meC CpG – La metilazione è mantenuta durante la
replicazione grazie all’azione delle metilasi sul DNA emimetilato
5meC – La 5-metilcitosina nelle CpG è specificamente dal
repressore trascrizionale MeCP2 (MethylC-binding Protein-2)
MeCP2 a sua volta recluta Sin3 e RPD3 che possiede attività
istone-deacetilasi
+
CpG methylation
Hypo-acetylated repressed chromatin fiber
Metilazione e silenziamento
La metilazione H3K9 richiama HP1 che si lega attraverso il suo cromodomino e a
sua volta richiama la DNMT che metila le CpG portando alla inattivazione del DNA
Rimodellamento della cromatina
Regolazione della cromatina
Lo stato funzionale della cromatina è il risultato delle modificazioni
covalenti a carico di istoni e DNA che ne alterano il grado di condensazione
e quindi l’esposizione di sequenze di DNA a fattori proteici in grado di
legarsi in maniera specifica.
Un ulteriore meccanismo di controllo funzionale è rappresentato dalla
attività di specifici enzimi in grado di modificare il grado di condensazione
di regioni cromatiniche.
Fattori di rimodellamento
Fattori di rimodellamento
Fattori proteici che utilizzano ATP per riarrangiare l’organizzazione
nucleosomiale della cromatina
La famiglia più conosciuta è quella dei fattori Swi/Snf
Sono presenti diversi complessi di rimodellamento
• Legame a domini di attivazione e decondensano la regione
cromatinica
• Legame a domini di repressione e condensazione della regione
di cromatina
Rimodellamento della cromatina
Scivolamento dei nucleosomi: cambiamento della
posizione di un nucleosoma sul DNA
Nucleosomi rimodellati: il DNA diventa più accessibile
ma gli istoni rimangono attaccati
Spostamento dei nucleosomi: dissociazione completa di
DNA e istoni
Sostituzione di nucleosomi: sostituzione di un istone del
nucleosoma con una variante istonica
Rimodellamento della cromatina
Sostituzione di un istone con una variante
La variante istonica H2A.Z è molto presente nei geni
attivi adiacenti a regioni represse, impedendo la
diffusione della eterocromatina
Rimodellamento della cromatina
Modello two-step dell’azione chromatin
remodeling di SWI/SNF e RSC.
(A) Il complesso remodeling si lega alla cromatina
in maniera ATP indipendente
(B) L’aggiunta di ATP porta ad un cambiamento
conformazionale nel nucleosoma come
conseguenza di una alterazione nelle interazioni
istoni-DNA
(C) Questa alterazione porta al remodeling della
cromatina che può avvenire sia mentre il
complesso è legato o persistere dopo il suo
rilascio (da chiarire)
Il remodeling porta al trasferimento
dell’ottamero istonico su un differente segmento
di DNA (effetto trans) oppure allo slittamento
dell’ottamero su un tratto adiacente di DNA
(effetto cis)
La conseguenza del remodeling dipende dalla
posizione del nucleosoma nella regione
promotore e può portare sia ad attivazione che
repressione della trascrizione.
Rimodellamento della cromatina
Targeting del complesso SWI/SNF
I complessi di remodeling sono
diretti sui siti cromatinici attraverso
l’interazione con fattori trascrizionali
di regolazione.
Due modelli son possibili:
Il fattore si lega al DNA e funziona da
ancoraggio per il complesso di
remodeling
Il fattore si lega al complesso di
remodeling e favorisce la sua
interazione sito specifica con il DNA
Regolazione della cromatina
Targeting del complesso SWI/SNF
La metilazione dell’istone H3 (H3K27me3) operata dal complesso EZH2
(‘writer’) – PRC2 porta al silenziamento genico tramite il richiamo di DNA
metilasi DNMT) e istone deacetilasi (HDAC).
Il complesso PRC1 (complesso polycomb) riconosce il segnale H3K27me3
tramite i cromodomini della subunità polycomb (HPC).
Ordine di reclutamento dei complessi di modificazione
A: prima della formazione del complesso di preinizio
B: dopo la formazione del complesso di preinizio
Attivazione per rimodellamento della cromatina
Repressori
La trascrizione eucariotica è regolata da attivatori e repressori
I repressori sono funzionalmente inversi agli attivatori
Molti repressori sono costituiti da due domini:
un DNA-binding domain e un repressor domain
Meccanismo di azione dei repressori
Isolatori e enhancers
Gli elementi isolatori (boundary elements) aiutano a
coordinare la regolazione dell’espressione genica
Gli enhancer sono costituiti da sequenze specifiche che
regolano la trascrizione attraverso l'associazione con
diverse proteine.
Enhanceosoma
L’attivazione o la repressione trascrizionale è il risultato
dell’assemblaggio transiente di specifici complessi proteici che
possono portare sia al reclutamento della RNApolII sia a modifiche
della cromatina (modifiche istoni e DNA) e al suo rimodellamento
EPIGENETICA
Modificazioni del DNA e della cromatina che influenzano il
genoma e l’espressione genica senza alterare il DNA stesso
L’epigenoma determina se un gene è acceso o spento in ogni
singola cellula attraverso un segnale di espressione genica
L’epigenoma può essere ereditato per generazioni oppure
cambiare (plasticità dell’epigenoma)
Esempi di fenomeni epigenetici sono
• Inattivazione del cromosoma X
• Differenziamento cellulare
• Imprinting genomico
• Silenziamento dei trasposoni
IMPRINTING GENOMICO
Meccanismo epigenetico alla base dell’osservazione che l’attività di alcuni geni
dipende dalla loro origine parentale.
E’ causato da modificazioni della cromatina, come la metilazione delle C, che
alterano l’espressione di un gene ma non la sua sequenza
Riguarda un piccolo numero di geni (~80) che mantengono la memoria o impronta
della loro origine gametica e si esprimono in modo differenziale a seconda che siano
ereditati dal padre o dalla madre (espressione monoallelica).
Presente solo nei mammiferi (legato al benefici del maschio nel silenziare i propri
geni che conservano risorse materne a spese del feto e i benefici per la femmina nel
silenziare i prpri geni che attribuiscono risorse al feto a spese della madre)
L’imprinting è legato al silenziamento allele specifico di uno dei due segmenti
cromosomici parentali. Nel caso di un gene con imprinting materno è attivo l’allele
paterno e viceversa
L’imprinting è riprogrammato nella linea germinale attraverso demetilazione del DNA
e successiva metilazione specifica nelle cellule gametiche maschili e femminili
ICR = regioni di controllo dell’imprinting
Alterazione della struttura cromatinica a livello del
promotore
il silenziamento di UBE3A paterno
L’RNA antisenso
provoca
Espressione differenziale di un
trascritto di RNA antisenso
il silenziamento
di IGF2R paterno
CTCF si lega solo a a
ICR non metilate
agendo da isolatore e
bloccando l’effetto
dell’enhancher
(silenziamento IGF2
materno)
Blocco di un enhancer da parte
di un isolatore
Inattivazione del cromosoma X
L’antisenso Tsix bilancia XIST fino a che i
livelli di XIST non aumentano all’inizio del
differenziamento portando all’inattivazione
di uno dei due cromosoma X. L’altro resta
attivo grazie ai livelli di Tsix
Il trascritto non tradotto di XIST riveste il cromosoma X e richiama fattori
(esempio policomb) che modificano lo stato della cromatina (metilazione DNA e
H3, deacetilazione di H4, fattori di rimodellamento)
TRASPORTO NUCLEO-CITOPLASMA
Sequenze segnale
Import nucleare: -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-ValExport nucleare: -Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-IleImport nei mitocondri: +H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-ProAla-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-
Import nei peroxisomi: -Ser-Lys-Leu-COOImport nell’ER: +H3N-Met -Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Try-AlaThr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln-
Ritenzione ER: -Lys-Asp-Glu-Leu-COO-
TRASPORTO NUCLEARE
Il complesso del poro nucleare (NPC)
Ha una massa ~125 mDa nei vertebrati
Contiene circa 50 proteine differenti (nucleoporine)
e si estende nella duplice membrana del nuclear
envelope (NE) e funziona come canale per il
passaggio di molecole tra il citosol ed il nucleo
E’ costituito da un core anulare centrale a simmetria
ottagonale da cui si espandono fibrille di 50-100 nm
dirette verso il nucleoplasma ed il citoplasma
Il NPC è ancorato al NE mediante la lamina nucleare,
una struttura fibrosa dello spessore di 15 nm
costituita da lamine ed altre proteine, situata sotto
la membrana interna
Più del 50% delle nucleoporine contiene il motivo
ripetuto Phe-Gly (FG repeat)
I RECETTORI DEL TRASPORTO
Il trasporto nucleo-citoplasma avviene tramite il NPC
I cargo (proteine, RNA o entrambi) si legano a dei trasportatori sia direttamente
attraverso dei segnali di localizzazione nucleare (NLS) o di export nucleare (NES) sia
attraverso adattatori proteici.
NLS
Semplice (SV40)
Bipartito (Nucleoplasmin)
PKKKRKV
KRPAATKKAGQAKKKKKL
Specifici recettori dediti al trasporto riconoscono questi segnali (karyopherins,
PTACs, importins, transportins and Ran-binding proteins)
I recettori sono generalmente proteine acide che condividono la capacità di
legare componenti del NPC e contengono un dominio N-terminale RanGTPbinding ed un dominio C-terminale cargo-binding
In particolare, le proteine con un NLS semplice o bipartito sono trasportate con
la β-importin attraverso l’adattatore intermedio α-importin
RUOLO DI RAN
Ran è mantenuto come:
RanGTP nel nucleo
Ran GTP-GDP
exchange factor
(RanGEF o RCC1)
RanGDP nel citoplasma
RanGTPase activating
protein (RanGAP)
RanBP1 ed i domini BP1like delle fibrille
citosoliche del NPC
agiscono come coattivatori di RanGAP
Gli import receptors legano i cargo in maniera RanGTP-indipendente e rilasciano i
cargo in presenza di RanGTP, che è accumulato nel nucleo attraverso l’azione di
RanGEF.
In maniera opposta gli export receptors legano i cargo in presenza di RanGTP mentre
il rilascio dei cargo stessi richiede l’idrolisi del GTP da parte di Ran che si accumula
nel citosol come RanGDP. Quindi, l’idrolisi del GTP da parte di Ran permette
l’accumulo dei cargo nel nucleo o nel citosol contro un gradiente di concentrazione
Il ciclo di
Ran
Import-export nucleare
Import-export nucleare
Import-export
nucleare
Import adapters
Adattatori di trasporto:
Importin-: trasportatore Ran-dipentente
Importin-: riconosce NLS tramite ARM (armadillo repeat motif) e importin- tramite il dominio
IBB (importin- binding)
Snurportin: riconosce gli UsnRNPs (splicosomal ribonucleoproteins containing the UsnRNAs)
maturati nel citosol che presentano un m3G-cap assente nelle particelle immature (m7G-cap)
Alcune proteine (SREBP-2 e PTHrP) possono essere direttamente trasportate da importin-β senza
bisogno di un adattatore
Transportin: riconosce il segnale (M9) presente su molte RNA-binding proteins
TRASPORTO NUCLEARE
A) Nuclear import di RanGDP
mediato da NTF2
B) Nuclear import dei cargo
contenenti NLS mediante
l’eterodimero importin-α:importinβ (Imp-α Imp-β).
Non è rappresentato il nuclear
import mediato direttamente da
importin-β o altre proteine della
famiglia importin-β
C) Nuclear export che opera il
riciclo di importin-β (RanGTP
dipendente) e importin-α (CAS
dipendente)
D) Nuclear export dei cargo
contenenti NES mediato da Crm1.
RanGAP è ancorato al lato citosolico
del NPC mentre RanGEF è legato
alla cromatina
Nel modello sono rappresentati solo gli elementi essenziali, mentre i fattori
accessori non sono rappresentati
