STUDIO DELLE MODIFICAZIONI EMOPOIETICHE DI PAZIENTI MIELODISPLASTICA EPIGENETICHE IN CELLULE AFFETTI DA SINDROME RESPONSABILE DEL PROGETTO: Prof.ssa Valeria Santini Le sindromi mielodisplastiche (MDS) sono un gruppo eterogeneo di patologie caratterizzate da midollo displastico ed emopoiesi inefficace. Le modificazioni epigenetiche a livello del DNA e della cromatina regolano l’espressione genica senza alterare la sequenza del DNA e nelle MDS risultano alterate. Le modificazioni epigenetiche più frequentemente riscontrate sono la metilazione dei promotori genici e le modificazioni covalenti a carico degli istoni. La metilazione del DNA è una modificazione covalente in posizione 5’ della citosina dei nucleotidi CpG ed è catalizzata dalle DNA metiltransferasi (DNMT). In normali cellule differenziate le regioni CpG presenti all’interno del genoma risultano altamente metilate con conseguente inibizione della trascrizione dei geni a valle, mentre molte isole CpG (regioni cioè con un’alta concentrazione di nucleotidi CpG) dei promotori sono protette dalla metilazione (1) anche se la metilazione dei promotori è comunque il meccanismo fondamentale di silenziamento genico sia nell’inattivazione del cromosoma X e nel differenziamento cellulare tessuto specifico (2). Il meccanismo di silenziamento genico si verifica in quanto il DNA metilato recluta metil-binding domain protein (MBD) che formano un complesso co-repressore, insieme ad altre proteine come Istonedeacetilasi (HDAC) e istone-metiltransferasi, con conseguente blocco del processo di trascrizione (3). Nelle MDS questo fine meccanismo risulta alterato in quanto queste patologie sono tipicamente caratterizzate da una aberrante metilazione dei promotori genici con blocco della trascrizione di geni importanti per la differenziazione mieloide. Oltre alla metilazione del DNA, però, anche la configurazione della cromatina è fondamentale per una corretta espressione genica. L’acetilazione dell’istone H4 su lisina 16 (H4K16ac) e la trimetilazione dell’istone H3 su lisina 4 (H3K4me3) portano ad una struttura aperta della cromatina (eucromatina) e quindi accessibile ai fattori di trascrizione, mentre la di metilazione dell’istone H3 su lisina 9 (H3K9me2) e la trimetilazione dell’istone H3 su lisina 27 (H3K27me3) sono responsabili della chiusura della struttura cromatinica (eterocromatina) (4). Questi meccanismi sono altamente complessi e coinvolgono complessi enzimatici come il Policomb repressive complex 2 (PRC2) che comprende la subunità enzimatica EZH2, frequentemente mutata nelle MDS. Come già detto in precedenza, le mielodisplasie sono patologie molto complesse di cui ancora non è ben nota la causa genetica e il meccanismo biologico alla base della sua insorgenza. Dal momento che quello che si verifica è una non corretta emopoiesi a livello della linea mieloide, abbiamo pensato di concentrare il nostro studio sui fattori di trascrizione responsabili della normale emopoiesi, come PU-1,CEBPA, MPO e MLL. PU.1 gioca un importante ruolo durante il commissionamento della cellula staminale emopoietica verso la differenziazione granulocitica e monocitica. Questo gene può risultare mutato o la sua espressione o funzione bloccata nelle leucemia mieloide acuta (AML) ed è un candidato per l’inizio della leucemogenesi (5). CEBPA è uno dei più importanti fattori di trascrizione ed è stato visto che bassi livelli di questo gene si riscontravano in leucemie acute con anomalie cromosomiche. E’ stato inoltre dimostrato il suo ruolo nella maturazione e differenziamento mieloide (6). Il gene della mieloperossidasi (MPO) è espresso esclusivamente nelle cellule mieloidi immature e la sua espressione è down-regolata durante la maturazione mieloide. Uno studio ha dimostrato che, in pazienti con AML e MDS, questo gene risultava metilato in 50 loci portando ad una diminuzione della sua espressione (7). MLL è una istone metiltransferasi che metila specificamente l’istone H3K4 ed è essenziale per lo sviluppo della cellula emopoietica staminale e dei suoi progenitori.(8). Il nostro progetto avrà quindi l’obiettivo di analizzare l’assetto cromatinico,mediante la metodica della immunoprecipitazione della cromatina (ChIP),a livello di promotori genici critici per l’emopoiesi mieloide (PU-1,CEBPA, MPO e MLL) e di correlare tali risultati con le caratteristiche cliniche dei pazienti. Bibliografia (1) Illingworth RS, Bird AP. CpG islands–‘a rough guide.’ FEBS Lett 2009; 583:1713-1720 (2) Shen L, Kondo Y, Guo Y, Zhang J, Zhang L, Ahmed S, Shu J, Chen X, Waterland RA, Issa JP. Genome-wide profiling of DNA methylation reveals a class of normally methylated CpG island promoters. PLoS Genet 2007;3:2023-36 (3)Klose RJ, Bird AP. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators. Trends Biochem Sci. 2006;31:89-97 (4) Esteller M. Epigenetics in cancer. N Engl J Med. 2008; 358: 1148-1159 (5)D'Alò F, Di Ruscio A, Guidi F, Fabiani E, Greco M, Rumi C, et al. PU.1 and CEBPA expression in acute myeloid leukemia. Leuk Res 2008; 32(9):1448-53. (6) Yoshida H, Imamura T, Fujiki A, Hirashima Y, Miyachi M, Inukai T, Hosoi H. Posttranscriptional modulation of C/EBPA prompts monocytic differentiation and apoptosis in acute myelomonocytic leukaemia cells.Leuk Res 2012. (7) Lu¨bbert M, Miller CW, Koeffler HP. Changes of DNA methylation and chromatin structure in the human myeloperoxidase gene during myeloid differentiation. Blood 1991; 78: 345–356 (8) Ernst P, Fisher JK, Avery W, Wade S, Foy D, Korsmeyer SJ. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Dev Cell 2004; 6:437-443