Mappe fisiche a bassa risoluzione

Mappe fisiche
Si basano sulla localizzazione fisica delle molecole di DNA
Costruzione di una mappa fisica
fisica diversi metodi
- Mappe a bassa risoluzione
- Mappe ad alta risoluzione
Risoluzione= distanza a cui due punti devono trovarsi per poter essere
identificati come distinti
Mappe fisiche a bassa risoluzione (5-0.5Mb)
Mappatura citogenetica mediante:
bandeggio cromosomico
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
Mappatura per delezione
Mappatura mediante ibridi
Mappe citogenetiche mediante bandeggio
Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)
Ibridazione in situ con sonde marcate con diversi composti fluorescenti (ognuno emette
ad una specifica lunghezza d’onda). Il vetrino è esposto alle varie lunghezze d’onda in
maniera sequenziale generando al computer una “pittura cromosomica”
Su quale cromosoma risiede
un gene di interesse?
Mappatura per delezione
I geni sono assegnati ad un particolare cromosoma
l’associazione di un fenotipo con una delezione cromosomica
Incrocio tra un
individuo
omozigote per la
mutazione
recessiva ed un
individuo
eterozigote per
la delezione
mediante
Mappe fisiche ad alta risoluzione (100kb-1bp)
Mappe di restrizione
Mappatura mediante STS (Sequence Tagged Sites)
Sequenziamento del DNA
Mappa di restrizione
Uso di enzimi con siti di taglio rari
es. Not1 riconosce sequenza di 8 basi ricca in GC (meno frequenti sul genoma
umano)
Elettroforesi su gel dei frammenti ottenuti per stimarne le dimensioni RFLP
Mappe di restrizione (combinando risultati ottenuti con tagli di più enzimi
contemporaneamente)
Mappatura mediante siti a sequenza etichettata
(Sequence Tagged Sites o STS)
Le STS,
STS sono brevi segmenti unici di DNA di cui è nota sequenza e posizione sul
genoma landmark (pietra miliare)
STS
Sono lunghe circa 100-500 bp e sono identificabili mediante PCR
STS nel gene per
la proteina
ribosomale S3.
Le regioni
sottolineate
corrispondono ai
primers usati per
amplificarli
Sequenze utilizzabili come STS:
- una regione sequenziata casualmente e poi posizionata sul cromosoma
- una regione mappata geneticamente
- una sequenza trascritta
Mappa di cloni contigui (contig* map)
STEP 1 - collezione di frammenti clonati di DNA provenienti da un intero
cromosoma o parti di esso (genoteche totali o parziali).
STEP 2 – identificazione di cloni che hanno inserti di DNA che si
sovrappongono. Si cerca di ottenere un contiguo, ossia una serie di cloni
overlapping che coprano una intera regione cromosomica.
STEP 3 – I cloni ottenuti rappresentano la base di partenza per analisi piu'
dettagliate fino a livello di sequenza.
*Contig = serie ricostruita di più
più frammenti sovrapposti di DNA a formare un segmento continuo
Assemblaggio di un contig mediante sovrapposizione
delle mappe di restrizione dei singoli cloni
Clone 1
B
N
Clone 2
N
S
N
S
Clone 3
Clone 4
Contig
B = BamHI
N = NotI
S = SalI
X = XhoI
X
X
B
N
N
S
X
B
N
N
S
X
S
S
S
S
Assemblaggio di un contig mediante sovrapposizione delle
mappe di restrizione dei singoli cloni
Assemblaggio di un contig mediante sovrapposizione di STS
Assemblaggio di un contig mediante sovrapposizione
di sequenze dei singoli cloni
Chromosome
walking
Shotgun
approach
Chromosome walking
The shotgun DNA sequencing
Il DNA è frammentato e sequenziato. La sequenza è ricostruita confontando
sequenze overlapping.
Progetto genoma umano
Iniziato nel 1985
Febbraio 2001
Costruzione di una mappa genetica e fisica per il genoma
di uomo
cDNA sequencing (creazione di una banca di EST ovvero
Expression Sequence Tags)
Genomic shotgun sequencing
Utilizzo di sequenziatori automatici
Sequenziamento del genoma umano
Sequenziamento del genoma umano:
approccio gerarchico “clone by clone"
Libreria
Libreria con
con larghi
larghi
cromosomici.
cromosomici.
Cloni
CloniBAC
BAC~100-200
~100-200kb
kb
inserti
inserti
Costruzione
Costruzione didi una
una mappa
mappa fisica
fisica
del
del genoma,
genoma, selezione
selezione del
del numero
numero
minimo
minimo didi cloni
cloni per
per coprire
coprire ilil
genoma
genoma
casuale
ee
Frammentazione
Frammentazione
casuale
sequenziamento
sequenziamento shotgun
shotgun dei
dei
cloni.
cloni.
Assemblaggio
Assemblaggiodelle
dellesequenze
sequenze
Sequenziamento del genoma umano:
Approccio “globale” (Whole Genome Shotgun, WGS)
Libreria
Libreriashotgun:
shotgun:corti
cortiinserti
inserti
1.5-3
1.5-3kb
kb
Sequenziamento
Sequenziamentoshotgun
shotgundei
dei
cloni.
cloni.
Assemblaggio
Assemblaggiodelle
dellesequenze
sequenze
“clone by clone” vs WGS
Human Genome Consortium
Celera
Fisical map,
45.000 BAC
27.000.000
clones
individual BAC
sequencing
whole
sequencing
Assembly
Assembly
10 years
1 year
Organizzazione
Organizzazione del
del genoma
genoma umano
umano
Distribuzione della funzione genica dell’ 1,5% del
genoma umano (26.000 geni presunti)
Per quale ragione quasi la metà dei geni codificati dal
genoma umano attende ancora una funzione?
Come si assegna ad una sequenza la categoria di “gene”?
Complicazioni nell’identificazione dei geni codificanti
in genomi eucariotici
Come si assegna ad una sequenza la categoria di “gene”:
Un criterio, molto usato, è l’identificazione nella sequenza di una
Open Reading Frame (ORF)
se la sequenza viene trascritta
se è possibile “tradurre in vitro” la sequenza
se la sequenza del polipeptide è omologo ad un altro o se la
“presunta” funzione è in accordo con le caratteristiche del carattere
Expressed Sequence Tags
Come si studia la funzione di un prodotto genico?
genomica funzionale (lezione 19)
Il DNA ripetitivo può essere distinto in due categorie:
Ripetizioni intersperse: le cui unità sono distribuite nel genoma in
modo casuale e occupano il 44% del genoma (LINE, SINE, etc)
Sequenze ripetute in tandem: le cui unità sono disposte in serie
l’una vicina all’altra (DNA satellite, minisatellite, microsatellite)
Sequenze ripetute in tandem
DNA minisatellite: VNTR, Variable Number Tandem Repeats
Lunghezza della sequenza ripetuta: 15-100 bp
Numero di ripetizioni: da decine a migliaia di copie
Frequenza nel genoma: circa 100 loci in tutto il genoma umano
Localizzazione: sparse nel genoma
DNA microsatellite: STR, Short Tandem Repeats
Lunghezza della sequenza ripetuta : 2-6 bp
Numero di ripetizioni : 10-20
Frequenza nel genoma : circa 100mila loci, uno ogni 30000 bp
Localizzazione: sparse nel genoma
Derivano da errori nel processo di copiatura del genoma durante la divisione
cellulare e potrebbero essere prodotti inevitabili della replicazione del genoma
Ripetizioni intersperse
LINE*: Long Interspersed Elements, sequenze disperse
lunghe
Nel genoma umano sono presenti da 20000 a 40000 elementi
Ogni elemento può essere lungo da 1000 a 5000 bp
SINE*: Short Interspersed Elements, sequenze disperse
corte
Nel genoma umano sono presenti circa 500 mila elementi
Ogni elemento può essere lungo alcune centinaia di basi
Esempio: sequenze Alu (1,1 milioni di copie nel genoma)
Elementi LTR : Long Terminal Repeat
Retrotrasposoni con sequenze ripetute alle estremità
Transposoni a DNA
Sono tutte derivate da elementi trasponibili
* LINE e SINE sono retrotrasposoni non-LTR
Elementi trasponibili
Gli elementi trasponibili sono elementi autonomi di DNA parassita,
capaci di esistere solo all’interno di una cellula
Sono componenti normali ed ubiquitari dei procarioti ed eucarioti
Sono sequenze di DNA capaci di muoversi all’interno dei genomi
La trasposizione consiste in una ricombinazione non-omologa.
omologa
I trasposoni possono causare mutazioni geniche e cromosomiche
Trasposizione con
intermedi a DNA
a) replicativa
b) non replicativa
Trasposizione con
intermedi a RNA
Eucarioti e procarioti
Solo eucarioti
Organizzazione del genoma nucleare umano
Es. locus del recettore beta delle cellule T (chr 7) – 50Kb
Sequenze
:
Sequenzecodificanti
codificanti:
-- 22 segmenti
segmenti genici
genici codificanti
codificanti parte
parte
del
TcR
del TcR
-- 11gene
geneper
perililtripsinogeno
tripsinogeno
-- 11 pseudogene
pseudogene correlato
correlato alal
tripsinogeno
tripsinogeno
Esoni:
Esoni:1414bp
1414bp=2,8%
=2,8%del
deltotale
totale
52
(39%)didi44tipi:
tipi:
52sequenze
sequenzeripetute
ripetute(39%)
LINE
LINE
SINE
SINE
Trasposoni
Trasposoni
LTR
LTR
22 microsatelliti
microsatelliti
GAGAGA
…
ee
GAGAGA…
rispettivamente
rispettivamente
con
con ripetizioni
ripetizioni
TATTTATTTATT
…,
TATTTATTTATT…,
Circa
Circa ilil 50%
50% didi sequenze
sequenze non
non
geniche
,
di
funzione
ignota
geniche, di funzione ignota