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Il progetto genoma umano
Perché sequenziare il genoma umano?
• La disponibilità della sequenza rende più semplice
l’identificazione dei geni responsabili delle malattie
mendeliane
• Sequenza completa di tutti i geni
• Possibilità di determinare la struttura esoni-introni
• Mappare i geni e le altre sequenze
• Rivelare le regioni di controllo non codificanti
• Identificare polimorfismi
• Scoprire l’inatteso
Il progetto originale (1984): fasi
1. Ottenere una mappa genetica a bassa risoluzione (1987,
mappa con marcatori RFLP)
2. Ottenere una mappa genetica ad alta risoluzione (1994,
mappa con microsatelliti altamente polimorfici, risoluzione
1 cM)
Ricadute immediate: marcatori per il positional cloning e
per l’investigazione forense.
Il progetto originale (1984): fasi
3. Ottenere una mappa fisica a diversi livelli di risoluzione
4. Ottenere una sequenza con 99,99 % di accuratezza
DNA Genomico
Subclonaggio in vettori YAC, BAC, P1 o PAC e
assemblaggio di contigs con minimo di ridondanza
Subclonaggio in vettori da sequenziamento
Sequenziamento
Il progetto originale era fortemente condizionato dalla
difficoltà di sequenziare il DNA, e quindi dalla necessità
di ridurre al minimo il quantitativo di sequenze da
effettuare. Lo sviluppo di sequenziatori automatici
capaci di produrre 400000 basi/giorno ha largamente
superato qesto ostacolo.
Craig Venter
Francis Collins
Prima obiezione di Venter: perché sequenziare tutto
subito se la maggior parte di ciò che interessa sono le
sequenze codificanti?
Sequenziamento delle sole regioni esoniche
(Expressed Sequence Tags)
Picking singoli cloni
5’
Primer
Preparazione DNA
3’
Sequenziamento automatico
Deposito in banca dati (300-700 bp)
In questo modo Venter cominciò ad avere in mano un
quantitativo di sequenze geniche superiore a chiunque
altro prima di lui.
Quando tentò di brevettarle, il governo americano
decise che non si può brevettare una sequenza, ma solo
la conoscenza che si ha su di essa. Differenza tra
scoperta e invenzione.
Quindi per brevettare un gene è importante conoscerne
la funzione o almeno la potenziale rilevanza.
Sulla scia di Venter, anche il consorzio pubblico
cominciò a produrre valanghe di sequenze EST e ad
adottare massicciamente i nuovi sequenziatori
automatici.
Seconda obiezione di Venter: è possibile una strategia
alternativa per ottenere la sequenza completa?
Approccio whole genome shotgun
DNA Genomico
Frammenti casuali lunghi (5-20 kb) e corti (0.4-1.2 kb) derivanti
da rottura meccanica del DNA clonati in vettori da
sequenziamento
Sequenziamento automatico bidirezionale
Ricostruzione computerizzata della sequenza genomica
Sequenziamento del genoma di
Hemophilus Influenzae (1.8 Mb)
• 20000 frammenti di 1,6-2 kb
• 30000 saggi di sequenziamento
• 11,6 Mb di sequenza totale
• 30 ore per assemblare la sequenza su
un calcolatore con 512 Mb di RAM
Inizialmente si stimava che la sequenza sarebbe
stata completa nel 2005, poi nel 2003.
La combinazione dell’approccio del consorzio
pubblico con quello di Venter hanno portato alla
pubblicazione di due seqeunze (più o meno
indipendenti) nel 2000
Siccome le sequenze finali sono state ottenute
sovrapponendo la sequenza di individui diversi, è
stato possibile individuare un numero (milioni)
molto alto di polimorfismi di singoli nucleotidi
(SNPs).
---ATGTTGAAGTTCAAGAATGGTGTGCGGAAC-----ATGTTGAAGTTCAAGTATGGTGTGCGGAAC-----ATGTTGAAGTTCAAGCATGGTGTGCGGAAC-----ATGTTGAAGTTCAAGGATGGTGTGCGGAAC---
Marcatori ad altissima densità (1/1000 basi), che saranno
fondamentali per dissezionare i tratti complessi.
Non si può capire come è fatto il genoma umano e
come funzionano i nostri geni se non li confrontiamo
quelli dei principali organismi modello:
Gli altri progetti genoma
E. Coli
S. Cerevisiae
Drosophila Melanogaster
Caenorhabditis Elgans
Fugu
Danio Rerio (zebrafish)
Mus musculus
Rattus Norvegicus
Primati non umani
I meccanismi che controllano la riparazione del
DNA, importantissimi per comprendere la biologia
del cancro, sono conservati fino ai batteri.
I meccanismi che controllano la duplicazione del
DNA e le transizioni che accompagnano il ciclo
cellulare sono ben conservati fino ai lieviti.
I meccanismi che determinano l’impostazione del
piano di sviluppo corporeo sono sorprendentemente
simili negli insetti e nei mammiferi.
Conservazione evolutiva di intere vie biochimiche
EGF
EGF-R
Grb2
Solo il confronto con gli organismi modello
(genomica comparativa) ci permetterà di conoscere
cosa ci accomuna alle altre specie e le ragioni delle
nostre peculiarità.
Altre ricadute dei progetti genoma:
genomica funzionale (analisi del trascrittoma)
Applicazioni: studio delle basi molecolari del cancro
Analisi del proteoma mediante
spetrometria di massa