LEZIONI marzo cell biol1
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Genetica della Trasformazione Neoplastica per laurea magistrale in Biologia Cellulare e Molecolare e Scienze Biomediche 6 CFU- da 14 marzo a 3 giugno 2016 Lunedi 11-13 aula T7 Mercoledi 9-11 aula T7 [email protected] Metodologia di Esame: Prova scritta su 7 argomenti, con valutazione e ammissione all’orale sopra 18/30 Prova orale comprendente esposizione critica di un articolo proposto dal docente, scelto dallo studente, comunicato per e-mail al docente almeno due giorni prima dell’esame 1 http://www.facebook.com/pages/Genetica-MolecolareTorVergata/361032020588840? sk=wall&filter=12 Genes-Proteins: OMIM, GeneCards e tutte le banche dati collegate Phosphosite, Smart, MINT, Pathway: KEGG, Reactome, http://www.signaling-gateway.org Cell lines and genes: cancer genome project :http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/ 2 http://signor.uniroma2.it/index.jsp virus virus Le tre teorie: Virus, radiazioni, prodotti chimici 3 La natura del cancro Deriva da tessuti normali- Inizio monoclonale Avviene in cellule specializzate di tutti i tipi Il rischio di sviluppare un tumore è aumentato da molteplici cause esterne (incluso lo stile di vita) La genesi dei tumori è multistep Origine virale, origine chimica, origine fisica La teoria del cancro causato da irritazione: uno stile di vita, il chimney sweeper (lo spazzacamino) ed il Tar (catrame) cancer Più di 200 applicazioni di Catrame sull’orecchio di coniglio causarono carcinoma a cellule squamose Katsusaburo Yamagiwa, the first to prove chemical carcinogenesis 4 La maggior parte dei tumori richiede decine di anni per svilupparsi 3-metilcolantrene, benzopirene, dibenzantracene…. Figure 11.2 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Benzopirene è un procarcinogeno In tar, fumo, Carne in barbecue Lega la G (come aflatossine) Il citocromo 450 1A1 lo ossida a Benzopyrene7-8 epoxide Causa TRANSVERSIONE G >T 5 Danneggiamento di basi: Rottura del legame base-zucchero, Sito APURINICO, Blocco della replicazione, Apoptosi Aflatossina B1 Benzopirene Translesion DNA synthesis in the context of cancer research Philip A Knobel and Thomas M Marti Cancer Cell International 2011, 11:39 doi:10.1186/1475-2867-11-39 BenzoPyrene 6 Un soppressore dei tumori mutato da benzene P53 è trovata mutata nei tumori del polmone, in fumatori con una forte prevalenza di TRANSVERSIONI G=C to T=A P04637 - P53_HUMAN LUNG CANCER (Carcinoma) Small Cell Lung Cancer SCLC 20% (Smokers Cancer) Non Small Cell Lung Cancer NSCLC 80%: 1-Adenocarcinoma (Women, Bronchioalveolar) 40% 2- Squamous Cell Carcinoma/Epidermoid 30% 3- Large cell Carcinoma/Undifferentiated 10% 7 Le mutazioni più frequenti in tumore al polmone sono TRASVERSIONI, alcuni siti sono specifici The Mutagenic Signature of the carcinogen: GC to AT transversion in codon 157 e 158 in Lung (by benzene) High frequency of C->T transition at dipyrimidine sites in skin cancer (by UV irradiation) Transversion at codon 249 in liver cancer (by aflatoxin) 8 TEST di AMES : Test di Carcinogenicità/POTENZIALE MUTAGENICO DI UNA SOSTANZA Ceppi di Salmonella typhimurium auxotrofi per istidina I ceppi mutanti hanno frameshift o point mutations. Quindi revertono o con indel o point mutations Una sostanza che reverte a prototrofi, è capace di mutagenizzare, quindi è un carcinogeno Bruce Ames 1973 Carcinogens can function as mutagen - Bruce Ames 1975 procarcinogens Cytochrome P-450 in liver S9 fraction 9 Food andAgriculture Organizations data 2012 Carcinogenicità POTENZIALITA’ MUTAGENICA 10 I tumori sono crescite monoclonali 11 A tumor of the Ab-producing cells of the Bone marrow Linfociti B Il primo biomarcatore di tumori : Catena leggera (kappa o lambda) di un anticorpo scoperta da Henry BENCE-JONES nel 1847, marker tumorale del mieloma multiplo Una proteina di circa 25 kDa, presente nel sangue ed urine (perchè overespressa) che è prodotta da un clone di cellule B (origine monoclonale dei tumori) 12 Nomenclatura 80% Carcinoma= epithelial from ecto-meso-endoderm Squamous cell carcinoma= protective layers Adenocarcinoma= secretory epithelium 2% Sarcomas= mesenchymal-mesodermal origin (fibroblasti, adipociti (liposarcoma), osteoblasti, miociti (rabdomiosarcoma o leiomiosarcoma) Hematopoietic= circulatory and immune system (leukemia, lymphoma B /T, myeloid leukemia) Lymphomas= Linfociti B e T Neuroectodermal= nervous system (glioma, schwannoma) Classificazione non classica Melanomi da cresta neurale Small-cell lung Carcinoma con cellule di tipo neurosecretorie che rispondono a stimoli di signaling neuronale e sono di origine neuroectodermica o endodermica 13 Laboratory Inves.ga.on (2006) 86, 425–444. doi:10.1038; 2006 Func.onal facets of the pulmonary neuroendocrine system R Ilona Linnoila PULMONARY NEURO ENDOCRINE Cells MYC RB TP53 RAS ErbB2 EML4-ALK p16INK4a RARbeta RASSF1 14 Multistep tumorigenesis pathogenesis of carcinoma N:Neoplasia CIS: carcinoma In Situ Figure 11.7 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) PDAC Adenocarcinoma Duttale Pancreatico Il killer silenzioso Modello genetico di progressione dell’adenocarcinoma pancreatico. Ogni grado di PanIN Neoplasia Intraepiteliale Pancreatica, è caratterizzato da un distinto modello di processi molecolari che si attivano in seguito a presenza di irregolarità genetiche che colpiscono geni specifici (Bardeesy N et al., 2002). I gradi 1A, 1B, 2 e 3 rappresentano un crescente riscontro di atipie citologiche caratteristiche della cellula neoplastica 15 i) Cancer progression is fueled largely by genetic hits inflicted by mutagenic cancerogenesis, TUMOR INITIATOR ii) Nongenotoxic –nonmutagenic agents but toxic and mitogenic are Tumor Promoting Agents TPA that drive forwards multi-step tumorigenesis Cancer is a microevolutionary progress: cell divide and accumulate gene mutations over time Modello di neoplasia epiteliale: Carcinoma chimicamente indotto Topi trattati con: DMBA carcinogeno/mutageno (7,12 DiMethylBenzAnthracene) Produce mutazione missenso attivante in H-ras codon61 CAA->CTA nei cheratinociti ( TUMOR INITIATOR) TPA tumor promoter/proinflammatory (Phorbol 12-Tetradecanoate 13-Acetate, functional mimic of DAG):induce PKCalfa->IKK>NF-kB->TNFalfa, COX2, cycD1, BclxL Applicazioni multiple causano papillomi benigni e (raramente) Progrediscono a carcinomi squamosi, se avvengono ulteriori mutazioni in p53, INK4alfa/ARF) 16 Initiation- Promotion- ProgressionHuman “tumor promoters” often act through cytotoxic, mitogenic Mechanism and drive clonal expansion also through chronic inflamation Ex: Carcinoma Epatico indotto da infezione virale ( Epatite B)Carcinoma della colecisti indotto da infiammazione da calcoli formati da precipitatodi bileAspirina , sulindac e altri NSAID riducono incidenza di carcinomiHepatocellular carcinoma by hepatitis B chronic inflamationGall bladder carcinoma due to gallstones, precipitates from the bile- Many of the cell phenotypes conferred by the inflamation associated prostaglandins are uncanny similar to those conferred by oncogenes Loss of contact inhibition Ancorage independent growth proliferation 17 (Infezione cronica) IκB kinase (IKK) AKT IAP-1 Inhibitor of Apoptosis Bcl-Xl B-cell Lymphoma,extra large COX-2 cycloossigenase Proprietà delle cellule trasformate (tumorali): • morfologia alterata (metaplasia/displasia/anaplasia) • mancanza inibizione da contatto • (alterazioni ciclo cellulare e interazioni cellula-cellula) • crescita più rapida (alterazioni segnali di trasduzione) • richiedono meno/no siero (stimolazione autocrina/recettori) • crescita in agar (alterate interazioni cellula-matrice e cell-cell) • aneuploidia (numero cromosomi alterato) • Secrezione PROTEASI (digestione matrice extracellulare,metastasi) • Stimolazione NUOVA ANGIOGENESI • Alterati DIFFERENZIAMENTO e APOPTOSI 18 ADATTAMENTI REVERSIBILI: IPERTROFIA risulta da una aumentata produzione di proteine (spesso in tessuti che non si possono dividere, es. Miocardio, muscolo scheletrico) Sensori meccanici-à MAP kinase, JAK-STAT, PI3K/AKT= Ipertrofia fisiologica IGF1, TGFbeta, FGF—Recettori associati a proteine G= Ipertrofia patologica ,es Ipertrofia ventricolare sinistra in ipertesi Aumento Fattori di Trascrizione (miocardio: GATA4, NFAT, MEF2) Metaplasia/cambio di forma= Conversione fenotipica reversibile di un tipo cellulare in un altro avente la stessa differenziazione ONTOGENETICA , transdifferenziamento (infiammazioni croniche (fumo), polipi intestinali, esofago di Barrett) Displasia/forma anormale= Cambiamento reversibile nella proliferazione e crescita (esposizione a radiazioni, idrocarburi, virus (papilloma, verruca) Iperplasia/aumento di numero Fisiologica Compensatoria=Proliferazione di cellule con corredo genetico normale (cardiomiociti dopo infarto) Iperplasia Patologica= Proliferazione con corredo genetico Normale Neoplasia: Proliferazione di cellule con corredo genetico patologico Sono tumori maligni o benigni Anaplasia: Cellula indifferenziata 19 STEP BY STEP: Accumulo di alterazioni genetiche e progressione tumorale LOH Chr.5q LOH chr.18q K-RAS Epitelio Normale—---Iperplasia Aumento numero----Adenoma….Carcinoma Neoplasia---Metastasi Anaplasia Alternative genetic paths to Barrett’s esophagus Cellula squamosa esofago Figure 11.11b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) 20 Neoplasie Ogni tumore ha origine da cellule che hanno acquisito queste proprietà: Indipendenza da segnali di crescita esterni Evitare Apoptosi Insensibilità a fattori Antiproliferativi esterni Stimolo di Angiogenesi E neo-vascolarizzazione Invasione di altri tessuti Replicazione indefinita By Hanahan and Weinberg 21 Evasione del sistema immune Cambiamenti Metabolici Instabilità genomica e Mutazioni GOF/LOF Infiammazione Pro-tumore Cell 144, March 4, 2011 22 Cellule normali Cellule trasformate displasiche Regolazione della divisione cellulare da “inibizione da contatto” 23 Le cellule tumorali perdono la “inibizione da contatto” La inibizione da densità, cioè da consumo di fattori di crescita In plasma EGF: 1 nanogram/ml In serum and saliva: EGF 1-5 nanogram/ml In tears and sperm: 5-50 nanogram/ml IN BILE, URINE, MILK, PROSTATE FLUID: 50-500 NG/ML HeLa 35.000/65.000 EGFR / cell human uterine squamous carcinoma Keratinocytes 40.000 Fibroblast 70.000-150.000 COS-1 400.000 African Green Monkey SV40-tran. kidney fibroblast Hek293 <15000 Human Embrionic Kidney 24 caderine Integrine ECM Fibronectina= glicoproteina dimerica 2500aa; Collagene conferisce resistenza; Proteoglicani con glicosamminoglicani GAG glicosamminoglicani idrofilici, ialurano; Condroitinsolfato; Laminina; 25 INTEGRINE Legame fisico cellula-ECM e trasduzione segnali 26 Alfa7beta1 pax7 satellite Itga7 Itgb1à laminin Three main functions of integrins are: 1- Attachment of the cell to the ECM.(integrine, laminine…) 2- Signal transduction from the ECM to the cell 3- Facilitate motility Nature Genetics 17, 318 - 323 (1997) doi:10.1038/ng1197-318 Absence of integrin alpha7 causes a novel form of muscular dystrophy Ulrike Mayer, Klaus von der Mark ligands of integrins are fibronectin, vitronectin, collagen, and laminin. 27 Integrin Signaling:out-in Attacco a ECMQuindi : Sopravvivenza, Proliferazione OUTSIDE Signal transduction: ExtraCellularMatrix-integrineFAK-GRB2_SOS-RAS-ERK Inside the cell 28 ANOIKIS Integrin signal= Anchorage/RAS signaling ECMàIntegrins betaà FAK activation autophosphorylation à SRC docking and phosphorylation->PI3K, PLCgamma àSOS dockingàRAS activation-àERK No Integrin signal= No ECM attachment No growth, no division, programmed cell death ONCOGENIC RAS mimicks anchorage= Cells expressing Oncogenic RAS grow without attachment (ANCHORAGE INDEPENDENT GROWTH) Oncogenic RAS mimicks growth factor presence: Cells grow In low serum Figure 9. A model for FAK in invadopodia regulation A balance between tyrosine phosphorylation at focal adhesions and invadopodia is required for proper dynamics and cell migration Chan et al. J. Cell Biol. 2009:185:357-370 © 2009 Chan et.al. 29 When cancer cells can't let go Like a climber scaling a rock face, a migrating cancer cell has to keep a tight grip on the surface but also let go at the right moment to move ahead. The focal adhesion kinase, FAK, coordinates these processes to permit forward movement. Tyrosine phosphorylation of paxillin, FAK, and p130CAS: effects on cell spreading and migration Signaling in-out SHP2 30 SCAvenger Receptor Class A Member 5 Hepato Cellular Carcinoma Huang J, Zheng DL, Qin FS, Cheng N, Chen H, Wan BB et al. Genetic and epigenetic silencing of SCARA5 may contribute to human hepatocellular carcinoma by activating FAK signaling. J Clin Invest 2010; 120: 223–241 doi: 10.1172/JCI38012 . The calpains are a conserved family of cysteine proteinases (Calcium-dep) that catalyse the controlled proteolysis of many specific substrates. Calpain activity is implicated in several fundamental physiological processes, including cytoskeletal remodelling, MIGRATION, INVASION. Calpain expression is increased during tumorigenesis Turnover of Focal adhesions Enhancement of Membrane and matrix metalloproteinase Nature Reviews Cancer 11, 364-374 (May 2011) | doi:10.1038/nrc3050 Sarah J. Storr , Stewart G. Martin The calpain system and cancer 31 The transcription factor SNAILS is a Master EMT Regulator The scavenger receptor classA member5 is a tumor metastasis suppressor SNAILS----| SCARA5 -----| FAK SNAILS----| CADHERIN Epitelial Zinc finger protein Human lung carcinoma IN-OUT-IN 32 http://www.genome.jp/kegg/pathway/hsa/hsa04510.html * * Embriology Healing Immunity Metastasis 33 Chemiochine C3a, C5a Formilpeptidi 3 P-Selectin Glycoprotein Ligand 2 1 M1 TNFalfa IL-1B IL6 ROS 1 macrophage produceTNFalfa, interleukin-8, IL-1= leukocyte is attracted 2 Endothelial cells in blood vessels express E-selectin and display P-selectins 3 P-Selectin-Glycoprotein-Ligand bind at low affinity (Velcro like) 34 PECAM-1/CD31 HOMOPHILIC INTERACTION , JAM.1, CD99 DIAPEDESIS Switch of heterophilic interactions from Default low affinity (selectin) To high affinity (integrin) The leukocyte squeeze in ameboid fashion between tightly apposed endothelial cells: the point of no return 35 Vena Cava >>Polmoni Vena Porta> Fegato Carcinoma polmonare > metastasi cerebrali (carotidi) Carcinoma mammella > metastasi ossea (sistema venoso del Batson) Osteosarcoma > metastasi polmonare Tumore al colon > metastasi al fegato (vena Porta) 36 Come studio la migrazione? INVASION ASSAY Boyden Chamber Transwell Assay Count Cells under microscope and/or quantify after extraction Solution colorimetric (560nm) or Fluorescent (480nm) 37 Boyden Chamber Assay CytochalasinD Micotoxin that Inhibits actin polimerization Figure 1. Human Fibrosarcoma HT-1080 Cell Invasion. HT-1080 and NIH3T3 (negative control) were seeded at 300,000 cells/well and allowed to invade toward 10% FBS for 24 hrs in the presence or absence of 2 μM Cytochalasin D. Invasive cells on the bottom of the invasion membrane were stained (top panel picture) and quantified at OD 560nm after extraction (bottom panel figure). 38 Cell Migration CellProfiler cell Image analysis software 39 Fibroblasti embrionali di topo http://www.lgcpromochem.com/atcc/ 40 Un focus di fibroblasti embrionali di pollo indotto dal virus del sarcoma di Rous Focus Assay per perdita di inibizione da contatto Test di Trasformazione cellulare Test di formazione di foci (Harry Rubin e Howard Temin, 1958): foci di cellule addensate e morfologicamente alterate. Test basato sulla perdita di inibizione da contatto su fibroblasti embrionali di topo BALB/c 3T3 Crescita in agar: Le cellule trasformate non debbono attaccarsi ad Una superficie solida prima di potersi dividere. Test basato sulla Indipendenza da legame integrine-matrice extracellulare Ridotta richiesta di siero: richiedono meno del 5% di siero. Basato su attivazione di segnali di proliferazione e capacità autocrine 41 Crescita senza supporto Mammosfere : tumor stem cells 42 Mammospheres 1st generation MCF7 p9 Ctrl Metformin 10 mM Inhibition of Notch???? 100 micron diameter These ‘tumor stem cells’ share the properties of self-renewal and differentiation with their normal stem cell counterparts, although in tumors these processes are deregulated. Only a minority of cells in human cancers are capable of self renewal. 100 cells Epitelial, Myoep., Alveolar Differenziazione cellulare Differenziazione strutturale 43 Test di Trasformazione cellulare Test di formazione di foci (Harry Rubin e Howard Temin, 1958): foci di cellule addensate e morfologicamente alterate. Test basato sulla perdita di inibizione da contatto su fibroblasti BALB/c 3T3 Crescita in agar: Le cellule trasformate non hanno bisogno di attaccarsi ad una superficie solida prima di potersi dividere. Test basato sulla Indipendenza da legame integrine-matrice extracellulare Ridotta richiesta di siero: richiedono meno del 5% di siero. Basato su attivazione di segnali di proliferazione (RAS) e capacità autocrine Omofiliche -Calcio I 4 tipi di Molecole di carboidrati Adesione Cell-cell Eterofiliche -Calcio Molecole adesione cell-cell 44 AJ Caderina-Actina DS Cad-filamenti intermedi Integrine- filamenti intermedi The integrity of the cadherin-catenin complex is negatively regulated by phosphorylation of betacatenin by receptor tyrosine kinases (RTKs) and cytoplasmic tyrosine kinases (Fer, Fyn, Yes, and Src), which leads to dissociation of the cadherin-catenin complex giunzioni serrate (tight junction) , Recettori per fattori di crescita: TGFβRI e II, IGF-1R, EGFR, c-Met Claudina occludina F-actina giunzioni aderenti (adherens junctions) 0 p12 E-caderina β cat. α cat. cat. ulin vin c a F-actina 45 46 Importanza delle caderine Nei tumori diminuiscono per varie cause: Mutazioni LOF Overespressione di fattori che le destabilizzano Overespressione di repressori trascrizionali Soppressione epigenetica della espressione Degradazione da proteasi CADH1=E cadherin chr.16q22 30 mutazioni germinali in tumori, OMIM 192090 UniProtKB: P12830 882AA : 25/30 mutazioni inattivanti- 5/30 sono missense 47 La E-caderina è un TSG: Le mutazioni sono distribuite lungo tutto il gene Le mutazioni sono missense, non sense, splicing, frame shift 60% dei tumori presenta mutazioni in CDH1, insieme con concomitante perdita dell’allele wt. Spesso si riscontra perdita delle caderine per attivazione di proteasi da influsso di calcio (intracellulare), caspase3 o gamma-secretase. Oppure metallo proteasi di matrice Mol Cell Biol. 2007 May;27(10):3804-16. Epub 2007 Mar 12.Casein kinase 1 is a novel negative regulator of E-cadherin-based cell-cell contacts.Dupre-Crochet S, Figueroa A, Hogan C, Ferber EC, Bialucha CU, Adams J, Richardson EC, Fujita Y. E-CADERINA P12830 S846D IC261 CK1 casein kinase Fosforila S846 Phosphorylated S846 E-CADH has weaker interaction with beta-catenin 48 MYC, CyclinD Le caderine prevengono la localizzazione nucleare della Beta-catenina Giunzioni Aderenti A road to cancer : tightly regulated self renewal system subverted in cancer Wingless in Drosophila and int-1 in mouse (Insertion of Mammary Tumor Virus) WNT1 protooncogene 370 AA- 12 genes in homo sapienssecreted lipid-modified signaling glycoproteins (350–400 aa) 49 Nusse R, van Ooyen A, Cox D, Fung YK, Varmus H (1984). "Mode of proviral activation of a putative mammary oncogene (int-1) on mouse chromosome 15". Nature 307 (5947): 131–6. doi: 10.1038/307131a0. PMID 6318122. Nüsslein-Volhard C, Wieschaus E (October 1980). "Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila". Nature 287 (5785): 795–801. doi:10.1038/287795a0. PMID 6776413 1995 Nobel Price Christiane Eric 19x Giunzioni Aderenti Glycogen synthase kinase 50 Lipoprotein Receptor Related Protein. LRP Casein Kinase CK-1 Glycogen Synthase Kinase GSK Adenomatous Polyposis Coli APC Beta-Transducin Repeat Containing Protein Co-repressors CONCENTRATIONS total Dsh total APC total TCF total GSK3 total axin total β-catenin free phosphorylated β-catenin 10 milioni di molecole / cellula 100 nM 100 nM 15 nM 50 nM 0.02 nM 35 nM 1 nM DISSOCIATION CONSTANTS binding of GSK3 to (APC.axin) binding of APC to axin binding of β-catenin to (APC.axin.GSK) binding of β-catenin to TCF binding of β-catenin to APC 10 nM 50 nM 120 nM 30 nM 1200 nM FLUXES degradation flux of β-catenin via the proteasome Share of degradation of β-catenin via unphosphorylated form CHARACTERISTIC TIMES Half life beta –catenin : 20 minutes—2 HOURS phosphorylation/dephosphorylation of APC and axin GSK3 association/dissociation Axin degradation 25 nM/h 1.5 % 2.5 min 1 min 6 min 51 P35222 (CTNNB1) Catenin beta-1 Ser 45 priming site (by CK1,2 CaseinKinase ) , Sà F, P in hepatocellular carcinoma Ser 23, 29, 33, 37 phosphorylated by GSK3beta, targets to Proteosomal degradation Mutated in several cancers “PGE2 prostaglandins activate Wnt” suggests that chronic inflammation-related increase of PGE2 may lead to activation of Wnt pathway in different tissues, resulting in carcinogenesis.[3] Target gene of catenin: Overexpression of MYC is implicated in the etiology of a variety of hematopoietic tumors. A chromosomal aberration involving MYC may be a cause of a form of B-cell chronic lymphocytic leukemia. Translocation t(8;12)(q24;q22) with BTG1. Chromosomal aberrations involving MYC are usually found in Burkitt lymphoma. Translocations t(8;14), t(8;22) or t(2;8) which juxtapose MYC to one of the heavy or light chain immunoglobulin gene loci. Transcription factor that binds DNA in a non-specific manner, yet also specifically recognizes the core sequence 5'CAC[GA]TG-3'. Activates the transcription of growth-related genes. DESTRUCTION COMPLEX Machinery for Beta-catenin proteolysis CTNNB1 Fbox S-phase Kinase Cullina 52 BETA-TRCP: The WD40 repeat (also known as the WD or betatransducin repeat) is a short structural motif of approximately 40 amino acids, often terminating in a tryptophan-aspartic acid (W-D) dipeptide. Tandem copies of these repeats typically fold together to form a type of circular solenoid protein domain called the WD40 domain. beta TRCP is a F-box protein that constitutes one of the four subunits of ubiquitin protein ligase complex called SCFs (Skp1 Sphase Kinase-Cul1 Cullin-F-box protein) WNT pathway nell’adesione,proliferazione, mantenimento stato indifferenziato Se l’attività di GSK-3beta è inibita dall’attivazione della via di WNT o se APC non funziona (come nel cancro del colon), la betacatenina non viene fosforilata e si accumula ad alti livelli nel citoplasma (emivita di 2 ore). La beta-catenina trasloca nel nucleo dove lega i fattori di trascrizione T-cell factor/Lymphoid enhancing factor TCF/ LEF1 modulando insieme ad essi l’espressione di geni implicati nella proliferazione cellulare e nella progressione tumorale. http://www.stanford.edu/~rnusse/pathways/targets.html 53 WNT signal S45 CREB binding protein Q92793 54 GSK3 Binding protein Casein kinase Half life from 20 minutes to 2hrs D1 cyclin GSK modulates Cyclin D at transcriptional and post translational levels Myc, Jun 55 Planar Cell Polarity Signaling controls cell polarity and movement during development RhoA (Ras Homologue memberA) requires DVL (dishevelled) and a formin homology protein called Daam1 (Dishevelled Associated Activator of Morphogenesis 1) RhoA activates ROCK 56 Cellule tumorali non hanno inibizione da contatto S45 57 Mancanza di E-caderina a: E-caderina b: beta-catenina c: DAPI Beta-cell carcinoma Da Rat Ins-promoter Sv40 antigentransgenic mouse COSMIC catalogue of Somatic Mutations in cancers Carcinoma , small intestine COSMIC 58 2012 GENI MUTATI APC CDH1 CDKN2A CDKN2a(p14) CTNNB1 KRAS MLH1 NF1 NF2 PI3KCA PTEN RB1 SMAD4 SMARCa4 TP53 CDH1 Cadherin trovato mutato, ma in introne e non in coding sequence In omozigosi. Quindi, le caderine subiscono downregolazione E, meno spesso, mutazioni Meccanismi Down-regulation caderine (e.g.,maintenance of embryonic mesoderm, EMT) • Regolazione trascrizionale: - repressori trascrizionali come le proteine Snail, Slug e SIP1 e il fattore di trascrizione E12/ E47 legano le box E2 nel promotore del gene della E-caderina reprimendone l’espressione. 5’CACCTG CACCTG 59 Meccanismi down-regulation caderine • Inibizione proteica: - la dysadherin (FXYDQ96DB9) è una glicoproteina di membrana che regola negativamente i livelli proteici della E-caderina, senza colpire l’m-RNA. - Questo meccanismo induce sperimentalmente metastasi. • Fosforilazione della tirosina: - EGFR, c-MET (HGFR), FGFR e SRC possono fosforilare E-caderina, N-caderina, alfa-catenina, beta-catenina e p120-catenina portando al disassemblamento del CCC (Cytoplasmic Cell Adhesion Complex) e alla distruzione dell’adesione cellulare. • PTP1B fosfatase lega N-caderina e promuove legame con catenina Meccanismi Down-regulation caderine • Degradazione : - Hakai (una E3-ligasi) si lega specificatamente alla E-caderina fosforilata sulla tirosina e la ubiquitina. La E-caderina viene marcata per la degradazione tramite il proteosoma. Inibitori del proteosoma vengono utilizzati come chemoterapici antitumorali (PATENT Chiron Corporation) 60 Meccanismi Down-regulation caderine • Epigenetica: Ipermetilazione: in seguito ad inattivazione trascrizionale, il gene della Ecaderina è epigeneticamente silenziato da ipermetilazione che porta a un’ulteriore regolazione negativa dell’espressione della E-caderina. • Degradazione proteolitica: le metalloproteasi di matrice (MMPs) degradano la Ecaderina dando origine a una proteina ridotta di 80 KDa che promuove l’invasione tumorale regolando positivamente le MMPs. Swissprot entry P12830 CADH1 882AA • TISSUE SPECIFICITY: Non-neural epithelial tissues.•PTM: During apoptosis or with calcium influx, cleaved by a membrane-bound metalloproteinase (ADAM10), PS1/gamma-secretase and caspase-3 to produce fragments of about 38 kDa (E-CAD/CTF1), 33 kDa (E-CAD/ CTF2) and 29 kDa (E-CAD/CTF3), respectively. Processing by the metalloproteinase, induced by calcium influx, causes disruption of cell-cell adhesion and the subsequent release of beta-catenin into the cytoplasm. The residual membrane-tethered cleavage product is rapidly degraded via an intracellular proteolytic pathway. DISEASE: Defects in CDH1 are involved in dysfunction of the cell-cell adhesion system, triggering cancer invasion (gastric, breast, ovary, endometrium and thyroid), metastasis and cause of hereditary diffuse gastric cancer (HDGC) [MIM:137215]. Defects in CDH1 are a cause of susceptibility to endometrial cancer [MIM:608089] 61 EPIGENETICA : IPERMETILAZIONE e Spegnimento delle Caderine Reprimere la trascrizione: la metilazione del DNA • La metilazione nei vertebrati avviene esclusivamente sui residui di C nel dinucleotide CpG • Le sequenze CpG sono sotto-rappresentate nel genoma (probabilmente per la tendenza • della 5-metilcitosina a venire deaminata e mutata in T) -> ma presente nei promotori • dei geni dove causa repressione della trascrizione 62 CpG ISLANDS (CGI) • Short sequences (1000 base pairs (bp) long) rich in GC and CpG • Predominantly NON METHYLATED • Most, perhaps all, CGIs are sites of transcription initiation CpG islands and the regulation of transcription Aimée M. Deaton and Adrian Bird PROMOTORI con normale quantità di CpG sono solitamente attivi la metilazione non partecipa normalmente a regolare la trascrizione di geni i cui promotori sono ricchi di CpG PROMOTORI IMPOVERITI di CpG la cui attivazione è controllata dalla metilazione; la metilazione delle CpG blocca l’accesso sul promotore del complesso di attivazione trascrizionale la metilazione delle CpG aiuta il reclutamento di complessi proteici che fungono da inibitori della trascrizione “HISTONE CODE”: ü LA METILAZIONE DEL RESIDUO DI Lys9 H3 E’ ASSOCIATA ALLA CROMATINA TRASCRIZIONALMENTE INATTIVA tale processo è coinvolto nello stabilire i siti del DNA che devono essere metilati; ü LA METILAZIONE DEL RESIDUO DI Lys4 H3 E’ ASSOCIATA ALLA CROMATINA TRASCRIZIONALMENTE ATTIVA 63 • In cellule non embrionali, 80% dei CpG sono metilati, ad eccezione delle isole CpG dei promotori • Le DNA metil-transferasi (Dnmt) hanno particolare affinità per le sequenze emi-metilate: tendono quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo metilato-> mantenimento del pattern di metilazione (modificazione epigenetica - memoria cellulare) Metilazione e regolazione genica da codice istonico: Dnmt metilano il DNA = modificazione epigenetica Il DNA metilato non e’ efficientemente legato da attivatori trascrizionali ma viene legato da proteine che legano metilcitosine (MeCP2, MBD1-4) e repressori trascrizionali Questi a loro volta sono in grado di reclutare diversi HDAC deacetilasi di istoni > repressione della trascrizione. Anche alcune Dnmt reclutano HDACs e viceversa 64 Transcription La metilazione è regolata durante lo sviluppo: Parental imprints derived from gametogenesis are retained faithfully in the zygote as well as some other marks. However, others are reprogrammed dynamically to meet the need of becoming totipotent 65 Figure 2 Imprint life cycle. Philippe Arnaud Reproduction 2010;140:411-423 © 2010 Society for Reproduction and Fertility Reprod Biol Endocrinol. 2009; 7: 59. Published online 2009 Jun 5. doi: 10.1186/1477-7827-7-59 66 Le principali funzioni della metilazione sono collegate alla repressione della trascrizione: • Difesa contro i trasposoni: la metilazione e’ fondamentale per mantenere silenti i genomi dei trasposoni e dei retrotrasposoni. Ad esempio : LINE1 è controllato da metilazione e proteine ADAR Che bloccano il complesso RNA:proteine che retrotrasportano mRNA al nucleo • Regolazione genica: la metilazione contribuisce a stabilire e mantenere uno stato trascrizionalmente inattivo (eterocromatina) • Imprinting parentale: emizigosi da metilazione • Quindi la metilazione del DNA rappresenta un meccanismo di memoria cellulare, che non puo’ dare inizio al silenziamento genico ma che lo individua, propaga e rafforza: • Metil-DNA…> Transcriptional repressor..> Histone Deacetylase..> silenziamento genico 67 68 EPIGENETICA e TUMORI Blocco del differenziamento Leucemia Promielocitica Eliminazione dell’isolamento fra loop di geni ad attività coordinata Glioblastoma multiforme AML è molto eterogeneo, caraMerizzato da un aumento (>20%) di cellule ematopoie.che immature che proliferano (mieloblas.) nel midollo o nel sangue senza differenziare. Meccanismi Patogene.ci: Geni di Classe1 MIELOPROLIFERAZIONE: Sono inizialmente coinvol. geni codifican. protein-­‐.rosina chinasi o GTPasi, che causano crescita incontrollata in presenza di mutazioni in geni che bloccano apoptosi (Flt3, N-­‐RAS, Kit, cABL, JAK2) Geni di Classe2 BLOCCO DEL DIFFERENZIAMENTO : Even. PRECOCI che coinvolgono I faMori di trascrizione muta. o trasloca. (AML-­‐ETO, PML-­‐RARalfa) o altre proteine che governano il differenziamento (NPM1 nucleolar, ubiquitarious phosphoprotein, CEBPA faMore di trascrizione che blocca abvazione dei granuloci. ) che spesso presentano mutazioni 69 LEUCEMIA PROMIELOCITICA ACUTA (Acute promyelocy.c leukemia) t(15;17) (q22;q12); PML-­‐RARalfa Prognosi favorevole. TraMabile con ATRA (All-­‐Trans Re.noid Acid 10exp-­‐6 M) che induce il differenziamento terminale dei blas. CaraMerizato dal riarrangiamento PML-­‐ RARalfa (Re.noic Acid Receptor alfa)-­‐ La cellula di origine è “commiMed” verso granuloci. e monoci. (non precursori di megacarioci. o eritroblas.) . Successivamente, quando il tumore occupa troppo posto , anche anemia e trombocitopenia sono rileva. PML si concentra nei PML-­‐NB Nuclear Bodies, è ubiquitario ed espresso a bassi livelli Ha un RING (Really Interes.ng New Gene)Zinc-­‐finger DOMAIN Ha un dominio di Protein-­‐protein interac.on al C-­‐terminale con il quale forma mul.meri 70 -Tumore da blocco del differenziamentoAcute Promyelocytic Leukemia t(15;17)(q22;q21) Traslocazione Reciproca di RARalfa (Retinoid Acid Receptor,, Cromosoma 17) e PML (Promyelocytic Leukemia, chr.15) Questa nuova proteina chimerica lega il DNA, aumenta L’interazione fra HDAC (deacetilasi istoniche) e NCOR (Nuclear Corepressor) ed impedisce la trascrizione dei geni Del differenziamento. Leucopenia Coagulopatia Diagnosi al microscopio Cura urgente FAGGOT CELLS Metilazione e regolazione genica: APL Acute Promyelocytic Leukemia • Il pattern di metilazione dei geni è alterato nelle cellule tumorali, e metilazione alle isole CpG di certi geni è associata al loro silenziamento specifico • es. The fusion oncoprotein PML-RAR Retinoic Acid Receptor, come proteina chimerica da traslocazione t(15;17), lega il promotore del gene Retinoic Acid receptor β e causa il reclutamento di DNMT -> metilazione -> MBD -> HDAC> deacetilazione> inattivazione trascrizionale gene Differenziation= acido retinoico ATRA RARbeta---> APL Blocco HDAC= TSA tricostatin, sodio valproato Acute Promyelocytic leukemia ( 10% ) 5-azacitidina non metilabile • Accumulo Leucociti immaturi • Diminuzione piastrine e rossi 71 PML and PML-NBs: hubs of a proapoptotic transcriptional network Le cellule con PML-RARalfa NON vanno in apoptosi nè se indotte da TNFalfa , nè per mancanza di siero (serum starvation) De-­‐SUMOYLATION CBP/p300 Acetyl Transferase PML aumenta l’abvità e la stabilità Di P53 e la Apoptosis –p53 e nucleo dipendente 72 Death-associated protein 6 FAS, TGFbeta induced APOPTOSIS desumoyla.on Titra.on of DAXX By PML: to inhibit transcrip.on of an.-­‐apipto.c genes Possible model of DAXXPML cooperation in the induction of apoptosis LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE con traslocazioni e mutazioni di geni che codificano faMori di trascrizione del differenziamento ematopoie.co, la cui perdita di funzione risulta in blocco del differenziamento e proliferazione di blas. immaturi AML-­‐associated chromosome aberra.ons open affect the components of the core binding factor (CBF) complex, i.e., RUNX1 (CBFA2, AML1) and core-­‐binding factor, beta subunit (CBFB) proteins. RUNX1/AML1(chr.21) Runt-­‐related transcrip.on factor 1/core factor subunit alfa ( RUNX1-­‐RUNX1T1 fusion) (AML1-­‐ETO) t(8;21) the fusion protein AML1-­‐ETO (Histone deacetylase)= BLOCCO DEL DIFFERENZIAMENTO. Non sono trascrib I geni C-­‐FMS (CSF1R— colony s.mula.ng factor 1 receptor), P14ARF (CDKN2A— cyclin-­‐dependent kinase inhibitor 2A) and CEBPA CBFB (chr.16) Core-­‐binding factor, beta subunit: allosteric agent per il legame al DNA di alfa factor RUNX1 (CBFB-­‐MYH11 miosina heavy-­‐chain t16;16) 73 EPIGENETICA e TUMORI Blocco del differenziamento Leucemia Promielocitica Eliminazione dell’isolamento fra loop di geni ad attività coordinata Glioblastoma multiforme IDH1mutato Mutazioni nel gene che codifica per ISOCITRATE DEHYDROGENASE I sono associate al glioblastoma multiforme PRIMARIO 74 GBM SECONDARIO: I pazien. IDH1 muta. Mostrano migliore sopravvivenza Prima ipotesi IDH1 Isocitrate dehydrogenase wt= Citrate -àalfa ketoglutarate C5H6O5 IDH1 mutant = Citrate -à C5H8O5 ----| TET enzyme TET enzyme removes METHYL group from DNA If IDH1 is mutated, TET is inhibited, DNA is hypermethylated (CpG metilator phenotype), TSG are silenced Ipotesi non accettata perchè in questi tumori il cambio di metilazione non correla con un forte cambio di espressione genica (trascrittoma e esoma) 75 Seconda Ipotesi In addition to promoters, gene expression is regulated by the 3D structure of TOPOLOGICAL ASSOCIATED DOMAINS (TAD). - IDH1 mutato blocca TET ( che non demetila più efficientemente) - Alcuni siti CCCTC per legare CTCF sono metilati - Se sono metilati, CTCF NON si lega. CTCF è una proteina “Insulator”, - Se non si lega I TAD non sono più isolati - Singoli ONCOGENI VENGONO IPERATTIVATI DA ENHANCER situati IN ALTRI TAD Cancer: Oncogene brought into the loop Matthew R. Grimmer & Joseph F. Costello Nature 529, 34–35 (07 January 2016) doi:10.1038/nature16330 TAD PGFGRA 900.000 basi TAD Topological Associated Domain,within which gene activity is Coordinated 76 Imprinting • Espressione Genica dipendente dall’origine Parentale dell’allele. • L’allele imprinted è spento. 77 Chr 11 imprinted region Embryonal Rabdo Myo Sarcoma • ERMS hanno perdita di chr 11p15.5 di origine materna • I geni imprinted in 11: IGF2 espressione paterna (maternally imprinted), • H19 e p57KIP2 espressione Materna (Paternally imprinted TSG ) • The imprining of p57KIP is leaky • Amplificazione di MYCn 78 l’iperme.lazione di questa regione in entrambi i cromosomi, che porta inevitabilmente ad una sovraespressione di Igf2 , è stata osservata in diversi .pi di tumori maligni. Erasure of imprin.ng: H19 high –interagisce con histone methyl transferasi EZH2 (polycomb repressor of transcrip.on) -­‐-­‐à Low espression of NKD1 Naked cu.cle1 ( passive antagonist of Wnt that blocks beta-­‐catenin). In glioblastoma mul.forme o tumori alla vescica , H19 è molto espresso perchè la me.lazione è bassa . Gli Rhabdomiosarcomi ERMS umani che hanno perdita chr 11 p15.5 materno, perdono l’espressione di H19 e p57KIP2 (sono TSG paternally imprinted): Loss of imprin.ng: L’iperme.lazione di questa regione in entrambi i cromosomi, che porta inevitabilmente ad una sovraespressione di Igf2 , è stata osservata in diversi .pi di tumori maligni. 79 The Increasing Complexity of the Oncofetal H19 Gene Locus: Functional Dissection and Therapeutic Intervention Imad Matouk 1,2,*, Eli Raveh 1, Patricia Ohana 1, Rasha Abu Lail 1, Eitan Gershtain 1, Michal Gilon 1, Nathan De Groot 1, Abraham Czerniak 3 and Abraham Hochberg 1 H19 spinge alla staminalità E crescita incontrollata ( GBM) SMAD an.-­‐differen.a.on 80 H19 è espresso abbondantemente in tesuti embrionali e represso dopo la nascita. Rimane espresso nel muscolo scheletrico (eRMS). miR675-3p ; miR675-5p --------| SMAD antidifferentiation transcription factor for bone Paxillin-dependent regulation of IGF2 and H19 gene cluster expression J. Cell Sci. August 15, 2015 128: 3106-3116 81 82 Modificazioni epigenetiche, trascrizione e ambiente • In quanto reversibili, i cambiamenti epigenetici possono essere modificati dall’ambiente • Sia ipo- che iper-metilazione sono stati associati all’invecchiamento (perdita generica di metilazione, ipermetilazione di geni specifici: silenziamento di soppressori tumorali?) • Vitamine quali l’acido folico (vit.B9), che sono importanti per l’attività degli enzimi che forniscono gruppi metilici, hanno effetti notevoli sull’incidenza di tumori (cancro al colon) • Dieta scarsa in folati -> instabilità genomica e ipometilazione • Dieta scarsa di gruppi metilici -> cancro del fegato, e ipometilazione+sovraespressione di oncogeni (c-ras, c-myc, c-fos) 83 T308 S473 MAFbx:Muscle Atrophy F-Box MURF1: Muscle Ring Finger1 LC3:microtubule associated Light Chain3 ( essential for autophagy, with BCL2/ adenovirus E1B Interacting Protein 3, BNIP3 84 85
