Genetica della Trasformazione Neoplastica per laurea magistrale in
Biologia Cellulare e Molecolare e Scienze Biomediche
6 CFU- da 14 marzo a 3 giugno 2016
Lunedi 11-13 aula T7
Mercoledi 9-11 aula T7
[email protected]
Metodologia di Esame:
Prova scritta su 7 argomenti, con valutazione e ammissione all’orale sopra
18/30
Prova orale comprendente esposizione critica di un articolo proposto dal
docente, scelto dallo studente, comunicato per e-mail al docente almeno due
giorni prima dell’esame
1
http://www.facebook.com/pages/Genetica-MolecolareTorVergata/361032020588840?
sk=wall&filter=12
Genes-Proteins: OMIM, GeneCards e tutte le banche dati collegate
Phosphosite, Smart, MINT,
Pathway: KEGG, Reactome, http://www.signaling-gateway.org
Cell lines and genes:
cancer genome project :http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/
2
http://signor.uniroma2.it/index.jsp
virus
virus
Le tre teorie: Virus, radiazioni, prodotti chimici
3
La natura del cancro
Deriva da tessuti normali- Inizio monoclonale
Avviene in cellule specializzate di tutti i tipi
Il rischio di sviluppare un tumore è aumentato da molteplici cause
esterne (incluso lo stile di vita)
La genesi dei tumori è multistep
Origine virale, origine chimica, origine fisica
La teoria del cancro causato da irritazione: uno stile di vita, il
chimney sweeper (lo spazzacamino) ed il Tar (catrame) cancer
Più di 200 applicazioni di
Catrame sull’orecchio di
coniglio
causarono carcinoma a
cellule squamose
Katsusaburo Yamagiwa,
the first to prove
chemical carcinogenesis
4
La maggior parte dei tumori richiede decine di anni per svilupparsi
3-metilcolantrene, benzopirene, dibenzantracene….
Figure 11.2 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Benzopirene è
un procarcinogeno
In tar, fumo,
Carne in barbecue
Lega la G
(come aflatossine)
Il citocromo 450
1A1 lo ossida a
Benzopyrene7-8
epoxide
Causa TRANSVERSIONE
G >T
5
Danneggiamento di basi: Rottura del legame base-zucchero,
Sito APURINICO, Blocco della replicazione, Apoptosi
Aflatossina B1
Benzopirene
Translesion DNA synthesis in the context of cancer research
Philip A Knobel and Thomas M Marti
Cancer Cell International 2011, 11:39 doi:10.1186/1475-2867-11-39
BenzoPyrene
6
Un soppressore dei tumori mutato da benzene
P53 è trovata mutata nei tumori del polmone,
in fumatori con una forte prevalenza di
TRANSVERSIONI G=C to T=A
P04637 - P53_HUMAN
LUNG CANCER (Carcinoma)
Small Cell Lung Cancer SCLC 20% (Smokers Cancer)
Non Small Cell Lung Cancer NSCLC 80%:
1-Adenocarcinoma (Women, Bronchioalveolar) 40%
2- Squamous Cell Carcinoma/Epidermoid 30%
3- Large cell Carcinoma/Undifferentiated 10%
7
Le mutazioni più frequenti in tumore al polmone sono
TRASVERSIONI, alcuni siti sono specifici
The Mutagenic Signature of the carcinogen:
GC to AT transversion in codon 157 e 158 in Lung
(by benzene)
High frequency of C->T transition at dipyrimidine sites in
skin cancer (by UV irradiation)
Transversion at codon 249 in liver cancer (by aflatoxin)
8
TEST di AMES : Test di Carcinogenicità/POTENZIALE
MUTAGENICO DI UNA SOSTANZA
Ceppi di Salmonella typhimurium auxotrofi per istidina
I ceppi mutanti hanno frameshift o point mutations.
Quindi revertono o con indel o point mutations
Una sostanza che reverte a prototrofi, è capace di
mutagenizzare, quindi è un carcinogeno
Bruce Ames 1973
Carcinogens can function as mutagen - Bruce Ames 1975
procarcinogens
Cytochrome P-450 in liver S9
fraction
9
Food andAgriculture
Organizations data
2012
Carcinogenicità
POTENZIALITA’ MUTAGENICA
10
I tumori sono crescite
monoclonali
11
A tumor of the
Ab-producing cells
of the Bone marrow
Linfociti B
Il primo biomarcatore di tumori :
Catena leggera (kappa o lambda) di un anticorpo
scoperta da Henry BENCE-JONES nel 1847,
marker tumorale del mieloma multiplo
Una proteina di circa 25 kDa, presente nel sangue ed
urine (perchè overespressa) che è prodotta da un
clone di cellule B (origine monoclonale dei tumori)
12
Nomenclatura
80% Carcinoma= epithelial from ecto-meso-endoderm
Squamous cell carcinoma= protective layers
Adenocarcinoma= secretory epithelium
2% Sarcomas= mesenchymal-mesodermal origin (fibroblasti,
adipociti (liposarcoma), osteoblasti, miociti
(rabdomiosarcoma o leiomiosarcoma)
Hematopoietic= circulatory and immune system (leukemia,
lymphoma B /T, myeloid leukemia)
Lymphomas= Linfociti B e T
Neuroectodermal= nervous system (glioma, schwannoma)
Classificazione non classica
Melanomi da cresta neurale
Small-cell lung Carcinoma con cellule di tipo neurosecretorie
che rispondono a stimoli di signaling neuronale e sono di origine
neuroectodermica o endodermica
13
Laboratory Inves.ga.on (2006) 86, 425–444. doi:10.1038; 2006 Func.onal facets of the pulmonary neuroendocrine system R Ilona Linnoila PULMONARY
NEURO
ENDOCRINE
Cells
MYC
RB
TP53
RAS
ErbB2
EML4-ALK
p16INK4a
RARbeta
RASSF1
14
Multistep tumorigenesis
pathogenesis of carcinoma
N:Neoplasia
CIS: carcinoma In Situ
Figure 11.7 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
PDAC Adenocarcinoma Duttale Pancreatico
Il killer silenzioso
Modello genetico di progressione dell’adenocarcinoma pancreatico. Ogni grado di PanIN
Neoplasia Intraepiteliale Pancreatica, è caratterizzato da un distinto modello di processi
molecolari che si attivano in seguito a presenza di irregolarità genetiche che colpiscono
geni specifici (Bardeesy N et al., 2002).
I gradi 1A, 1B, 2 e 3 rappresentano un crescente riscontro di atipie citologiche
caratteristiche della cellula neoplastica
15
i) Cancer progression is fueled largely by genetic
hits inflicted by mutagenic cancerogenesis, TUMOR
INITIATOR
ii) Nongenotoxic –nonmutagenic agents but
toxic and mitogenic are Tumor Promoting Agents
TPA that drive forwards multi-step tumorigenesis
Cancer is a microevolutionary progress: cell divide and
accumulate gene mutations over time
Modello di neoplasia epiteliale: Carcinoma
chimicamente indotto
Topi trattati con:
DMBA carcinogeno/mutageno (7,12 DiMethylBenzAnthracene)
Produce mutazione missenso attivante in H-ras codon61 CAA->CTA
nei cheratinociti ( TUMOR INITIATOR)
TPA tumor promoter/proinflammatory (Phorbol 12-Tetradecanoate
13-Acetate, functional mimic of DAG):induce PKCalfa->IKK>NF-kB->TNFalfa, COX2, cycD1, BclxL
Applicazioni multiple causano papillomi benigni e (raramente)
Progrediscono a carcinomi squamosi, se avvengono ulteriori mutazioni
in p53, INK4alfa/ARF)
16
Initiation- Promotion- ProgressionHuman “tumor promoters” often act through cytotoxic, mitogenic
Mechanism and drive clonal expansion also through
chronic inflamation
Ex: Carcinoma Epatico indotto da infezione virale ( Epatite B)Carcinoma della colecisti indotto da infiammazione da calcoli formati da precipitatodi bileAspirina , sulindac e altri NSAID riducono incidenza di carcinomiHepatocellular carcinoma by hepatitis B chronic inflamationGall bladder carcinoma due to gallstones, precipitates from the bile-
Many of the cell phenotypes conferred by the
inflamation associated prostaglandins are uncanny
similar to those conferred by oncogenes
Loss of contact inhibition
Ancorage independent growth
proliferation
17
(Infezione cronica)
IκB kinase (IKK)
AKT
IAP-1 Inhibitor of
Apoptosis
Bcl-Xl B-cell
Lymphoma,extra
large
COX-2
cycloossigenase
Proprietà delle cellule trasformate (tumorali):
• morfologia alterata (metaplasia/displasia/anaplasia)
• mancanza inibizione da contatto
• (alterazioni ciclo cellulare e interazioni cellula-cellula)
• crescita più rapida (alterazioni segnali di trasduzione)
• richiedono meno/no siero (stimolazione autocrina/recettori)
• crescita in agar (alterate interazioni cellula-matrice e cell-cell)
• aneuploidia (numero cromosomi alterato)
• Secrezione PROTEASI (digestione matrice extracellulare,metastasi)
• Stimolazione NUOVA ANGIOGENESI
• Alterati DIFFERENZIAMENTO e APOPTOSI
18
ADATTAMENTI REVERSIBILI:
IPERTROFIA risulta da una aumentata produzione di proteine
(spesso in tessuti che non si possono dividere, es. Miocardio,
muscolo scheletrico)
Sensori meccanici-à MAP kinase, JAK-STAT,
PI3K/AKT= Ipertrofia fisiologica
IGF1, TGFbeta, FGF—Recettori associati a proteine G=
Ipertrofia patologica ,es Ipertrofia ventricolare sinistra in ipertesi
Aumento Fattori di Trascrizione (miocardio: GATA4, NFAT, MEF2)
Metaplasia/cambio di forma= Conversione fenotipica reversibile
di un tipo cellulare in un altro avente la stessa differenziazione
ONTOGENETICA , transdifferenziamento
(infiammazioni croniche (fumo), polipi intestinali, esofago di Barrett)
Displasia/forma anormale= Cambiamento reversibile nella
proliferazione e crescita
(esposizione a radiazioni, idrocarburi, virus (papilloma, verruca)
Iperplasia/aumento di numero
Fisiologica Compensatoria=Proliferazione di cellule
con corredo genetico normale (cardiomiociti dopo infarto)
Iperplasia Patologica= Proliferazione con corredo genetico
Normale
Neoplasia: Proliferazione di cellule con corredo genetico patologico
Sono tumori maligni o benigni
Anaplasia: Cellula indifferenziata
19
STEP BY STEP: Accumulo di
alterazioni genetiche e
progressione tumorale
LOH Chr.5q
LOH chr.18q
K-RAS
Epitelio
Normale—---Iperplasia
Aumento numero----Adenoma….Carcinoma
Neoplasia---Metastasi
Anaplasia
Alternative genetic paths to Barrett’s esophagus
Cellula
squamosa
esofago
Figure 11.11b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
20
Neoplasie
Ogni tumore ha origine da cellule che hanno acquisito queste proprietà:
Indipendenza da segnali di crescita esterni
Evitare Apoptosi
Insensibilità a fattori
Antiproliferativi esterni
Stimolo di Angiogenesi
E neo-vascolarizzazione
Invasione di altri tessuti
Replicazione indefinita
By Hanahan and Weinberg
21
Evasione del
sistema immune
Cambiamenti
Metabolici
Instabilità genomica
e Mutazioni GOF/LOF
Infiammazione
Pro-tumore
Cell 144, March 4, 2011
22
Cellule normali
Cellule trasformate
displasiche
Regolazione della divisione cellulare
da “inibizione da contatto”
23
Le cellule tumorali perdono la “inibizione da contatto”
La inibizione da densità, cioè da consumo di fattori di crescita
In plasma EGF: 1 nanogram/ml
In serum and saliva: EGF 1-5 nanogram/ml
In tears and sperm:
5-50 nanogram/ml
IN BILE, URINE, MILK, PROSTATE FLUID: 50-500 NG/ML
HeLa 35.000/65.000 EGFR / cell human uterine squamous carcinoma
Keratinocytes 40.000
Fibroblast 70.000-150.000
COS-1 400.000 African Green Monkey SV40-tran. kidney fibroblast
Hek293 <15000 Human Embrionic Kidney
24
caderine
Integrine
ECM
Fibronectina= glicoproteina dimerica 2500aa;
Collagene conferisce resistenza;
Proteoglicani con glicosamminoglicani GAG
glicosamminoglicani idrofilici, ialurano;
Condroitinsolfato;
Laminina;
25
INTEGRINE
Legame fisico cellula-ECM e trasduzione segnali
26
Alfa7beta1 pax7 satellite
Itga7 Itgb1à laminin
Three main functions of integrins are:
1- Attachment of the cell to the ECM.(integrine, laminine…)
2- Signal transduction from the ECM to the cell
3- Facilitate motility
Nature Genetics 17, 318 - 323 (1997)
doi:10.1038/ng1197-318
Absence of integrin alpha7 causes a novel
form of muscular dystrophy
Ulrike Mayer, Klaus von der Mark
ligands of integrins are fibronectin, vitronectin, collagen, and laminin.
27
Integrin Signaling:out-in
Attacco a ECMQuindi :
Sopravvivenza,
Proliferazione
OUTSIDE
Signal transduction:
ExtraCellularMatrix-integrineFAK-GRB2_SOS-RAS-ERK
Inside the cell
28
ANOIKIS
Integrin signal= Anchorage/RAS signaling
ECMàIntegrins betaà FAK activation autophosphorylation
à SRC docking and phosphorylation->PI3K, PLCgamma
àSOS dockingàRAS activation-àERK
No Integrin signal= No ECM attachment
No growth, no division, programmed cell death
ONCOGENIC RAS mimicks anchorage= Cells expressing
Oncogenic RAS grow without attachment
(ANCHORAGE INDEPENDENT GROWTH)
Oncogenic RAS mimicks growth factor presence: Cells grow
In low serum
Figure 9. A model for FAK in invadopodia regulation
A balance between tyrosine phosphorylation at focal adhesions and
invadopodia is required for proper dynamics and cell migration
Chan et al. J. Cell Biol. 2009:185:357-370
© 2009 Chan et.al.
29
When cancer cells can't let go
Like a climber scaling a rock
face, a migrating cancer cell has
to keep a tight grip on the surface
but also let go at the right
moment to move ahead.
The focal adhesion kinase, FAK,
coordinates these processes to
permit forward movement.
Tyrosine phosphorylation of paxillin, FAK, and
p130CAS: effects on cell spreading and migration
Signaling in-out
SHP2
30
SCAvenger
Receptor
Class A
Member 5
Hepato
Cellular
Carcinoma
Huang J, Zheng DL, Qin FS, Cheng N, Chen H, Wan BB et al. Genetic and epigenetic silencing of
SCARA5 may contribute to human hepatocellular carcinoma by activating FAK signaling. J Clin
Invest 2010; 120: 223–241 doi: 10.1172/JCI38012
.
The calpains are a conserved family of cysteine proteinases (Calcium-dep) that catalyse
the controlled proteolysis of many specific substrates. Calpain activity is implicated in
several fundamental physiological processes, including cytoskeletal remodelling,
MIGRATION, INVASION. Calpain expression is increased during tumorigenesis
Turnover of Focal
adhesions
Enhancement of Membrane
and matrix
metalloproteinase
Nature Reviews Cancer 11, 364-374 (May 2011) | doi:10.1038/nrc3050
Sarah J. Storr , Stewart G. Martin The calpain system and cancer
31
The transcription factor SNAILS is a Master EMT Regulator
The scavenger receptor classA member5 is a tumor metastasis
suppressor
SNAILS----| SCARA5 -----| FAK
SNAILS----| CADHERIN Epitelial
Zinc finger protein
Human lung
carcinoma
IN-OUT-IN
32
http://www.genome.jp/kegg/pathway/hsa/hsa04510.html
*
*
Embriology
Healing
Immunity
Metastasis
33
Chemiochine
C3a, C5a
Formilpeptidi
3
P-Selectin
Glycoprotein
Ligand
2
1
M1
TNFalfa
IL-1B
IL6
ROS
1 macrophage produceTNFalfa, interleukin-8, IL-1= leukocyte is attracted
2 Endothelial cells in blood vessels express E-selectin and display
P-selectins
3 P-Selectin-Glycoprotein-Ligand bind at low affinity (Velcro like)
34
PECAM-1/CD31
HOMOPHILIC INTERACTION
, JAM.1, CD99
DIAPEDESIS
Switch of heterophilic interactions
from
Default low affinity (selectin)
To high affinity (integrin)
The leukocyte
squeeze in
ameboid fashion
between tightly
apposed
endothelial cells:
the point of no
return
35
Vena Cava >>Polmoni
Vena Porta> Fegato
Carcinoma polmonare > metastasi cerebrali (carotidi)
Carcinoma mammella > metastasi ossea (sistema venoso del Batson)
Osteosarcoma > metastasi polmonare
Tumore al colon > metastasi al fegato (vena Porta)
36
Come studio la migrazione?
INVASION ASSAY
Boyden Chamber
Transwell Assay
Count Cells under microscope
and/or quantify after extraction
Solution colorimetric (560nm) or
Fluorescent (480nm)
37
Boyden Chamber Assay
CytochalasinD
Micotoxin that
Inhibits actin
polimerization
Figure 1. Human Fibrosarcoma HT-1080 Cell Invasion. HT-1080 and NIH3T3 (negative
control) were seeded at 300,000 cells/well and allowed to invade toward 10% FBS for 24 hrs
in the presence or absence of 2 μM Cytochalasin D. Invasive cells on the bottom of the
invasion membrane were stained (top panel picture) and quantified at OD 560nm after
extraction (bottom panel figure).
38
Cell Migration
CellProfiler cell
Image analysis software
39
Fibroblasti embrionali di topo
http://www.lgcpromochem.com/atcc/
40
Un focus di fibroblasti embrionali di pollo
indotto dal virus del sarcoma di Rous
Focus Assay per perdita di inibizione da contatto
Test di Trasformazione cellulare
Test di formazione di foci (Harry Rubin e Howard Temin, 1958):
foci di cellule addensate e morfologicamente alterate. Test basato
sulla perdita di inibizione da contatto su fibroblasti embrionali
di topo BALB/c 3T3
Crescita in agar: Le cellule trasformate non debbono attaccarsi ad
Una superficie solida prima di potersi dividere. Test basato sulla
Indipendenza da legame integrine-matrice extracellulare
Ridotta richiesta di siero: richiedono meno del 5% di siero.
Basato su attivazione di segnali di proliferazione e capacità autocrine
41
Crescita senza supporto
Mammosfere : tumor stem cells
42
Mammospheres 1st generation
MCF7 p9
Ctrl
Metformin 10 mM
Inhibition of
Notch????
100 micron
diameter
These ‘tumor stem cells’ share the
properties of self-renewal
and differentiation with their normal
stem cell counterparts,
although in tumors these processes
are deregulated.
Only a minority of cells in human
cancers are capable of self renewal.
100 cells
Epitelial, Myoep., Alveolar
Differenziazione cellulare
Differenziazione strutturale
43
Test di Trasformazione cellulare
Test di formazione di foci (Harry Rubin e Howard Temin, 1958):
foci di cellule addensate e morfologicamente alterate. Test basato
sulla perdita di inibizione da contatto su fibroblasti BALB/c 3T3
Crescita in agar: Le cellule trasformate non hanno bisogno di
attaccarsi ad una superficie solida prima di potersi dividere.
Test basato sulla
Indipendenza da legame integrine-matrice extracellulare
Ridotta richiesta di siero: richiedono meno del 5% di siero.
Basato su attivazione di segnali di proliferazione (RAS)
e capacità autocrine
Omofiliche -Calcio
I 4 tipi di
Molecole di
carboidrati
Adesione
Cell-cell
Eterofiliche -Calcio
Molecole adesione cell-cell
44
AJ Caderina-Actina
DS Cad-filamenti
intermedi
Integrine- filamenti intermedi
The integrity of the cadherin-catenin complex is negatively regulated by phosphorylation of betacatenin by receptor tyrosine kinases (RTKs) and cytoplasmic tyrosine kinases (Fer, Fyn, Yes, and
Src), which leads to dissociation of the cadherin-catenin complex
giunzioni serrate (tight junction)
,
Recettori per fattori di crescita:
TGFβRI e II, IGF-1R, EGFR, c-Met
Claudina occludina
F-actina
giunzioni aderenti (adherens junctions)
0
p12
E-caderina
β cat.
α cat.
cat.
ulin
vin c
a
F-actina
45
46
Importanza delle caderine
Nei tumori diminuiscono per varie cause:
Mutazioni LOF
Overespressione di fattori che le destabilizzano
Overespressione di repressori trascrizionali
Soppressione epigenetica della espressione
Degradazione da proteasi
CADH1=E cadherin chr.16q22
30 mutazioni germinali in tumori,
OMIM 192090 UniProtKB:
P12830
882AA : 25/30 mutazioni inattivanti- 5/30 sono missense
47
La E-caderina è un TSG:
Le mutazioni sono distribuite lungo tutto il gene
Le mutazioni sono missense, non sense, splicing, frame shift
60% dei tumori presenta mutazioni in CDH1, insieme con
concomitante perdita dell’allele wt.
Spesso si riscontra perdita delle caderine per attivazione di
proteasi da influsso di calcio (intracellulare), caspase3 o
gamma-secretase. Oppure metallo proteasi di matrice
Mol Cell Biol. 2007 May;27(10):3804-16. Epub 2007 Mar 12.Casein kinase 1 is a novel negative
regulator of E-cadherin-based cell-cell contacts.Dupre-Crochet S, Figueroa A, Hogan C,
Ferber EC, Bialucha CU, Adams J, Richardson EC, Fujita Y.
E-CADERINA P12830
S846D
IC261
CK1 casein kinase
Fosforila S846
Phosphorylated S846 E-CADH has weaker interaction with beta-catenin
48
MYC, CyclinD
Le caderine
prevengono
la localizzazione
nucleare della
Beta-catenina
Giunzioni
Aderenti
A road to cancer : tightly
regulated self renewal system
subverted in cancer
Wingless in Drosophila and int-1 in mouse
(Insertion of Mammary Tumor Virus)
WNT1 protooncogene 370 AA- 12 genes in homo sapienssecreted lipid-modified signaling glycoproteins (350–400 aa)
49
Nusse R, van Ooyen A, Cox D, Fung YK, Varmus H (1984). "Mode
of proviral activation of a putative mammary oncogene (int-1) on
mouse chromosome 15". Nature 307 (5947): 131–6. doi:
10.1038/307131a0. PMID 6318122.
Nüsslein-Volhard C, Wieschaus E (October 1980). "Mutations
affecting segment number and polarity in Drosophila". Nature 287
(5785): 795–801. doi:10.1038/287795a0. PMID 6776413
1995 Nobel Price
Christiane
Eric
19x
Giunzioni
Aderenti
Glycogen synthase
kinase
50
Lipoprotein
Receptor Related
Protein. LRP
Casein Kinase CK-1
Glycogen Synthase Kinase GSK
Adenomatous Polyposis Coli APC
Beta-Transducin Repeat
Containing Protein
Co-repressors
CONCENTRATIONS
total Dsh
total APC
total TCF
total GSK3
total axin
total β-catenin
free phosphorylated β-catenin
10 milioni di molecole / cellula
100 nM
100 nM
15 nM
50 nM
0.02 nM
35 nM
1 nM
DISSOCIATION CONSTANTS
binding of GSK3 to (APC.axin)
binding of APC to axin
binding of β-catenin to (APC.axin.GSK)
binding of β-catenin to TCF
binding of β-catenin to APC
10 nM
50 nM
120 nM
30 nM
1200 nM
FLUXES
degradation flux of β-catenin via the proteasome
Share of degradation of β-catenin via
unphosphorylated form
CHARACTERISTIC TIMES
Half life beta –catenin : 20 minutes—2 HOURS
phosphorylation/dephosphorylation of APC and axin
GSK3 association/dissociation
Axin degradation
25 nM/h
1.5 %
2.5 min
1 min
6 min
51
P35222 (CTNNB1) Catenin beta-1
Ser 45 priming site (by CK1,2 CaseinKinase ) , Sà F, P in
hepatocellular carcinoma
Ser 23, 29, 33, 37 phosphorylated by GSK3beta, targets to
Proteosomal degradation
Mutated in several cancers
“PGE2 prostaglandins activate Wnt” suggests that chronic
inflammation-related increase of PGE2 may lead to activation of
Wnt pathway in different tissues, resulting in carcinogenesis.[3]
Target gene of catenin: Overexpression of MYC is implicated in the etiology of a variety of hematopoietic tumors.
A chromosomal aberration involving MYC may be a cause of a form of B-cell chronic lymphocytic leukemia.
Translocation t(8;12)(q24;q22) with BTG1.
Chromosomal aberrations involving MYC are usually found in Burkitt lymphoma. Translocations t(8;14), t(8;22) or
t(2;8) which juxtapose MYC to one of the heavy or light chain immunoglobulin gene loci.
Transcription factor that binds DNA in a non-specific manner, yet also specifically recognizes the core sequence 5'CAC[GA]TG-3'. Activates the transcription of growth-related genes.
DESTRUCTION COMPLEX
Machinery for
Beta-catenin proteolysis
CTNNB1
Fbox
S-phase Kinase
Cullina
52
BETA-TRCP:
The WD40 repeat (also known as the WD or betatransducin repeat) is a short structural motif of
approximately 40 amino acids, often terminating in a
tryptophan-aspartic acid (W-D) dipeptide.
Tandem copies of these repeats typically fold together to
form a type of circular solenoid protein domain called the
WD40 domain.
beta TRCP is a F-box protein that constitutes one of the
four subunits of ubiquitin protein ligase complex called
SCFs (Skp1 Sphase Kinase-Cul1 Cullin-F-box protein)
WNT pathway
nell’adesione,proliferazione,
mantenimento stato indifferenziato
Se l’attività di GSK-3beta è inibita
dall’attivazione della via di WNT o se APC non
funziona (come nel cancro del colon), la betacatenina non viene fosforilata e si accumula ad
alti livelli nel citoplasma (emivita di 2 ore).
La beta-catenina trasloca nel nucleo dove lega i fattori di
trascrizione T-cell factor/Lymphoid enhancing factor TCF/
LEF1 modulando insieme ad essi l’espressione di geni
implicati nella proliferazione cellulare e nella
progressione tumorale.
http://www.stanford.edu/~rnusse/pathways/targets.html
53
WNT signal
S45
CREB binding protein Q92793
54
GSK3 Binding protein
Casein kinase
Half life from
20 minutes to 2hrs
D1 cyclin
GSK modulates Cyclin D at transcriptional and post
translational levels
Myc, Jun
55
Planar Cell Polarity Signaling controls cell polarity and
movement during development
RhoA (Ras Homologue memberA) requires DVL (dishevelled) and
a formin homology protein called Daam1 (Dishevelled Associated
Activator of Morphogenesis 1)
RhoA activates ROCK
56
Cellule tumorali non hanno inibizione da contatto
S45
57
Mancanza di E-caderina
a: E-caderina
b: beta-catenina
c: DAPI
Beta-cell carcinoma
Da Rat Ins-promoter
Sv40 antigentransgenic mouse
COSMIC catalogue of Somatic Mutations in cancers
Carcinoma , small intestine
COSMIC
58
2012
GENI MUTATI
APC CDH1 CDKN2A CDKN2a(p14) CTNNB1
KRAS MLH1 NF1 NF2 PI3KCA PTEN RB1
SMAD4 SMARCa4 TP53
CDH1 Cadherin
trovato mutato, ma in introne e non in coding sequence
In omozigosi. Quindi, le caderine subiscono downregolazione
E, meno spesso, mutazioni
Meccanismi
Down-regulation caderine
(e.g.,maintenance of embryonic mesoderm, EMT)
• Regolazione trascrizionale:
- repressori trascrizionali come le proteine Snail, Slug e SIP1 e il
fattore di trascrizione E12/ E47 legano le box E2 nel promotore del
gene della E-caderina reprimendone l’espressione.
5’CACCTG CACCTG
59
Meccanismi down-regulation
caderine
• Inibizione proteica:
- la
dysadherin (FXYDQ96DB9) è una glicoproteina di
membrana che regola negativamente i livelli proteici della
E-caderina, senza colpire l’m-RNA.
- Questo meccanismo induce sperimentalmente metastasi.
• Fosforilazione della tirosina:
- EGFR, c-MET (HGFR), FGFR e SRC possono fosforilare
E-caderina, N-caderina, alfa-catenina, beta-catenina e
p120-catenina portando al disassemblamento del CCC
(Cytoplasmic Cell Adhesion Complex) e alla distruzione
dell’adesione cellulare.
• PTP1B fosfatase lega N-caderina e promuove legame con
catenina
Meccanismi
Down-regulation caderine
• Degradazione :
- Hakai (una E3-ligasi) si lega
specificatamente alla E-caderina fosforilata
sulla tirosina e la ubiquitina. La E-caderina
viene marcata per la degradazione tramite
il proteosoma.
Inibitori del proteosoma
vengono utilizzati come
chemoterapici antitumorali
(PATENT Chiron Corporation)
60
Meccanismi
Down-regulation caderine
• Epigenetica: Ipermetilazione:
in seguito ad inattivazione trascrizionale, il gene della Ecaderina è epigeneticamente silenziato da ipermetilazione
che porta a un’ulteriore regolazione negativa dell’espressione
della E-caderina.
• Degradazione proteolitica:
le metalloproteasi di matrice (MMPs) degradano la Ecaderina dando origine a una proteina ridotta di 80 KDa che
promuove l’invasione tumorale regolando positivamente le
MMPs.
Swissprot entry P12830 CADH1 882AA
•
TISSUE SPECIFICITY: Non-neural epithelial tissues.•PTM: During
apoptosis or with calcium influx, cleaved by a membrane-bound
metalloproteinase (ADAM10), PS1/gamma-secretase and caspase-3 to
produce fragments of about 38 kDa (E-CAD/CTF1), 33 kDa (E-CAD/
CTF2) and 29 kDa (E-CAD/CTF3), respectively. Processing by the
metalloproteinase, induced by calcium influx, causes disruption of
cell-cell adhesion and the subsequent release of beta-catenin into the
cytoplasm. The residual membrane-tethered cleavage product is rapidly
degraded via an intracellular proteolytic pathway.
DISEASE: Defects in CDH1 are involved in dysfunction of the cell-cell
adhesion system, triggering cancer invasion (gastric, breast, ovary,
endometrium and thyroid), metastasis and cause of hereditary diffuse
gastric cancer (HDGC) [MIM:137215]. Defects in CDH1 are a cause of
susceptibility to endometrial cancer [MIM:608089]
61
EPIGENETICA : IPERMETILAZIONE e
Spegnimento delle Caderine
Reprimere la trascrizione: la metilazione del DNA
• La metilazione nei vertebrati avviene esclusivamente sui residui di C nel dinucleotide CpG
• Le sequenze CpG sono sotto-rappresentate nel genoma (probabilmente per la tendenza
• della 5-metilcitosina a venire deaminata e mutata in T) -> ma presente nei promotori
• dei geni dove causa repressione della trascrizione
62
CpG ISLANDS (CGI)
• Short sequences (1000 base pairs (bp) long)
rich in GC and CpG
• Predominantly NON METHYLATED
• Most, perhaps all, CGIs are sites of
transcription initiation
CpG islands and the regulation of transcription
Aimée M. Deaton and Adrian Bird
PROMOTORI con normale quantità di CpG sono solitamente attivi
la metilazione non partecipa normalmente a regolare la trascrizione di
geni i cui promotori sono ricchi di CpG
PROMOTORI IMPOVERITI di CpG la cui attivazione è controllata
dalla metilazione;
la metilazione delle CpG blocca l’accesso sul promotore del complesso
di attivazione trascrizionale
la metilazione delle CpG aiuta il reclutamento di complessi proteici
che fungono da inibitori della trascrizione
“HISTONE CODE”:
ü
LA METILAZIONE DEL RESIDUO DI Lys9 H3 E’ ASSOCIATA
ALLA CROMATINA TRASCRIZIONALMENTE INATTIVA
tale processo è coinvolto nello stabilire i siti del DNA che devono
essere metilati;
ü
LA METILAZIONE DEL RESIDUO DI Lys4 H3 E’ ASSOCIATA
ALLA CROMATINA TRASCRIZIONALMENTE ATTIVA
63
• In cellule non embrionali, 80% dei CpG sono metilati,
ad eccezione delle isole CpG dei promotori
• Le DNA metil-transferasi (Dnmt) hanno particolare
affinità per le sequenze emi-metilate: tendono quindi a
metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo
metilato-> mantenimento del pattern di metilazione
(modificazione epigenetica - memoria cellulare)
Metilazione e regolazione genica da codice istonico:
Dnmt metilano il DNA = modificazione epigenetica
Il DNA metilato non e’ efficientemente legato da attivatori
trascrizionali ma viene legato da proteine che legano metilcitosine
(MeCP2, MBD1-4) e repressori trascrizionali
Questi a loro volta sono in grado di reclutare diversi HDAC deacetilasi di istoni > repressione della trascrizione.
Anche alcune Dnmt reclutano HDACs e viceversa
64
Transcription
La metilazione è regolata durante
lo sviluppo:
Parental imprints derived from gametogenesis are retained faithfully in
the zygote as well as some other marks. However, others are
reprogrammed dynamically to meet the need of becoming totipotent
65
Figure 2 Imprint life cycle.
Philippe Arnaud Reproduction 2010;140:411-423
© 2010 Society for Reproduction and Fertility
Reprod Biol Endocrinol. 2009; 7: 59.
Published online 2009 Jun 5. doi: 10.1186/1477-7827-7-59
66
Le principali funzioni della
metilazione sono collegate alla
repressione della trascrizione:
• Difesa contro i trasposoni: la metilazione e’ fondamentale
per mantenere silenti i genomi dei trasposoni e dei retrotrasposoni.
Ad esempio : LINE1 è controllato da metilazione e proteine ADAR
Che bloccano il complesso RNA:proteine che retrotrasportano
mRNA al nucleo
• Regolazione genica: la metilazione contribuisce a stabilire e
mantenere uno stato trascrizionalmente inattivo (eterocromatina)
• Imprinting parentale: emizigosi da metilazione
• Quindi la metilazione del DNA rappresenta un
meccanismo di memoria cellulare, che non puo’
dare inizio al silenziamento genico ma che lo
individua, propaga e rafforza:
• Metil-DNA…> Transcriptional repressor..>
Histone Deacetylase..> silenziamento genico
67
68
EPIGENETICA e TUMORI
Blocco del differenziamento
Leucemia Promielocitica
Eliminazione dell’isolamento
fra loop di geni ad attività
coordinata
Glioblastoma multiforme
AML è molto eterogeneo, caraMerizzato da un aumento (>20%) di cellule ematopoie.che immature che proliferano (mieloblas.) nel midollo o nel sangue senza differenziare. Meccanismi Patogene.ci: Geni di Classe1 MIELOPROLIFERAZIONE: Sono inizialmente coinvol. geni codifican. protein-­‐.rosina chinasi o GTPasi, che causano crescita incontrollata in presenza di mutazioni in geni che bloccano apoptosi (Flt3, N-­‐RAS, Kit, cABL, JAK2) Geni di Classe2 BLOCCO DEL DIFFERENZIAMENTO : Even. PRECOCI che coinvolgono I faMori di trascrizione muta. o trasloca. (AML-­‐ETO, PML-­‐RARalfa) o altre proteine che governano il differenziamento (NPM1 nucleolar, ubiquitarious phosphoprotein, CEBPA faMore di trascrizione che blocca abvazione dei granuloci. ) che spesso presentano mutazioni 69
LEUCEMIA PROMIELOCITICA ACUTA (Acute promyelocy.c leukemia) t(15;17) (q22;q12); PML-­‐RARalfa Prognosi favorevole. TraMabile con ATRA (All-­‐Trans Re.noid Acid 10exp-­‐6 M) che induce il differenziamento terminale dei blas. CaraMerizato dal riarrangiamento PML-­‐ RARalfa (Re.noic Acid Receptor alfa)-­‐ La cellula di origine è “commiMed” verso granuloci. e monoci. (non precursori di megacarioci. o eritroblas.) . Successivamente, quando il tumore occupa troppo posto , anche anemia e trombocitopenia sono rileva. PML si concentra nei PML-­‐NB Nuclear Bodies, è ubiquitario ed espresso a bassi livelli Ha un RING (Really Interes.ng New Gene)Zinc-­‐finger DOMAIN Ha un dominio di Protein-­‐protein interac.on al C-­‐terminale con il quale forma mul.meri 70
-Tumore da blocco del differenziamentoAcute Promyelocytic Leukemia t(15;17)(q22;q21)
Traslocazione Reciproca di RARalfa (Retinoid Acid Receptor,,
Cromosoma 17) e PML (Promyelocytic Leukemia, chr.15)
Questa nuova proteina chimerica lega il DNA, aumenta
L’interazione fra HDAC (deacetilasi istoniche) e NCOR
(Nuclear Corepressor) ed impedisce la trascrizione dei geni
Del differenziamento.
Leucopenia
Coagulopatia
Diagnosi al microscopio
Cura urgente
FAGGOT CELLS
Metilazione e regolazione genica: APL Acute
Promyelocytic Leukemia
• Il pattern di metilazione dei geni è
alterato nelle cellule tumorali, e
metilazione alle isole CpG di certi
geni è associata al loro silenziamento
specifico
• es. The fusion oncoprotein PML-RAR
Retinoic Acid Receptor,
come proteina chimerica da traslocazione
t(15;17), lega il promotore del gene
Retinoic Acid receptor β e causa il
reclutamento di DNMT -> metilazione ->
MBD -> HDAC> deacetilazione>
inattivazione trascrizionale gene
Differenziation= acido retinoico ATRA
RARbeta---> APL
Blocco HDAC= TSA tricostatin, sodio
valproato
Acute Promyelocytic leukemia ( 10% )
5-azacitidina non metilabile
• Accumulo Leucociti immaturi
• Diminuzione piastrine e rossi
71
PML and PML-NBs: hubs of a proapoptotic
transcriptional network
Le cellule con PML-RARalfa NON vanno in
apoptosi nè se indotte da TNFalfa , nè per
mancanza di siero (serum starvation)
De-­‐SUMOYLATION CBP/p300 Acetyl Transferase PML aumenta l’abvità e la stabilità Di P53 e la Apoptosis –p53 e nucleo
dipendente 72
Death-associated
protein 6
FAS, TGFbeta induced
APOPTOSIS
desumoyla.on Titra.on of DAXX By PML: to inhibit transcrip.on of an.-­‐apipto.c genes Possible model of DAXXPML cooperation in the
induction of apoptosis
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE con traslocazioni e mutazioni di geni che codificano faMori di trascrizione del differenziamento ematopoie.co, la cui perdita di funzione risulta in blocco del differenziamento e proliferazione di blas. immaturi AML-­‐associated chromosome aberra.ons open affect the components of the core binding factor (CBF) complex, i.e., RUNX1 (CBFA2, AML1) and core-­‐binding factor, beta subunit (CBFB) proteins. RUNX1/AML1(chr.21) Runt-­‐related transcrip.on factor 1/core factor subunit alfa ( RUNX1-­‐RUNX1T1 fusion) (AML1-­‐ETO) t(8;21) the fusion protein AML1-­‐ETO (Histone deacetylase)= BLOCCO DEL DIFFERENZIAMENTO. Non sono trascrib I geni C-­‐FMS (CSF1R—
colony s.mula.ng factor 1 receptor), P14ARF (CDKN2A— cyclin-­‐dependent kinase inhibitor 2A) and CEBPA CBFB (chr.16) Core-­‐binding factor, beta subunit: allosteric agent per il legame al DNA di alfa factor RUNX1 (CBFB-­‐MYH11 miosina heavy-­‐chain t16;16) 73
EPIGENETICA e TUMORI
Blocco del differenziamento
Leucemia Promielocitica
Eliminazione dell’isolamento fra loop
di geni ad attività coordinata
Glioblastoma multiforme IDH1mutato
Mutazioni nel gene che codifica per ISOCITRATE
DEHYDROGENASE I sono associate al
glioblastoma multiforme PRIMARIO
74
GBM SECONDARIO: I pazien. IDH1 muta. Mostrano migliore sopravvivenza Prima ipotesi
IDH1 Isocitrate dehydrogenase wt= Citrate -àalfa
ketoglutarate C5H6O5
IDH1 mutant = Citrate -à C5H8O5 ----| TET enzyme
TET enzyme removes METHYL group from DNA
If IDH1 is mutated, TET is inhibited, DNA is
hypermethylated (CpG metilator phenotype), TSG are
silenced
Ipotesi non accettata perchè in questi tumori il cambio di
metilazione non correla con un forte cambio di espressione
genica (trascrittoma e esoma)
75
Seconda Ipotesi
In addition to promoters, gene expression is regulated
by the 3D structure of TOPOLOGICAL
ASSOCIATED DOMAINS (TAD).
- IDH1 mutato blocca TET ( che non demetila più
efficientemente)
- Alcuni siti CCCTC per legare CTCF sono metilati
- Se sono metilati, CTCF NON si lega.
CTCF è una proteina “Insulator”,
- Se non si lega I TAD non sono più isolati
- Singoli ONCOGENI VENGONO IPERATTIVATI
DA ENHANCER situati IN ALTRI TAD
Cancer: Oncogene brought into the loop
Matthew R. Grimmer
& Joseph F. Costello
Nature 529, 34–35 (07 January 2016) doi:10.1038/nature16330
TAD
PGFGRA
900.000 basi
TAD Topological Associated Domain,within which gene activity
is Coordinated
76
Imprinting
• Espressione Genica dipendente dall’origine
Parentale dell’allele.
• L’allele imprinted è spento.
77
Chr 11 imprinted region
Embryonal Rabdo Myo Sarcoma
• ERMS hanno perdita di chr 11p15.5 di
origine materna
• I geni imprinted in 11: IGF2 espressione
paterna (maternally imprinted),
• H19 e p57KIP2 espressione Materna
(Paternally imprinted TSG )
• The imprining of p57KIP is leaky
• Amplificazione di MYCn
78
l’iperme.lazione di questa regione in entrambi i cromosomi, che porta inevitabilmente ad una sovraespressione di Igf2 , è stata osservata in diversi .pi di tumori maligni. Erasure of imprin.ng: H19 high –interagisce con histone methyl transferasi EZH2 (polycomb repressor of transcrip.on) -­‐-­‐à Low espression of NKD1 Naked cu.cle1 ( passive antagonist of Wnt that blocks beta-­‐catenin). In glioblastoma mul.forme o tumori alla vescica , H19 è molto espresso perchè la me.lazione è bassa . Gli Rhabdomiosarcomi ERMS umani che hanno perdita chr 11 p15.5 materno, perdono l’espressione di H19 e p57KIP2 (sono TSG paternally imprinted): Loss of imprin.ng: L’iperme.lazione di questa regione in entrambi i cromosomi, che porta inevitabilmente ad una sovraespressione di Igf2 , è stata osservata in diversi .pi di tumori maligni. 79
The Increasing Complexity of the Oncofetal H19 Gene Locus:
Functional Dissection and Therapeutic Intervention
Imad Matouk 1,2,*, Eli Raveh 1, Patricia Ohana 1, Rasha Abu Lail 1, Eitan Gershtain 1, Michal Gilon 1, Nathan De Groot 1, Abraham Czerniak 3 and
Abraham Hochberg 1
H19 spinge alla staminalità
E crescita incontrollata
( GBM)
SMAD an.-­‐differen.a.on 80
H19 è espresso abbondantemente in tesuti embrionali e
represso dopo la nascita. Rimane espresso nel muscolo
scheletrico (eRMS).
miR675-3p ; miR675-5p --------| SMAD antidifferentiation transcription factor for bone
Paxillin-dependent regulation of IGF2 and H19 gene cluster expression
J. Cell Sci. August 15, 2015 128: 3106-3116
81
82
Modificazioni epigenetiche, trascrizione e
ambiente
• In quanto reversibili, i cambiamenti epigenetici possono
essere modificati dall’ambiente
• Sia ipo- che iper-metilazione sono stati associati all’invecchiamento
(perdita generica di metilazione, ipermetilazione di geni specifici:
silenziamento di soppressori tumorali?)
• Vitamine quali l’acido folico (vit.B9), che sono importanti per l’attività
degli enzimi che forniscono gruppi metilici, hanno effetti notevoli
sull’incidenza di tumori (cancro al colon)
• Dieta scarsa in folati -> instabilità genomica e ipometilazione
• Dieta scarsa di gruppi metilici -> cancro del fegato, e
ipometilazione+sovraespressione di oncogeni (c-ras, c-myc, c-fos)
83
T308
S473
MAFbx:Muscle Atrophy F-Box
MURF1: Muscle Ring Finger1
LC3:microtubule associated
Light Chain3 ( essential for
autophagy, with BCL2/
adenovirus E1B Interacting
Protein 3, BNIP3
84
85
