9 Colture cellulari (27)

COLTURE CELLULARI
Popolazione omogenea di cellule singole più o meno aggregate tra
loro che si riproducono e si accrescono in substrato liquido o solido
Applicazioni colture cellulari:
- industriali
- ricerca
morfologia
biochimica
patologia
genetica
Applicazioni industriali
Produzione di sostanze varie
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Vantaggi delle colture cellulari rispetto ai metodi
tradizionali di coltivazione:
- Indipendenza da fattori ambientali (clima, parassiti,
terreno, ecc)
- sistema ben definito, dovuto all'omogeneità della
popolazione (si evitano fluttuazioni nelle produzioni)
- migliore qualità e quantità nelle produzioni
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RICERCA
Morfologia:
primo uso delle colture cellulari
- eventi morfologici differenziazione cellulare
- eventi morfologici formazione di organi
- eventi morfologici dedifferenzazione (sviluppo callo)
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Biochimica:
uso industriale delle colture cellulari
per la produzione di sostanze
"metaboliti secondari" di alto valore
economico
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Patologia:
nell'eliminazione dei virus (colturein vitro)
(meristema: assenza di virus)
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Genetica:
- variabilità genetica (somaclonal variation)
(Colture in vitro) relazione alla instabilità
cariologica, numero cromosomico, aneuploidia
-variabilità genetica: individuazione di nuovi
e positivi caratteri
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-ibridazione da fusione di protoplasti:
pianta ibrida spesso non fertile,
superamento delle barriere di incompatibilità
sessuali (grosso ostacolo nel trasferimento di
geni utili da genetipo a genotipo)
- trasferimento di DNA: trasformazione genetica
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Studio stress abiotici
Ruolo fondamentale delle colture cellulari:
Limiti:
informazioni
su
processi biochimicifisiologici-molecolari,
ma
meccanismi
di
risposta allo stress dipendeno dalle funzioni e
struttura dell'intera pianta (interazione cellulacellula della struttura rigida della pianta è
persa, il turgore cellulare e altri meccanismi
fisici di risposta allo stress non possono essere
valutati)
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-composizione substrato colture cellulari
molto diverso da quello in cui le radici
crescono normalmente
-se un carattere è definito a livello cellulare è
essenziale che l'impatto di questo si trasmetta
all'intera pianta, ereditato e trasferito alle
successive generazioni
-fondamentale è quindi la rigenerazione da
cellula a pianta
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Vantaggi:
-tutte le cellule sono esposte ad un
uniforme potenziale idrico che può
essere modificato per l'intera popolazione
di cellule (stress idrico, salino)
-cellule sono uniformi nello sviluppo ed
accrescimento => qualsiasi cambiamento
biochimico-fisiologico dovuto a stress
riguarderà tutte le cellule; mentre le
piante sono popolazioni di cellule eterogenee,
lo stress può influenzare solo parti di pianta
(stress idrico, salino, metalli, freddo, caldo)
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-può essere facilmente valutata la relazione tra potenziale
idrico e osmotico indipendentemente dall'interazione
cellula-cellula che si ha nella pianta (stress idrico, salino)
sistema permette facilmente il dosaggio dello stress:
FREDDO - CALDO : si agisce sulla regolazione temperatura
camera di crescita (tutte le cellule saranno stressate)
IDRICO: uso di agenti osmotici da aggiungere al sustrato:
glicerolo:
penetra nella cellula
mannitolo:
penetra solo la parete cellulare
PEG:
non penetra
(diminuisce disponibilità acqua intra-extracellulare)
SALINO- METALLI: somministrazione diretta nel substrato
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Ottenimento colture cellulari
CALLO
-Essenziale passare da questo stadio
Che cos’è?
-E' essenzialmente tessuto indifferenziato capace
più o meno di proliferazione indefinita quando
porzioni dello stesso sono propagate a intervalli
regolari su substrato fresco in condizioni di sterilità
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Come si ottiene?
-Teoricamente da qualsiasi parte di pianta,
è comunque preferibile tessuto giovane
(foglie a quadrato, stelo capovolto),
messa su un particolare substrato solido
al buio (bianco-giallino) o alla luce (giallo-verdino)
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-Il sito di inizio della crescita, proliferazione,
è la superficie tagliata => massimizzare la
superficie di contatto col substrato
-Microscopicamente un tipico callo si presenta
con grossi vacuoli, sottile strato di citoplasma,
nucleo pressato contro la parete
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Continue subcolture:
-perdita o riduzione organogenesi e
embriogenesi, correlato cambiamento
di ploidia (predominano poliploidi ed aneuploidi),
cambiamento di natura fisiologica ma non
genetica
-comparsa di tessuto con tessitura diversa
⇒ aumenta la friabilità (utile per ottenere
cellule, non per organogenesi)
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Per ottenere le colture cellulari:
-ottenuto il callo, subclonarlo molti cicli
(5-10 volte) per avere callo friabile
-si sfrantuma il callo friabile in un mezzo liquido
⇒ si ottengono cellule più o meno aggregate,
poche singole
-in agitazione continua al buio, 25-28ｰC
- diversi cicli per stabilizzazione coltura:
inizio coltura crescita lenta, spesso non partono,
degenerazione, poi crescita rapida e stabilizzata
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Per le piante in natura tre fonti di nutrizione:
- nutrienti minerali, dal suolo via radici
- CO2 atmosferica per la fotosintesi, fonte di
carbonio
- prodotti della fissazione di C e minerali =>
sostanze di riserva, ormoni, vitamine ecc.
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Per le colture in vitro stesse richieste:
calli (solido) e cellule (liquido)
-per le colture cellulari: no luce, no CO2
-somministrazione esogena di nutrienti
minerali, nutrienti organici, vitamine, ormoni
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NUTRIENTI MINERALI: MS
4.7 g/l
NUTRIENTI ORGANICI: Saccarosio 30 g/l
Vitamine:
tiamina
9.9 mg/l
piridossina 9.5 mg/l
Ac.nicotinico4.5 mg/l
ESTRATTI NATURALI: come supplementi
(acqua di cocco, estratto di lievito, estratto di malto,
caseina idrolizzata, succo di arancia e di pomodoro,
aminoacidi:
caseina idrol. 2.0 g/l
ORMONI (specificità del substrato):
2,4 D
5.0 mg/l
dopo autoclave
Kinetina
1.0 mg/l
Agar(solido) 8.0 g/l
pH 5.8 con HCl
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Citochinine:
Kinetina
Benzil-aminopurina (BAP)
- Molto attive sulle colture cellulari
stimolano continua crescita e divisione cellulare
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Auxine:
Acido indol-acetico (IIA)
Acido dicloro fenolacetico (2,4 D)
Acido naftalenacetico (NAA)
-stimolano:
divisione cellulare
allungamento cellulare
differenziamento
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FASI CICLO CELLULARE
-Singola popolazione è omogenea
(stesso substrato, origine, condizioni di crescita,
trattamento, ecc.);
- ma differenze in: misura, struttura-aggregazione,
forma, cariotipo tra le cellule
=> eterogeneità spaziale
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Eterogeneità temporale:
analisi ciclo colturale (7-10 giorni):
1 - Lag-fase: subito dopo trasferimento
(diluizione) cellule su substrato fresco:
cambiamento metabolico che prepara le
cellule alla divisione; incrementa livello di:
NADPH, ATP, RNA cellulare, proteine totali
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2 - Esponenziale o lineare:
fase di intensa divisione cellulare =>
rapido aumento del numero di cellule,
diminuzione dei nutrienti, sintesi di metaboliti
primari
diluizione cellulare (più diluite, maggior
substrato fresco, => maggiore sarà la divisione
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3 - Stazionaria:
diminuzione fino alla cessazione divisione
cellulare, diminiusce metabolismo in genere,
fenomeno di affamamento
(scarsa disponibilità di nutrienti),
differenziazione, produzione di metaboliti secondari
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MANTENIMENTO COLTURA
Agitazione 100-120 rpm, al buio
(12 ore di sopravvivenza)
Temperatura 26-28ｰC costante
Beute da 100ml (20) - 250ml (50) sterili
con tappo cotone più alluminio
Subcoltura: 7-10 giorni: 1:1 fino a 1:4
Filtrazione: uso di siringhe, filtri
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Controllo sterilità:
- colore
- pH
- odore
- chiarezza menisco
- vetrino microscopio
- crescita su brodo colturale
Controllo vitalità: uso di fluoresceina diacetato
(50mg/ml acetone)1:1 con la coltura cellulare
Misura crescita (curva di crescita):
P.C.V.
Peso secco (o fresco)
Misura corda
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