UNIVERSITÀ STATALE DEGLI STUDI DI MILANO
FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE NATURALI
GENOMICA FUNZIONALE E BIOINFORMATICA
TESI DI LAUREA SECONDO LIVELLO
ANALISI DI FENOMENI NON-CLASSICI RIGUARDANTI
NEURONI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI
NEURALI ADESI SU MEA
Relatore:
Prof.ssa RITA PIZZI
Correlatore:
Dott. ANDREA FANTASIA
Laureando:
ALBERTO REDOLFI
Matricola N. 670379
Anno Accademico 2004 - 2005
INDICE
Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.1 Premessa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2 Morfologia e fisiologia del neurone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3 Ruolo dei microtubuli e dei filamenti di actina nel neurone . . . . . . . . . . . . . 15
1.4 Lo stimolo nervoso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
1.5 Sinapsi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24
1.6 Cosa sono le cellule staminali e perché un loro utilizzo . . . . . . . . . . . . . . . . .28
1.7 Dalle cellule staminali neurali ai neuroni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.1 Dalla fisica classica alla meccanica quantistica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.2 Concetti fondamentali e principi della meccanica quantistica . . . . . . . . . . . . 38
2.3 Modelli quantici cerebrali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
2.4 Fenomenologie fondamentali dei modelli quantici cerebrali . . . . . . . . . . . . . 48
2.5 Teoria orch-OR di R.Penrose e S.Hameroff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56
2.6 Teoria Olonomica di K. Priebram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .67
2.7 Considerazioni riguardo ai Quantum Brain Models. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3. Strumentazione hardware . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
3.1 Set-Up sperimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.2 Prime esperienze d’interfaccia neuroni chip e meccanismi di comunicazione
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74
3.3 Microelectrode array (MEA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80
3.4 Interfaccia delle nostre cellule staminali neurali con dispositivi MEA . . . . . 85
3.5 Schermature elettromagnetiche ed ottiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.6 Emissione impulsi laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.7 Amplificatore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.8 Oscilloscopio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
3.9 Scheda d’acquisizione (NI 6052E DAQ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
3.10 Caratteristiche generali del circuito elettronico per la registrazione . . . . . . 94
3.11 Protocollo esperimenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4. Analisi dei segnali registrati in Matlab / R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .97
4.1 Dai segnali analogici ai segnali digitali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
4.2 Descrizione algoritmo implementato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Visualizzazione del segnale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Analisi del segnale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Determinazione e validazione modello ARIMA cross-correlato . . . . . .139
4.3 Considerazioni finali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .142
4.4 Architettura dell’algoritmo DSP-system mediante schema a blocchi . . . . . 143
5. Risultati ottenuti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
5.1 Premessa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .145
5.2 Problemi riscontrati in fase di registrazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .145
5.3 Registrazioni a vuoto esperimenti IX e X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
5.4 Stimolazione piastra neuroni, seconda piastra neuroni schermata otticamente
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
5.5 Stimolazione piastra neuroni, piastre matrigel e liquido schermate otticamente .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .158
5.6 Stimolazione
piastra
matrigel, piastre neuroni e liquido schermate
otticamente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
5.7 Stimolazione piastra liquido coltura, piastre neuroni e matrigel schermate
otticamente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .174
5.8 Stimolazione piastra neuroni, piastra matrigel e liquido libere da schermatura
ottica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
5.9 Stimolazione piastra matrigel, piastre neuroni e liquido libere da schermatura
ottica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .177
5.10 Stimolazione piastra liquido coltura, piastre neuroni e matrigel liberi da
schermaura ottica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
5.11 Laser schermato da una pellicola a doppio strato di alluminio, cosicché
nessuna emissione possa propagarsi, attivato sopra i neuroni . . . . . . . . . .179
5.12 Laser è portato a 1 metro di distanza, nascosto alla piastra di neuroni, attivato
e diretto in direzione opposta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
5.13 Stimolazione mediante luce LED . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
5.14 Considerazioni. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .183
Conclusioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .185
Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
Introduzione
Introduzione
5
Introduzione
E’ possibile ritenere che i modelli classici fino ad oggi utilizzati per spiegare i
processi cognitivi cerebrali siano parzialmente inadeguati? E’ lecito ricercare strade
alternative per l’interpretazione di taluni processi localizzati all’interno del cervello
umano?
Queste sono le domande che, di recente, vengono poste ai più autorevoli esponenti della
disciplina che studia le funzioni, i meccanismi, e le caratteristiche del sistema nervoso: la
neurofisiologia.
La possibilità di formulare una spiegazione di carattere scientifico dei diversi
processi cognitivi s’affermò nella seconda metà del diciannovesimo secolo con la nascita
della psicofisica. Da questo momento i cultori delle neuroscienze diffusero l’idea che
come tutti i fenomeni biologici anche la mente, intesa come l’insieme delle operazioni
che il sistema nervoso centrale esegue, avesse le proprietà della materia. La ricerca
scientifica ha poi obbligato a determinare una soluzione al problema in termini fisico
riduzionistici, quindi in termini di cellule nervose e circuiti nervosi. Tuttavia, nonostante
si siano fatti numerosi passi in avanti nella comprensione citologica del neurone, dei
meccanismi funzionali alla base della sua attività, ad oggi la comprensione dei processi
cognitivi risulta essere sostanzialmente irrisolta.
L’unico modo per tentar di comprendere la dinamica cerebrale potrebbe essere
quello di cambiare l’usuale approccio classicista nella descrizione del problema. Si
devono abbandonare gli strumenti, le metodologie e il formalismo della fisica classica
tentando di aprire la magica scatola del cervello e della mente umana sfruttando come
chiave la fisica dell’infinitamente piccolo, ovvero, i principi che regolano la meccanica
quantistica. Pertanto, il cervello e tutti i suoi componenti non vengono più considerati
come oggetti che obbediscono alle leggi classiche; bensì come oggetti quantici
macroscopici obbedienti a quelle leggi caratterizzanti la scala di Planck.
L’oggetto di studio della meccanica quantistica è il comportamento della materia
su scale atomiche o inferiori. La fisica quantistica s’è affermata nel panorama scientifico
per il fatto di riuscire a descrivere situazioni che non potevano essere giustificate con
l’ausilio dalla meccanica classica come ad esempio gli spettri a righe, le radiazioni dei
corpi neri, l’effetto fotoelettrico e l’effetto Compton.
6
Introduzione
L’impiego della fisica quantistica nello studio delle dinamiche riguardanti il
cervello umano ha trovato un suo fondamento nel 1984 con gli studi del fisico tedesco
Herbert Fröhlich. Allora, egli affermò che fenomeni di coerenza quantica avrebbero
potuto manifestarsi anche in particolari strutture organiche caratterizzate da temperature
biologiche, da alte energie metaboliche e da particolari proprietà dielettriche, indicando il
cervello come possibile candidato per l’avvento di tali fenomenologie. Da questo
momento in poi si assistette alla diffusione di numerosi quanto differenti modelli quantici
cerebrali da parte di numerosi fisici teorici, neurobiologi e neurofisiologi.
Sebbene le numerose speculazioni fatte a riguardo della teoria quantistica nel
cervello in tutti questi anni distino ancora parecchio dell’essere localizzate in un quadro
chiaro, completo, omogeneo ed articolato, l’utilizzo di tale approccio potrebbe rivelarsi
l’unico strumento per fornire una spiegazione sufficientemente attendibile, rigorosa e
scientifica del funzionamento della mente umana.
Questo lavoro si inserisce in un progetto di ricerca che coinvolge, oltre
all’università degli Studi di Milano, anche il Laboratorio di Cellule Staminali del DIBIT
(Ospedale San Raffaele di Milano) dal quale provengono le coltivazioni delle cellule
staminali neurali umane.
Il presente progetto, utilizzando array planari di microelettrodi (MEA) per la
registrazione elettrofisiologica in vitro del segnale neurale, si pone come obbiettivo
quello di mettere a punto un algoritmo che consenta di processare efficacemente l’ingente
mole di dati raccolti. Il software di indagine, screening ed analisi dei tracciati neurali
implementato si articola in tre parti distinte. La prima, caratterizzata da una fase di scelta
della porzione del segnale da analizzare. La seconda, caratterizzata dall’analisi dei
tracciati neurali sia nel dominio del tempo che nel dominio delle frequenze. La terza,
caratterizzata dall’analisi di serie temporali applicando un modello di autoregressione
integrata a media mobile.
Un metodo ideale di analisi dovrebbe essere rapido, efficace da un punto di vista
computazionale, intuitivo, ben strutturato e meno complesso dei metodi a scopo generale
commercialmente già esistenti.
L’algoritmo descritto in questo lavoro è stato implementato utilizzando due
linguaggi di programmazione ad alto livello: Matlab ed R.
7
Introduzione
Matlab è un ambiente software in cui problemi e soluzioni, vengono espressi mediante
notazioni matematiche, mentre le informazioni sono rappresentate mediante matrici.
Essendo questo un programma sia compilativo che interpretativo le diverse operazioni
d’analisi fisico-matematiche implementate possono essere eseguite in due modi
sostanzialmente differenti: essere tradotte completamente dalla prima all’ultima
istruzione, oppure, essere eseguiti riga per riga sfruttando un’interfaccia interattiva.
R, a differenza di Matlab, è un programma open-source caratterizzato da un ambiente di
lavoro e di sviluppo che consente anch’esso di lavorare interattivamente con i dati. R è
fornito di insiemi di operatori ad alto livello per effettuare calcoli su array e matrici,
supporta paradigmi di programmazione object-oriented e funzionale. Sia Matlab che R, in
definitiva, risultano essere due forti strumenti per l’analisi statistica.
Dalle analisi condotte sugli oltre 750 Mb di dati raccolti sono state evidenziate
caratteristiche difficilmente spiegabili attraverso le usuali teorie classiche; inoltre sono
state notate risposte specifiche ed organizzate a differenti pattern di stimolazioni proposti.
Tuttavia, nonostante questi risultati siano molto suggestivi, affascinanti nonché di grande
interesse nel panorama delle dinamiche cerebrali, il preciso significato fisico e le
implicazioni a livello macroscopico dovranno essere indagate ulteriormente.
Nel primo capitolo, dopo aver presentato una descrizione del neurone da un punto
di vista fisiologico, s’è proceduto nella descrizione delle cellule staminali neurali umane
utilizzate per derivare i neuroni impiegati negli esperimenti condotti.
Il secondo capitolo focalizza dapprima l’attenzione sui diversi principi della fisica
classica impiegati per la descrizione del funzionamento e delle proprietà dei neuroni. In
seguito, vengono descritti i principi fondamentali della fisica dei quanti validi
teoricamente anche a livello cerebrale. Infine, sono esposte le teorie di Stuart Hameroff,
Roger Penrose, Karl Pribram riguardo allo studio delle dinamiche cerebrali sfruttando
differenti nozioni di meccanica quantistica precedentemente esposte.
Nel terzo capitolo, viene descritta la strumentazione hardware necessaria per
l’acquisizione dei segnali neurali da analizzare. Verranno riportati gli esperimenti
condotti in letteratura riguardanti l’interfaccia tra neurone-silicio e la crescita di reti
nervose biologiche coltivate. Particolare attenzione sarà posta alle ricerche svolte presso
il Max Planck Institute di Monaco. Di seguito saranno dettagliatamente trattati anche i
8
Introduzione
restanti strumenti hardware impiegati, ovvero: la scheda di acquisizione “NI 6052E
DAQ” della “National Instruments Society”, il modulo hardware dedicato alla
calibrazione degli impulsi, e infine, la strumentazione per l’invio delle stimolazioni alle
cellule tramite laser ad alta frequenza.
Nel quarto capitolo, è stata quindi effettuata un’esaustiva trattazione
dell’algoritmo creato per la selezione dei file da processare, per la visualizzazione delle
porzioni di segnale di interesse, per il computo delle diverse analisi implementate
spiegando anche il motivo per cui sono state scritte tali procedure.
Il quinto capitolo fornisce una raccolta dei risultati più significativi ottenuti in
seguito alle analisi effettuate.
Al termine, quindi, vengono tratte le conclusioni di questo lavoro.
9
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
1. Aspetti fondamentali
di neurobiologia
10
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
1.1 Premessa
La struttura delle unità operative del cervello, ovvero delle singole cellule nervose, è
relativamente semplice. Sebbene il sistema nervoso dell’uomo contenga un numero
straordinariamente elevato di neuroni (circa 1011), i quali possono venire classificati in un
migliaio di tipologie differenti, tutte le cellule nervose sono riconducibili ad un’unica
architettura di base [Kan&Al03].
1.2 Morfologia e fisiologia del neurone
Da un punto di vista prettamente morfologico le cellule nervose possono essere
suddivise in quattro zone principali: il corpo cellulare, i dendriti, l’assone e le
terminazioni pre-sinaptiche (figura 1). La struttura interna del neurone è qualitativamente
identica a quella di tutti gli altri tipi di cellule: è presente quindi una membrana cellulare
(costituita da due strati di molecole fosfolipidiche), un nucleo (contenente l’informazione
genetica organizzata in cromosomi), un nucleolo (sede di produzione dell’RNA
ribosomiale) e il citoplasma (contenente lisosomi, ribosomi, mitocondri, il complesso di
Golgi e il reticolo endoplasmaico liscio e ruvido).
Il corpo cellulare (soma) è il vero centro metabolico del neurone. Esso ha una
struttura approssimativamente sferica di circa 70 µm di diametro. Dal soma prendono
origine due differenti tipi di processi: numerosi dendriti prevalentemente di breve
estensione, e un lungo processo tubulare denominato assone.
La microscopia elettronica ha rivelato che il contenuto dei dendriti prossimali (grossi
dendriti che non si allontanano molto dal soma) è assai simile a quello del citoplasma
cellulare, rafforzando l’ipotesi secondo la quale i dendriti (e più in generale gli assoni)
costituiscono semplici estensioni del corpo cellulare e non organelli distinti come ad
esempio ciglia e flagelli in alcune cellule. I dendriti, comunque, si protraggono dal corpo
cellulare dei neuroni formando una specie di arborizzazione; inoltre, rappresentano il
principale apparato destinato alla ricezione dei messaggi provenienti da altre cellule
nervose. L’assone, al contrario, si estende dal corpo cellulare per lunghe distanze
rappresentando il principale elemento di conduzione capace di trasmettere messaggi agli
altri neuroni. Un assone può trasmettere segnali elettrici a distanze differenti comprese tra
11
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
0.1 mm e 3 m. I segnali elettrici trasmessi vengono detti potenziali d’azione, questi sono
impulsi nervosi rapidi e transitori con carattere di tutto o nulla [Kan&Al03].
I potenziali d’azione prendono inizio a livello di una zona d’innesco localizzata
all’origine dell’assone detta cono d’emergenza (o segmento iniziale) a partire dalla quale
i potenziali vengono condotti senza decremento né distorsione lungo l’assone, a velocità
variabili fra 1 e 100 m al secondo. L’ampiezza del potenziale d’azione non si modifica
lungo il suo decorso rimanendo sempre costante in quanto esso si rigenera ad intervalli
regolari viaggiando lungo l’assone.
Figura 1: Struttura di un neurone
Per aumentare la velocità con cui vengono condotti i potenziali d’azione gli assoni di
dimensioni maggiori sono circondati da un involucro lipidico isolante di mielina. Questo
involucro è interrotto a intervalli regolari dai nodi di Ranvier ed è appunto a livello di
questi siti privi di rivestimento isolante che si rigenera continuamente l’energia del
potenziale d’azione.
Vicino alla terminazione dell’assone esistono numerose branche mediante le quali
l’assone entra in contatto con altri neuroni. I punti in cui due neuroni entrano in
comunicazione sono noti come sinapsi. La cellula nervosa che trasmette il segnale viene
12
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
detta cellula presinaptica mentre quella che lo riceve è detta cellula postsinaptica. La
cellula presinaptica trasmette i propri segnali a livello di rigonfiamenti specializzati in
prossimità delle ramificazioni terminali dell’assone: questi rigonfiamenti prendono il
nome di terminazioni presinaptiche. In realtà, la cellula presinaptica non entra
anatomicamente in contatto con la cellula postsinaptica in quanto le due cellule sono
separate a questo livello da uno spazio detto fessura sinaptica [Kan&Al03].
Esistono due principi fondamentali riguardanti la funzionalità degli elementi base
del sistema nervoso: il principio della polarizzazione dinamica e il principio della
specificità delle connessioni.
Il primo di questi due principi generali afferma che in ogni neurone i messaggi nervosi
viaggiano sempre in una singola direzione: dalle zone di ricezione del neurone (in
generale dai dendriti e dal corpo cellulare) verso la zona d’innesco, a livello dell’assone.
Da qui il potenziale d’azione si propaga poi unidirezionalmente per tutta la lunghezza
dell’assone fino alle terminazioni presinaptiche.
Il secondo principio afferma invece che le cellule nervose non si connettono
indifferentemente le une alle altre formando reti nervose casuali; ciascuna cellula
stabilisce invece connessioni specifiche a livello di zone specializzate di contatto
solamente con particolari cellule bersaglio postsinaptiche ma non con altre.
La caratteristica che più distingue un neurone da un altro neurone è la sua forma:
in particolare, il numero e il tipo dei processi nervosi che dipartono dal suo corpo
cellulare. A seconda della loro forma, i neuroni vengono classificati in tre grandi gruppi:
unipolari, bipolari e multipolari (figura 2).
I neuroni unipolari costituiscono la classe più semplice di neuroni. Hanno un solo
processo primario, in generale fornito di molte ramificazioni. Una di queste rappresenta
l’assone, mentre le altre servono come strutture dendritiche di ricezione. Le cellule
unipolari sono preponderanti nel sistema nervoso degli invertebrati; nei vertebrati vanno
a formare i gangli del sistema nervoso autonomo.
I neuroni bipolari hanno un corpo ovoidale che dà origine a due processi: un dendrite, che
porta informazioni provenienti dalla periferia del corpo, e un assone, che invia
informazioni al sistema nervoso centrale. Molti neuroni bipolari sono di natura sensitiva,
come ad esempio le cellule bipolari della retina e quelle dell’epitelio olfattivo. Le cellule
13
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
sensitive che portano informazioni tattili, di pressione e dolorifiche al midollo spinale
costituiscono un tipo particolare di cellule dette cellule pseudounipolari. Queste si
sviluppano inizialmente come cellule bipolari; i due processi vanno in seguito incontro a
fusione formando un unico assone che emerge dal corpo cellulare e si suddivide quindi in
due branche: una decorre verso la periferia mentre l’altra entra nel midollo spinale.
I neuroni multipolari predominano nel sistema nervoso dei vertebrati. Queste cellule
hanno un unico assone e una o più branche dendritiche che, in generale, posono nascere
da ogni parte del corpo cellulare. Le forme dei neuroni multipolari possono essere molto
variabili specialmente per ciò che concerne la lunghezza degli assoni e il numero, la
lunghezza e la complessità del loro albero dendritico [Kan&Al03].
Figura 2: Differenti tipologie di cellule nervose: a) neurone unipolare b) neurone bipolare
c) neurone pseudo-unipolare d) tre tipi di neuroni multipolari
14
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
1.3 Ruolo dei microtubuli e dei filamenti di actina nel neurone
Anche il neurone, così come le altre cellule eucariotiche, è caratterizzato da un
denso reticolo di proteine fibrose costituenti il citoscheletro. Il citoscheletro, responsabile
della consistenza gelatinosa del citoplasma, contribuisce su larga scala alla disposizione
ordinata degli organelli citoplasmatici. Come sarà ampiamente trattato in seguito, i
filamenti che costituiscono il citoscheletro, in particolar modo i microtubuli e l’actina,
ricoprono un ruolo di fondamentale importanza anche nei processi di “comunicazione
neurale”. Secondo l’approccio classico invece, questi elementi, assieme ai filamenti
intermedi, sono paragonabili rispettivamente alle travi, ai cavi e ai bulloni che
sostengono, mantengono e danno forma ai neuroni. Per ora, cerchiamo di comprendere
esclusivamente la concezione classica.
I microtubuli (figura 3) hanno un diametro di circa 25 nm, lunghezze variabili di
diversi µm, e sono caratterizzati da una conformazione molto particolare: sono infatti dei
cilindri cavi [Tob&Al98].
Figura 3: Composizione dei microtubuli
Queste strutture possiedono una regione centrale cava circondata da una parte di filamenti
lineari chiamati protofilamenti (in genere 13 per microtubulo, ma occasionalmente il loro
numero può anche aumentare). I microtubuli sono polimeri costituiti da due proteine
globulari simili identificate attraverso studi biochimici. Queste proteine sono chiamate α
e β tubulina. Ogni tubulina ha peso molecolare di 55.000 ed è caratterizzata da circa 450
amminoacidi. Le tubuline α e β si associano spontaneamente in un dimero di peso
molecolare di 110.000 [Tob&Al98] (figura 4).
15
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
Figura 4: sx) Struttura 3D dimero di tubulina dx) Interazione tubuline a formare microtubulo
In condizioni appropriate il dimero si può assemblare in vitro per formare lunghe
strutture che appaiono come i microtubuli osservati nelle cellule. La polimerizzazione in
provetta è stata difficile da ottenere in quanto s’è dovuto scoprire che l’assemblaggio
richiedeva temperature più elevate (37ºC) di quelle usate classicamente negli esperimenti
biochimici (4ºC). Era necessaria, inoltre, la rimozione degli ioni Ca2+ e l’aggiunta di
guanosina-trifosfato (GTP). Una molecola di GTP si lega ad ogni dimero e, in seguito
all’assemblaggio del microtubulo, il GTP viene idrolizzato in guanosina-difosfato (GDP).
I microtubuli hanno una polarità intrinseca, sia se osservati in vitro che in vivo e,
le due estremità vengono indicate plus e minus. I dimeri di tubulina possono essere
aggiunti o rilasciati da entrambe le estremità, ma la crescita è più rapida all’estremità
positiva (effetto treadmilling). Microtubuli che contengono GTP nei dimeri aggiunti di
recente cresceranno più velocemente di quelli con GDP. In un microtubulo in
accrescimento rapido, l’assemblaggio può procedere più rapidamente dell’idrolisi del
GTP a GDP e, quindi, l’estremità positiva può formare un “cappuccio” con numerosi
GTP-dimeri di tubulina. La rimozione del cappuccio del GTP per mezzo di raggi
ultravioletti porta ad un rapido disassemblaggio ed accorciamento dei microtubuli,
mostrando l’importanza funzionale del cappuccio nel determinare la dinamica
dell’accrescimento microtubulare [Tob&Al98].
L’estremità negativa dei microtubuli si origina dal centro di organizzazione dei
microtubuli (MTOC) (figura 5). Nel citoplasma delle cellule degli eucarioti, l’MTOC è
16
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
solitamente situato in una struttura chiamata centrosoma la quale contiene anche un
organello particolare: il cetriolo.
Figura 5: Centro d’organizzazione dei microtubuli
Studi biochimici hanno identificato un certo numero di proteine associate ai
microtubuli (MAP) costituenti più del 10 –15 % della massa totale dei microtubuli.
Queste proteine legandosi ne influenzano la funzione e l’organizzazione. Le MAP
possono essere suddivise in due grandi categorie principali: fibrose e proteine motore. Le
MAP fibrose legano i microtubuli adiacenti in fasci; le MAP proteine-motore (chinesina
e dineina) scorrono invece lungo il filamento in base alla loro differente polarità
svolgendo un’attività di trasporto .
I filamenti di actina invece, di soli 7 nm di diametro, sono gli elementi più
flessibili del citoscheletro. Essi costituiscono una rete subito sotto la superficie cellulare,
formando cavi intrecciati che forniscono un consistente supporto meccanico (figura 6).
Ogni molecola di actina è una proteina globulare costituita da 375 amminoacidi con un
peso molecolare di circa 42.000 [Tob&Al98]. I filamenti di actina vengono
continuamente costruiti e distrutti.
Figura 6: Filamento di actina
17
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
Molecole isolate di actina (chiamate actine G globulari) possono assemblarsi,
anche in provetta, con altre molecole di actina G per formare una doppia elica (chiamata
F filamentosa). Attraverso studi biochimici e microscopici s’è stabilito che una estremità
di questo filamento cresce più rapidamente. Ciò significa che, al terminale positivo, esiste
una probabilità maggiore che avvengano aggiunti monomeri d’actina, mentre al terminale
negativo esiste una maggiore probabilità di perdere monomeri. Ciò comporta che la
polimerizzazione dell’actina tenda a far muovere i filamenti in un’unica direzione.
Ogni monomero di actina può legare una molecola di ATP, che può essere
idrolizzata ad ADP (formando actina-ADP). La velocità di aggiunta di monomeri è
maggiore per l’actina ATP che per l’actina-ADP e quindi, in presenza di ATP, un
filamento di actina cresce molto più rapidamente. Quindi, l’ATP influenza attivamente i
movimenti dei filamenti di actina [Tob&Al98].
Inoltre la polimerizzazione dell’actina è in grado di determinare la trasformazione
del citoplasma da gel a sol e viceversa. In vitro la trasformazione gel-sol si verifica in
presenza di ioni calcio e ATP. In questo processo di transizione giocano un ruolo di
primaria importanza anche due proteine: l’α-actinina e la gelsolina. La prima promuove
la formazione di un gel tridimensionale la seconda invece legandosi all’estremità positiva
consente il passaggio verso lo stato di sol a minor viscosità.
Tutti questi elementi sono peculiarità del citoscheletro, quindi potrebbe apparire
strana la trattazione dei microtubuli e dei microfilamenti in questo capitolo; in realtà, in
seguito verranno messe in evidenza importanti proprietà neuronali influenzate da queste
importanti strutture.
1.4 Lo stimolo nervoso
Lo stimolo nervoso è una variazione della differenza di potenziale elettrico tra
l’interno della cellula nervosa e il liquido extracellulare. A riposo, tutte le cellule, ivi
compreso il neurone, mantengono una certa differenza di potenziale elettrico ai capi della
loro membrana plasmatica, definito potenziale di membrana di riposo. In generale, questa
differenza di potenziale si aggira attorno ai 70 mV. Poiché la carica netta presente
all’esterno della membrana viene arbitrariamente posta pari a zero, si suol dire che il
18
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
potenziale di membrana di riposo di ogni neurone coincida con il valore di –70 mV
[Kan&Al03].
La differenza di potenziale elettrico in una cellula a riposo dipende principalmente
da due fattori:
1)
Dall’ineguale distribuzione degli ioni presenti sulle due facce della
membrana: in particolare dalla presenza degli ioni sodio e potassio carichi
positivamente, e delle proteine e degli amminoacidi carichi negativamente.
2)
Dalla permeabilità selettiva della membrana verso uno solo di questi ioni: il
potassio.
L’ineguale distribuzione degli ioni positivi su ciascun lato della membrana viene
mantenuta da una speciale proteina (pompa sodio-potassio), la quale pompa Na+ fuori
dalla cellula e K+ al sua interno (figura 7).
Figura 7: Pompa Na+-K+
Inoltre, a riposo, la membrana cellulare neurale è selettivamente permeabile agli
ioni K+ in quanto possiede numerosi canali ionici che attraversano la membrana da parte
a parte e sono molto più permeabili al potassio che non al sodio. Quando la cellula è a
riposo questi canali sono aperti e i K+ tendono spontaneamente ad uscire all’esterno.
Man mano che i K+ abbandonano la cellula essi lasciano una nuvola di cariche negative
non neutralizzate, così la carica all’interno risulta essere più negativa che non quella
esterna.
19
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
Tuttavia, una volta che la cellula nervosa viene sottoposta a stimolazione, la
membrana plasmatica della cellula diviene molto più permeabile agli ioni Na+ che ai K+.
L’ingresso del sodio carico positivamente tende a neutralizzare le cariche negative
presenti all’interno della cellula, il che determina una riduzione del potenziale di
membrana, fino ad assumere un potenziale di +30 mV. Tale variazione rigenerativa del
potenziale di membrana viene denominata potenziale d’azione o spike (figura 8).
Figura 8: Potenziale d’azione
La variazione della differenza di potenziale non avviene simultaneamente lungo tutta la
superficie della cellula: essa insorge in prossimità della regione stimolata e da qui si
propaga velocemente, mentre alle sue spalle tutto torna come prima. Perché si possa
manifestare uno potenziale d’azione si deve manifestare un evento depolarizzante di
almeno 15–20 mV, condizione necessaria e sufficiente per permettere il superamento del
potenziale soglia e far insorgere uno spike. Il potenziale d’azione viene condotto lungo
l’assone della cellula fino alle sue terminazioni che sono in rapporto con altri elementi
eccitabili (neuroni o fibbre muscolari), dando inizio ad un processo di comunicazione con
altre cellule. Come già detto in precedenza, il potenziale d’azione è un impulso di tutto o
nulla che si propaga attivamente lungo l’assone in modo tale che la sua ampiezza resti
inalterata fino alle terminazioni periferiche dell’assone stesso. In generale il potenziale
d’azione dura circa un millisecondo, al termine del quale la membrana riacquista le sue
20
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
proprietà di riposo, caratterizzate dalla normale separazione delle cariche e dalla maggior
permeabilità verso ai K+ rispetto ai Na+.
Il meccanismo con cui si genera l’impulso nella cellula nervosa è congegnato in
modo tale da rendere impossibile un variazione dell’ampiezza. L’impulso, dunque, c’è o
non c’è: non è possibile che esso sia più forte o più debole. L’ampiezza fissa dello
stimolo nervoso sembrerebbe una grave limitazione alla possibilità di trasmettere
sfumature intermedie in un messaggio, tuttavia la cellula nervosa aggira l’ostacolo: essa
riesce a modulare il messaggio variando la frequenza dell’impulso anziché la sua
ampiezza. Sostanzialmente quindi, il sistema nervoso trasmette impulsi in modulazione di
frequenza [Kan&Al03].
La cellula nervosa ha sviluppato nel corso della propria evoluzione un raffinato
meccanismo per la conduzione dei segnali a lunga distanza. Il meccanismo è basato
anche su numerose ed importantissime proteine canale, che si possono aprire o chiudere
in risposta a variazioni della differenza di potenziale tra esterno ed interno della cellula.
Queste proteine canale sono denominate “voltage gated channels” (canali regolati dal
voltaggio). Possiamo immaginare tali canali come delle porte caratterizzate da tre
differenti posizioni (figura 9):
chiusa
aperta
chiusa e bloccata
Canale chiuso e
pronto ad aprirsi
Canale aperto
Canale chiuso e bloccato
Figura 9: I tre stati dei “voltage gated channels”
Nella cellula a riposo questi canali sono in posizione chiusa. L’apertura avviene
bruscamente quando la differenza di potenziale si abbassa al di sotto di un certo limite; ad
21
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
essa segue poi automaticamente, dopo un brevissimo tempo, la fase chiusa e bloccata;
infine si ripristina la fase di chiusura. I più importanti canali regolati dal voltaggio sono
quelli che lasciano passare specificamente lo ione sodio, i quali prendono il nome di
canali del sodio. Anche altri canali sono importanti per la propagazione dello stimolo ma
la loro trattazione esula dallo scopo di questa tesi.
E’ stato osservato che con un breve impulso di corrente elettrica sia possibile
annullare momentaneamente il potenziale di riposo in una zona molto ristretta di una
fibra nervosa, cioè provocare una depolarizzazione. La depolarizzazione causa l’apertura
dei canali del sodio nella zona in cui è stata immessa la corrente. Di conseguenza, il sodio
entra rapidamente sotto una doppia spinta: la differenza di concentrazione (maggiore
all’esterno) e la differenza di potenziale elettrico (l’interno della fibra è infatti più
negativo e quindi l’ingresso dello ione Na+, carico positivamente, è facilitato). In seguito
all’ingresso del sodio, la differenza del potenziale prima si annulla e poi si inverte, cioè
l’interno dell’assone diventa più positivo rispetto all’esterno. Si è generato così un
potenziale d’azione. Dopo un tempo brevissimo, dell’ordine di qualche millisecondo, i
canali per il sodio si chiudono e la pompa Na+-K+ ripristina il potenziale di riposo, ma
intanto la depolarizzazione provocata dall’entrata del sodio ha fatto aprire altri canali per
il sodio più lontani dallo stimolo. Il potenziale dazione si lascia dietro una zona
temporaneamente insensibile ad un altro stimolo, poiché i canali del sodio, una volta
chiusi, restano bloccati fino a che non si è ripristinato il potenziale di riposo, mentre nella
zona non attraversata dalla perturbazione essi sono pronti ad aprirsi. In tal modo la
perturbazione può allontanarsi dal punto di origine ma non può tornare indietro. Tutto il
ciclo: stimolazione – scatenamento del potenziale d’azione – preparazione per una nuova
stimolazione dura pochi millesimi di secondo (figura 10).
Nelle fibre avvolte da guaina mielinica la conduzione avviene in modo un po’
diverso. I canali del sodio sono tutti concentrati nei nodi di Ranvier. La depolarizzazione
si propaga lateralmente nelle zone coperte dalla guaina, perdendo gradualmente di
intensità. La depolarizzazione iniziata in un nodo è dunque diminuita al nodo successivo
ma è ancora sufficiente per far aprire i canali del sodio. Abbiamo dunque due fasi nella
propagazione: una passiva da un nodo all’altro, ed una attiva nei nodi. Questo tipo di
22
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
conduzione è più efficiente rispetto a quella delle fibre senza mielina, in cui i canali di
sodio sono sparsi dappertutto.
Figura 10: Propagazione dello stimolo nervoso
In conclusione i principali protagonisti del meccanismo di conduzione sono la
pompa sodio-potassio e i “voltage gated channels”. Questi ultimi permettono alla
perturbazione di propagarsi con rapidità esplosiva senza attenuazioni lungo il percorso.
Infatti la loro apertura non è proporzionale al grado di depolarizzazione: è sufficiente che
essa superi un certo valore minimo per farli spalancare completamente. Ciò spiega il
carattere tutto o nulla dello stimolo nervoso. E’ la pompa sodio potassio che crea la
differenza tra concentrazioni interne ed esterne di ioni, tipica della cellula a riposo,
ridotta poi dai potenziali d’azione. Si potrebbe paragonare questo fenomeno alla carica di
una batteria che viene gradualmente scaricata dai potenziali d’azione: la pompa tuttavia
lavora senza sosta per ricaricare la batteria, riportando la concentrazione degli ioni ai
valori originari.
23
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
1.5 Sinapsi
I neuroni sono in contatto l’uno con l’altro per poter trasmettere l'impulso nervoso. I
punti di giunzione tra i prolungamenti delle cellule nervose vengono denominati
“sinapsi”, parola di origine greca il cui significato può essere tradotto col termine di
“collegamento”.
Un neurone può formare circa 1.000 connessioni sinaptiche e riceverne anche in
numero maggiore, probabilmente intorno a 10.000, e addirittura, le cellule del Purkinje
del cervelletto ricevono fino a 100.000 connessioni. Classicamente tutti i neuroni fanno
uso soltanto di due meccanismi fondamentali di trasmissione sinaptica: la trasmissione
elettrica e la trasmissione chimica.
Nel sistema nervoso la trasmissione elettrica avviene in maniera rapida e piuttosto
stereotipata. Le sinapsi elettriche servono, anzitutto, per inviare segnali depolarizzanti
semplici; esse non consentono in prima istanza l’invio di messaggi inibitori e non
determinano variazioni di lunga durata delle proprietà elettriche delle cellule
postsinaptiche. Al contrario, le sinapsi chimiche sono più duttili e tendono a produrre
comportamenti più complessi. Le sinapsi chimiche evocano sia risposte eccitatorie che
inibitorie nelle cellule postsinaptiche e vi possono indurre modificazioni dello stato
elettrico di durata variabile da qualche millisecondo a molti minuti. Di particolare
importanza appare la loro capacità di amplificare i segnali neurali, facendo sì che anche
una piccola terminazione presinaptica possa modificare la risposta di una cellula
postsinaptica di grandi dimensioni. Per capire come funzionano questi due tipi di sinapsi
è indispensabile conoscerne la struttura (figura 11).
Figura 11: sx) Sinapsi elettrica dx) Sinapsi chimica
24
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
In tabella 1 vengono di seguito riassunte e messe a confronto le differenti
proprietà caratterizzanti i due tipi di sinapsi: elettriche e chimiche [Kan&Al03].
Tabella 1: Caratteristiche delle sinapsi elettriche e chimiche
Le sinapsi elettriche rappresentano l’accoppiamento elettrico diretto tra le
giunzioni comunicanti e vengono definite per mezzo di connessioni specializzate a bassa
resistenza elettrica denominate “gap junction”. Questi tipi di sinapsi si rinvengono in
diverse zone del sistema nervoso di vertebrati ed invertebrati e consistono,
essenzialmente, nella giustapposizione delle due membrane delle cellule che devono
essere in comunicazione, separate da uno spazio di soli 2-4 nm. Tale giunzione permette
il passaggio bidirezionale di ioni di piccole molecole (dell’ordine di 300 – 1.500 dalton).
Questo spazio è attraversato da speciali strutture proteiche, i canali delle giunzioni
comunicanti, che sono composti ognuno da due emicanali (connessoni), uno dei quali
appartiene alla cellula presinaptica e l’altro a quella postsinaptica. Ogni connessone è
formato, a sua volta, da sei subunità proteiche identiche chiamate connessine (figura 11
sx). Il grosso vantaggio evolutivo delle sinapsi elettriche è il fatto che la trasmissione si
verifica senza alcun ritardo evidente. Tuttavia queste sinapsi non offrono come già detto
la regolazione e il controllo assicurati dalle sinapsi chimiche, cui si deve la maggior parte
dei collegamenti che coinvolgono i neuroni.
Il principio base della comunicazione chimica risiede nel fatto che la cellula
presinaptica o sorgente rilasci (previa apertura dei canali del calcio in seguito allo stimolo
depolarizzante) per esocitosi nel mezzo extracellulare un messaggero chimico destinato a
25
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
legarsi ai recettori di membrana della cellula postsinaptica. Il messaggero chimico è detto
neurotrasmettitore, il cui percorso attraverso lo spazio intersinaptico è coperto per
diffusione e non supera la frazione dei micrometri. La sinapsi chimica può essere definita
come un aggregato di strutture, nella quale sono incluse: la terminazione assonica; la
membrana dendritica o postsinaptica immediatamente adiacente; e lo spazio separante la
terminazione assonica dal dendrite, detta fessura intersinaptica. La terminazione assonica
adiacente allo spazio intersinaptico, è chiamata membrana presinaptica, in relazione alla
sua controparte dendritica. In prossimità della membrana presinaptica la sinapsi chimica
presenta specializzazioni di membrana e numerose vescicole di forma ellissoidale o
sferica. Queste vescicole sinaptiche sono quelle che contengono il neurotrasmettitore che
deve essere rilasciato (figura 11 dx).
Quando un potenziale d’azione giunge in prossimità della terminazione assonica
si ha inizio ad una sequenza di eventi che determinano una variazione caratteristica nel
potenziale della cellula postsinaptica (PSP o Potenziale Post Sinaptico). Con un certo
ritardo, la depolarizzazione della terminazione assonica produce il rilascio del
neurotrasmettitore, il quale diffonde rapidamente nello spazio intersinaptico e interagisce
con la membrana postsinaptica. Non tutte le molecole di neurotrasmettitore giungono a
destinazione, in quanto alcune si perderanno per diffusione nell’ambiente cellulare o
saranno distrutte da enzimi specifici. La diversità di recettore a cui un neurotrasmettitore
può legarsi dà luogo ad effetti che si instaurano rapidamente e durano poco, oppure
possono insorgere e durare più a lungo. Il primo tipo è mediato da recettori che si
comportano da canali ionici a sbarramento (tipo a controllo di ligando): in tal caso
l’associazione recettore-neurotrasmettitore provoca un istantaneo flusso ionico attraverso
la membrana della cellula postsinaptica. Poi vi sono dei neurotrasmettitori che agiscono
su scale di tempo più lunghe, agendo come ormoni o mediatori chimici locali: per
esempio si associano con recettori a loro volta accoppiati con enzimi e producono
variazioni prolungate di conduttanza postsinaptica, alterando la concentrazione di un
secondo messaggero intracellulare. Quindi, le sinapsi possono anche rispondere in
relazione a diverse scale temporali consentendo ad una rete biologica di processare le
informazioni adeguatamente. In natura esistono due tipi di sinapsi chimiche: le sinapsi
inibitorie (IS), che tendono a iperpolarizzare la membrana cellulare attraverso la
26
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
generazione di un Potenziale Post Sinaptico Inibitorio (IPSP) e le sinapsi eccitatorie (ES),
che a differenza delle precedenti causano una depolarizzazione locale della membrana
per mezzo della generazione di un Potenziale Post Sinaptico Eccitatorio (EPSP). Un
tipico EPSP determina una depolarizzazione di circa 0,5mV, molto inferiore ai 15-20 mV
richiesti per raggiungere il potenziale soglia e innescare il potenziale d’azione; tuttavia,
singoli EPSP possono combinarsi tra loro e permettere di ottenere risposte eccitatorie,
esistono infatti due importanti principi che risultano essere spesso verificati:
sommazione temporale : si verifica quando a livello di una singola sinapsi,
arriva un secondo EPSP prima che gli effetti del primo siano scomparsi.
sommazione spaziale: effetti cumulativi di più bottoni sinaptici.
È spesso possibile che si verifichino contemporaneamente, nella stessa porzione di
membrana cellulare, diversi EPSP e IPSP. Infatti, in ogni momento, le attività dei singoli
neuroni riflettono un loro costante bilanciamento. La natura eccitatoria o inibitoria di una
sinapsi è infine determinata dalla particolare specie di neurotrasmettitore con cui il
recettore sinaptico interagisce. Infatti nel caso di una ES l’interazione del
neurotrasmettitore con i siti recettori di membrana provoca l’apertura dei canali del sodio
e del potassio (Na+/K+). Tuttavia, poiché la corrente entrante del sodio è molto più grande
di quella del potassio, l’effetto risultante sul potenziale di membrana è una
depolarizzazione (da qui la denominazione di sinapsi eccitatoria). A differenza delle ES,
le IS provocano l’apertura dei canali (Cl-) e del potassio (K+). L’effetto risultante,
provocato dalla corrente del cloro e dalla corrente uscente del potassio, è una
iperpolarizzazione locale della membrana.
Recenti studi hanno messo anche in luce un legame curioso esistente tra l’azione di
uno stimolo e l’efficacia delle connessione sinaptiche [Kan&Al03]. In questi studi si è
visto che questa relazione varia se lo stimolo è somministrato ripetutamente. Questo
legame tra stimolo ed efficacia sinaptica è considerata la base di partenza per costruire
una teoria dell’apprendimento. A tale proposito ha notevole rilevanza l’ipotesi di Hebb
secondo la quale, se un neurone A ed un neurone B tendono ripetutamente ad essere
eccitati simultaneamente, questa concordanza di fase induce ad un aumento delle sinapsi
tra A e B (si dice che la sinapsi venga rafforzata). Secondo questa ipotesi solo la
27
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
correlazione tra l’attività corrispettiva di due neuroni è responsabile del rinforzo delle
sinapsi tra i due.
Torniamo ora alla base dei meccanismi di funzionamento stanti alla base delle sinapsi
chimiche e descriviamo rapidamente le differenti tipologie di neurotrasmettitore esistenti
che di fatto sono utilizzate per trasdurre i diversi segnali neuronali. Il neurotrasmettitore
più diffuso è certamente l’acetilcolina, utilizzato da tutti gli assoni motori del midollo
spinale. E’ anche il trasmettitore di tutti i neuroni autonomi pregangliari e delle fibre
parasimpatiche. Oltre a questo, nel gruppo delle amine biogene vanno citate anche
l’acetilcolina, l’adrenalina e la noradrenalina, facenti tutte parti del sottogruppo delle
catecolammine; infine, ricordiamo anche la serotonina nonché l’istamina.
Tra i neurotrasmettitori eccitatori è bene ricordare l’acido glutammico e l’acido aspartico.
La glicina, invece, è un amminoacido semplice che svolge
il compito di
neurotrasmettitore inibitorio così come l’acido γ–amminobutirrico (GABA).
In sostanza, quindi, la conduzione lungo la fibra nervosa e quella attraverso le sinapsi
sono profondamente differenti fra di loro. Nella fibra nervosa si propaga un segnale
elettrico che, a livello delle sinapsi, viene trasformato in un segnale chimico (rilascio del
neurotrasmettitore). Al di là delle sinapsi, successivamente, il segnale chimico ridiventa
nuovamente un segnale elettrico in seguito a depolarizzazione o iperpolarizzazione.
1.6 Cosa sono le cellule staminali e perché un loro utilizzo
Le cellule staminali sono cellule primitive, non specializzate, dotate della singolare
capacità di assumere qualunque tipologia di cellula del corpo dell’organismo considerato.
Le cellule staminali (SC) sono quindi elementi indifferenziati che fungono da eventuale
riserva per i differenti precursori dei tessuti. Giocano un ruolo omeostatico essenziale
rimpiazzando cellule di tessuto morte o distrutte a causa di traumi o malattie.
Esistono tre classi principali di cellule staminali:
1)
Unipotenti: quando possono dare origine ad un solo tipo di cellula. Ad
esempio, nel midollo osseo esistono cellule staminali che sono in grado di dare
origine solo ai globuli rossi e non ai globuli bianchi.
28
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
2)
Multipotenti (o Pluripotenti): quando possono dare origine a più tipi di cellule.
Sempre nel midollo osseo, esistono delle staminali da cui originano più tipi di
staminali unipotenti (per esempio, quelle che danno origine ai globuli rossi e
quelle per i vari tipi di globuli bianchi)
3)
Totipotenti: quando danno origine a tutte le possibili cellule di un determinato
organismo. Attualmente è noto che solo le cellule che compongono l’embrione
ai primi stadi di vita (cellule staminali embrionali) possiedono questa capacità.
La differenza tra queste cellule risiede nel differente grado di specializzazione. Infatti,
prima che una cellula diventi adulta e maturi, deve passare attraverso fasi diverse di
specializzazione. Perciò, le cellule staminali totipotenti danno origine a più cellule
multipotenti, ciascuna delle quale dà origine a determinate cellule unipotenti che, infine,
producono le cellule adulte.
Le cellule staminali si classificano anche in base alla loro provenienza in:
SC embrionali: sono ottenute a mezzo di coltura, ricavate dalle cellule interne di
una blastocisti, ovvero un embrione non ancora cresciuto sopra le 150 cellule.
Una volta isolate da blastocisti possono essere cresciute in vitro. In seguito,
possono differenziarsi in diversi tipi cellulari senza causare problemi. Sono
cellule dotate di una elevata capacità proliferativa e possono dare origine a tutti i
tipi cellulari di un organismo.
SC fetali: cellule staminali derivanti da aborti spontanei, possiedono
caratteristiche intermedie fra quelle embrionali e quelle adulte.
SC adulte: sono cellule non specializzate reperibili tra cellule specializzate di un
tessuto specifico e sono prevalentemente multipotenti. Questi tipi di cellule sono
già oggi utilizzate in cure per oltre cento malattie e patologie. Sono dette più
propriamente somatiche (dal Greco σωµα sōma = corpo), perché non provengono
necessariamente da adulti ma anche da bambini o da sangue placentare.
Recentemente, alcuni ricercatori della New York University School of Medicine
hanno avanzato un’interessante ipotesi secondo la quale questi tipi di SC risultino
essere più versatili rispetto ad altre cellule staminali. Infine, le SC adulte sono
localizzabili in generale in tutto il corpo d’un organismo.
29
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
SC derivate da cordone ombelicale e midollo osseo: Il sangue residuo della
placenta e del cordone ombelicale costituisce una fonte di cellule staminali
emopoietiche adulte. Le cellule staminali da cordone ombelicale sono oggi
impiegate per curare il morbo di Gunther, la sindrome di Hunter, la sindrome di
Hurler e la leucemia linfocitica acuta. Alcuni medici statunitensi hanno anche
identificato possibili cellule staminali provenienti dal midollo osseo di un adulto.
Qualsiasi cellula staminale è caratterizzata inoltre da quattro proprietà funzionali
fondamentali (figura 12):
Stato indifferenziato (assenza di marcatori di lineage).
Proliferazione (variazione ciclica dei prodotti genici).
Capacità di automantenimento (generazione di almeno una cellula staminali ad
ogni divisione cellulare).
Multipotenzialità
(capacità
di
generare
una
progenie
funzionalmente
differenziata).
Figura 12: Proprietà delle cellule staminali
Il primo carattere distintivo delle SC, comune a tutti i tipi di staminali, è il loro
stato altamente indifferenziato. Questo significa che non possiedono le caratteristiche
30
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
morfologiche, strutturali, molecolari o antigeniche che si ritrovano nelle cellule
differenziate dei tessuti a cui appartengono [Gal&Al03].
La seconda caratteristica delle cellule staminali è la variazione ciclica dei prodotti
genici in seguito ad attività proliferativa. Infatti da una cellula staminale possono
originarsi cellule figlie con proprietà anche differenti. Esistono tre diversi meccanismi a
cui una SC può andare incontro in fase di proliferazione. Se vengono generate due cellule
con lo stesso fenotipo, uguale a quello della cellula di origine, la divisione é detta
“simmetrica proliferativa”. Se le due cellule figlie hanno tra loro fenotipo diverso, si
parla di “divisione asimmetrica”. Se, invece, le due cellule figlie hanno uguale fenotipo
tra di loro, ma fenotipo differente dalla cellula staminale progenitrice si parla allora di
“divisione simmetrica differenziativa” (figura 13) [Gal&Al03].
Figura 13: Meccanismi di proliferazione cellule staminali
La terza caratteristica è l’automantenimento delle SC. L'automantenimento
sottintende la capacità di una singola cellula, o di una popolazione cellulare, di perpetuare
se stessa. In molti casi il periodo di automantenimento si estende per tutta la vita
dell’organismo; inoltre, in vitro in opportune condizioni sperimentali, può permanere in
maniera illimitata.
Il meccanismo che consente tutto questo è di tipo deterministico il quale permette il
raggiungimento di uno “steady state”: ovvero uno stato dove metà delle cellule figlie
mantengono proprietà staminali, mentre l’altra metà differenzia lasciando il
compartimento staminali [Gal&Al03].
31
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
La quarta ed ultima caratteristica fondamentale delle cellule staminali è la
multipotenzialità, in altre parole, la capacità di dare luogo a una progenie differenziata
comprendente tutti i tipi cellulari del tessuto di residenza o, nel caso delle embrionali, a
tutte le cellule dell’organismo adulto. La formazione di cellule differenziate a partire da
cellule staminali avviene dando origine a cellule intermedie che costituiscono il
cosiddetto compartimento dei progenitori di transito, cellule più differenziate rispetto alle
staminali ma che mantengono la capacità di proliferare per un numero limitato e
predeterminato di cicli mitotici, generando alla fine un elevato numero di cellule
differenziate. Così, da una singola divisione di una cellula staminale, grazie al
compartimento di transito, vengono generate numerosissime cellule differenziate. Tale
meccanismo consente la produzione di un consistente numero di cellule mature a fronte
di un numero di divisioni di cellule staminali ridotto [Gal&Al03].
La scelta dell’impiego di cellule staminali neurali, negli esperimenti descritti di
seguito, è contestualizzabile considerando il fatto che è possibile ottenere un gran numero
di cellule neurali umane differenziate a partire da una singola cellula staminale umana.
Ciò permette di approfondire, anche in maniera iterativa, aspetti che di volta in volta
emergono dall’analisi dei dati. Inoltre, costituisce un sistema modello piuttosto stabile
[Gri&Al00]. In questo modo possiamo studiare reti nervose “self-made” che presentino
caratteristiche ad hoc, ottenendo conseguentemente risultati più mirati, significativi e
maggiormente contestualizzabili rispetto a quelli che si otterrebbero analizzando delle
“brain-slice”. Infine, con quest’approccio, è anche in teoria possibile monitorare la
risposta di cellule neurali in differenti fasi e momenti del loro processo di maturazione.
1.7 Dalle cellule staminali neurali ai neuroni
Negli ultimi anni anche nella zona cerebrale, così come in altre regioni del corpo
umano, sono state individuate cellule precursori indifferenziate, mitoticamente attive e
multipotenti, in grado di rigenerare sia neuroni che cellule gliali. Le localizzazioni
principali di queste cellule staminali del sistema nervoso centrale adulto sono: zona
periventricolare (cellule epindimali, cellule gliali), giro dentato dell’ippocampo, ed
estensione rostrale dei ventricoli laterali [Gri&Al01] (figura 14).
32
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
Figura 14: Localizzazione NSC: dx) Estensione rostrale ventricoli laterali sx) Giro dentato ippocampo
E’ stato dimostrato che cellule staminali neurali umane, come quelle sopra descritte,
possono essere ricavate anche dal diencefalo umano di feti abortivi di 10,5 settimane
[Ves&Al99]. Analisi clonali hanno dimostrato la capacità di automantenimento, e la
multipotenzialità di queste cellule a dare neuroni, oligodendrociti ed astrociti.
Grazie a numerosi esperimenti e ricerche effettuate è stato possibile sviluppate
metodologie che consentano a queste SC di espandersi e maturare in vitro. Infatti, una
volta isolate, utilizzando i fattori trofici FGF2 (fibroblast growth factor 2 o bFGF) ed
EGF (epidermal growth factor), è possibile ottenere la crescita delle corrispettive colture
cellulari. La proliferazione avviene in maniera particolare, in quanto dopo 7-8 giorni di
coltura, da una singola cellula staminale neurale (NSC), si ottiene una particolare
struttura chiamata neurosfera (figura 15) formata da tutte e tre le forme cellulari.
Figura 15: Neurosfere
Nelle neurosfere le NSC tuttavia sono presenti solo tra il 10 e il 50%. Più precisamente,
all’interno della sfera troviamo cellule differenziate, mentre nelle parti esterne troviamo
33
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
via via cellule indifferenziate per arrivare allo strato più esterno che è composto
principalmente da NSC. Per aumentare il numero di cellule staminali neurali nel mezzo di
coltura viene allora praticata una subcoltura, ovvero un’operazione che consiste nella
dissociazione meccanica delle neurosfere precedentemente formatesi. Così facendo, le
cellule differenziate o in via di differenziamento muoiono, mentre le NSC continuano a
vivere e a proliferare generando sfere secondarie che a loro volta subiranno
successivamente un nuovo trattamento di “subculturing”. Tale procedura può essere
ripetuta molte volte, fino al raggiungimento del numero voluto di NSC [Gri&Al01].
Inoltre, mantenendo nel medium di coltura FGF2 ed EGF si causerà la morte di tutte le
cellule non staminali, mentre le NSC continueranno a proliferare attivamente. Reiterando
più volte questa serie di passaggi è possibile creare un vero e proprio stock di NSC che
dovrà essere quindi congelato a – 80 ºC in DMSO ed essere trasferito poi in azoto
liquido. Per completare il procedimento di maturazione delle NCS bisogna dapprima
aggiungere nel mezzo di coltura l’NGF (nerve growth factor), procedere poi ad una
completa rimozione di tutti i fattori trofici utilizzati, ed arricchire infine il tutto con un
medium di controllo contenente FCS (fetal calf serum) al 2% che permetta così
un’efficace generazione di neuroni, di astroglia, e infine, di oligodentrociti (figura 16).
Figura 16: Schema riassuntivo del meccanismo di maturazione delle NSC
34
1. Aspetti fondamentali di neurobiologia
Per aumentare e migliorare la crescita delle cellule staminali neurali sui MEA possono
essere utilizzati anche altri fattori di crescita oltre ai bFGF e EGF. Solitamente vengono
quindi anche impiegati il GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) perché è in
grado di prevenire l’apoptosi neuronale e migliorare la crescita di assoni e dendriti; il
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) considerato essere fondamentale per la
sopravvivenza e il differenziamento neuronale in vitro; ed infine il CTNF (ciliary
neurotrophic factor) che è in grado di aumentare la proliferazione, l’attività metabolica e
riduce lo stress da differenziamento. Spesso, alternativamente al FGF2 o al BDNF, viene
anche utilizzato il LIF (leucemia inihibitory factor).
In definitiva, è bene sottolineare ancora una volta che queste cellule staminali
neurali oggi rappresentano un importantissimo strumento per la ricerca in campo medico
scientifico, rappresentando, come visto, una sorgente continua e rinnovabile di neuroni e
glia, essendo coltivabili per lunghi periodi senza perdita di stabilità genetica, e
soprattutto, essendo oggi disponibili potenzialmente in notevoli quantità.
35
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
2. Ruolo della Fisica
Quantistica nei
modelli cerebrali
36
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
2.1 Dalla fisica classica alla meccanica quantistica
Fin dalla fine del diciannovesimo secolo i primi tentativi compiuti per descrivere
le proprietà funzionali dei neuroni sfruttavano i principi “cardini” cari alla fisica
classica.
Questo modo di procedere portò in maniera efficiente alla descrizione delle
proprietà funzionali del neurone delineando modelli fisico-matematici di volta in volta
sempre più precisi ed accurati, come ad esempio quello del “circuito equivalente”. In
questo modello tutte le proprietà del neurone possono essere descritte da un circuito
elettrico formato soltanto da elementi conduttori e resistori (rappresentanti i canali
ionici), da batterie (che rappresentano i gradienti ionici di concentrazione degli ioni
considerati) e da condensatori (che rappresentano la capacità della membrana di custodire
cariche elettriche). Questi modelli permettono una comprensione intuitiva e una buona
descrizione quantitativa dei diversi flussi di corrente, dovuti al movimento degli ioni, che
danno origine ai caratteristici segnali elettrici neurali.
Tuttavia, la fisica classica è una chiave di lettura sufficiente a fornire esclusivamente una
spiegazione dei meccanismi caratterizzanti la materia cerebrale ma non alla
comprensione e alla caratterizzazione dei processi cognitivi che sono, per così dire, ad un
livello più alto. Ad oggi, infatti, nonostante siano ben chiare le caratteristiche funzionali
dei singoli neuroni, non è stato ancora chiarito quali siano i meccanismi alla base dei
processi mentali.
Il punto nodale è che la fisica classica, non considerando tutti gli eventi
caratterizzanti la scala del micro-mondo, ovvero della scala di Planck, non è
potenzialmente in grado di fornirci una visione completa delle dinamiche cerebrali.
Secondo molti neurobiologi e neurofisiologi che invece hanno accettato l’idea di
impiegare la meccanica quantistica per lo studio della microstruttura del cervello, l’idea
di continuare a perpetrare la fisica classica per la spiegazione della mente equivarrebbe
ad organizzare un viaggio sulla luna in base alla concezione Aristotelica, trascurando
appieno la teoria della gravitazione universale.
Ovviamente il passaggio da una fisica classica ad una fisica quantistica, non
smentisce affatto ciò che fino ad oggi è stato dimostrato essere valido a livello neurale,
poiché, come sappiamo, tutto ciò che è vero a livello macroscopico è valido anche a
37
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
livello quantistico. Infatti, le leggi che regolano il mondo macroscopico risultano essere
casi particolari, derivabili dalle leggi del mondo microscopico. Invece, le specifiche leggi
macroscopiche della fisica newtoniana non possono essere sfruttate per spiegare il mondo
dell’infinitamente piccolo. Quindi per ottenere una descrizione cerebrale a questo livello
è necessario rifarsi ai principi della fisica quantistica, tenendo ben presente però che a
questo livello molte cose sono difficilmente comprensibili in maniera intuitiva, pertanto
sarà necessario introdurre anche un rigoroso formalismo matematico.
2.2 Concetti fondamentali e principi della meccanica quantistica
La meccanica quantistica è una teoria fisica formulata nella prima metà del
ventesimo secolo, la quale descrive il comportamento della materia su scala atomica e
sub-atomica. Intorno a questo periodo, si dovette quindi abbandonare la classica teoria
Newtoniana per passare all’indagine e alla scoperta dell’universo microscopico. Questo
passaggio aprì in fisica un’immensa voragine teorica in quanto evidenze sperimentali
dimostravano che i fenomeni microscopici obbedivano a leggi nuove e diverse da quelle
della fisica classica, con le quali a lungo si era pensato di poter spiegare tutta la realtà
fisica.
La meccanica quantistica riusciva infatti brillantemente a spiegare e a quantificare
due effetti che non potevano essere giustificati dalla teoria classica in alcun modo,
ovvero:
I valori di determinate grandezze caratterizzanti un sistema, ad esempio l’energia,
non potevano assumere un qualsiasi valore su una scala continua, ma
esclusivamente valori discreti. Il minimo salto fu chiamato quanto.
Le particelle materiali esibivano anche proprietà ondulatorie (dualità ondacorpuscolo).
Se in meccanica classica lo stato di un sistema è definito attraverso il valore esatto
delle sue variabili (lagrangiane), in meccanica quantistica invece lo stato di un sistema è
descritto tramite una funzione d’onda (Ψ) il cui modulo quadro fornisce le distribuzioni di
probabilità di tutte le proprietà misurabili, ovvero delle osservabili del sistema studiato:
38
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
| Ψ| 2 ≡ Ψ *Ψ(x,y,z,px,py,pz,t)
La grandezza |Ψ|2 esprime la probabilità che al tempo t il sistema descritto da Ψ sia
caratterizzato dalle coordinate spaziali x, y, z, e dalle quantità di moto px, py, pz.
In accodo con l’interpretazione “ortodossa”, alla funzione d’onda (Ψ) non viene
attribuito nessun significato di “grandezza fisica”. Essa non ha niente in comune né con
onde elettromagnetiche né con qualsiasi altro tipo di onda. Al contrario, essa
costituirebbe una vera e propria “onda di conoscenza”, ovvero un’entità matematica che
racchiude in sé tutte le informazioni sul sistema preso in esame [Oli96].
La funzione d’onda che descrive lo stato del sistema può cambiare al passare del
tempo, l’evoluzione temporale della funzione d’onda (Ψ) è descritta dall’equazione di
Schroedinger:
⎡ h2 ⎛ ∂2
∂
∂2
⎜
+ 2 + 2
⎢−
2
⎜
∂z
∂y
⎣ 2m ⎝ ∂x
⎤
⎞
⎟⎟ + V ⎥ψ = Eψ
⎠
⎦
dove:
-
Le parentesi quadre racchiudono l’operatore Hamiltoniano (ℋ), ovvero un
insieme di operazioni matematiche in grado di esprimere l’energia totale del
sistema.
-
m è la massa della particella descritta.
-
h è pari ad “h/2π”, dove h è la costante di Planck pari a 6,625 * 10-34 [J*s].
-
E e V sono rispettivamente l’energia totale e l’energia potenziale della particella
considerata.
L’equazione di Schroedinger può anche essere scritta in una forma più compatta, del tutto
analoga alla precedente, definita equazione di Schroedinger degli stati stazionari:
ℋ Ψ=EΨ
Dato un sistema conservativo in uno stato stazionario, cioè con energia costante E
composta dalla somma di energia cinetica e di energia potenziale V conservativa, ad esso
è associata una funzione d’onda Ψ caratterizzata da frequenza v costante; inoltre,
39
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
l’energia di questo sistema sarà ricavabile applicando a Ψ un insieme di operazioni
costituenti l’operatore Hamiltoniano ℋ [Oli96].
In fisica quantistica, un altro aspetto molto differente rispetto alla visione
classicista è quello di non poter prevedere a priori alcun risultato fino a quando
l’osservatore, il quale gioca un ruolo di fondamentale importanza nella meccanica dei
quanti, non compie una misura perturbando conseguentemente il sistema di studio.
Secondo l’interpretazione di Copenaghen quando viene effettuata una misura di un
osservabile (espresso tramite un operatore Hermitiano lineare), la parte di funzione
d’onda pertinente a quell’osservabile collassa, “portando” ad una funzione d’onda che
fornisce la massima probabilità al valore ottenuto in quella misurazione (passaggio da un
evento probabile ad un evento certo, da una sovrapposizione di stati tutti ugualmente
possibili ad un unico stato). Ciò è spiegabile dal fatto che la misura, una volta effettuata,
perturba il sistema. Il sistema si troverà nello stato in cui lo ha lasciato lo strumento di
misurazione (evoluzione temporale a parte). Tale stato è anche chiamato autostato
dell’osservabile misurato. Ad esempio, considerando una generica particella che si
muove liberamente nello spazio con certe distribuzioni di probabilità sia per la posizione
che per la velocità. Supponiamo di determinarne la sua posizione, ottenendo un certo
specifico valore x. Allora in quell’istante, la funzione d’onda è collassata in un punto,
fornendo a quel punto una probabilità certa che è quella misurata.
Questa è una delle tante possibili interpretazioni del collasso della funzione d’onda. Ne
esistono tuttavia molte altre, ciascuna delle quali anti-intuitiva ma matematicamente
consistente.
I principi cardini della meccanica quantistica sono molti, e molto spesso
sconvolgono, ma solo in apparenza, le più consolidate certezze dell’esperienza
quotidiana. Di seguito vengono riportati quei principi che risultano esser validi e che sono
alla base dei modelli quantistici riguardanti il funzionamento del cervello (Quantum
Brain Model).
Principio di indeterminazione di Heisenberg:
Esistono coppie di grandezze, a livello sub-atomico, che non possono venire misurate
contemporaneamente con la necessaria precisione; anzi, la precisione di misura dell’una è
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2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
inversamente proporzionale alla precisione di misura dell’altra [Dir82]. Applicato
all’atomo questo principio esprime l’impossibilità di misurare congiuntamente, ad
esempio, posizione (∆x) e quantità di moto (∆p) dell’elettrone.
∆x ∆p ≥ 1/2 h
Analogamene, se una misura dell’energia E per essere eseguita richiede un intervallo di
tempo ∆t, allora anche l’energia può essere conosciuta con una imprecisione ∆E legata a
∆t dalla relazione di indeterminazione:
∆E ∆t ≥ 1/2 h
Principio di indistinguibilità:
In base a questo principio le particelle microscopiche sono tutte identiche, pertanto non
distinguibili le une dalle altre. Questo non perché non si disponga di mezzi tecnologici
d’individuazione abbastanza potenti ma poiché questa è una caratteristica intrinseca della
materia sub-atomica. Come diceva sorridendo Paul Dirac: “Non è possibile tingere di
verde un elettrone!” [Dir82].
Principio di complementarietà:
Secondo tale principio esistono, a livello microscopico proprietà complementari tali da
escludersi vicendevolmente; nel senso che la rivelazione dell’una, mediante esperimento,
esclude la rivelazione dell’altra [Dir82]. Tali sono, per esempio, l’aspetto corpuscolare e
l’aspetto ondulatorio di una particella che, di volta in volta, può essere rivelata o in forma
corpuscolare o in forma ondulatoria, ma mai percepita nella sintesi delle due.
Principio di sovrapposizione:
Il principio di sovrapposizione definisce un ennesimo comportamento sbalorditivo del
mondo microscopico. Lo stato di un sistema non è unico e determinato come in fisica
classica, ma è la sovrapposizione di tutti gli stati possibili per quel sistema. In altre parole
il sistema sta potenzialmente in tutti gli stati contemporaneamente. Il suo stato diventa
“puro”, unico, solo dopo una misura o un’interazione con un altro sistema. Il principio di
sovrapposizione è descritto efficacemente dal celebre esperimento ideale del “gatto di
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2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
Schroedinger”, il quale è una rappresentazione di tale principio nell’ambito della realtà
macroscopica del mondo classico (figura 17).
L’esperimento del gatto di Schroedinger ha fatto scorrere letteralmente fiumi di
inchiostro sul significato della “partecipazione” dell’osservatore al processo di misura;
proviamo a darne di seguito una rapida descrizione.
Si supponga di rinchiudere un gatto in una stanza blindata in cui venga collocata anche
una fiala sigillata contenente un gas velenoso. La fialetta è collegata attraverso un
opportuno amplificatore con l’interno di un contenitore, dove un atomo in stato di
eccitazione si trova situato fra le pareti “A” e “B” di materiale, rispettivamente,
assorbitore o fotoelettrico. L’atomo, uscendo dal suo stato di eccitazione, emetterà un
fotone che andrà a colpire o la parete “A” o la parete “B” del contenitore. Quando il
fotone colpisce la parete “A” questo verrà assorbito senza produrre alcun effetto, quando
colpisce la parete “B” verrà invece emesso un impulso elettrico che, amplificato, riuscirà
con un apposito congegno a far esplodere la fialetta contenente il gas velenoso
provocando quindi la morte del gatto. Ora, in base al principio di sovrapposizione,
l’atomo diseccitato si trova in uno stato di sovrapposizione fotone verso destra più fotone
verso sinistra. Da questa situazione di “impasse” si esce solamente tramite una
“misurazione”. Pertanto, seguendo la catena degli effetti a cascata, si dovrà concludere
che finché non viene effettuata la misura, il gatto si troverà in uno stato di
sovrapposizione fra vita e morte. Sarebbe, quindi, lo spettatore a far morire il gatto con
una semplice osservazione. Questa è la trasposizione del principio di sovrapposizione
che, in ambito macroscopico, porta ad un evidente paradosso [Ang03].
Figura 17: Paradosso del gatto di Schrodinger
42
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
Le ragioni di stupore prodotte dalle scoperte della fisica quantistica sono
tantissime e spesso, come si è già avuto occasione di osservare, così sconvolgenti da
creare un profondo senso di disagio.
Il grande fisico Heisenberg affermava che per capire la fisica quantistica bisogna
sapersi liberare del pregiudizio classico, di cui ogni essere umano è inevitabilmente
prigioniero [Dir82]. Si potrebbe tentare di trovare esempi dalla fisica classica coi quali
aiutarsi a capire alcune singolarità tipiche della fisica del microscopico, ma il gioco può
essere pericoloso portando facilmente a dei grossolani errori ed incomprensioni. Ad
esempio, la difficoltà a comprendere lo stato di sovrapposizione potrebbe essere spiegata,
rifacendoci al mondo macroscopico, nel seguente modo. Una moneta, nel gioco di
“Testa” o “Croce”, mentre ruota in aria, prima di impattare la superficie su cui verrà
osservata, può essere assunta come immagine di uno stato non-definito di
sovrapposizione Testa/Croce. Lo stato della moneta, ovviamente, si definisce in maniera
stabile soltanto all’impatto, che può essere considerato come l’effettuazione di una
misurazione, sulla superficie del tavolo. In realtà, l’analogia è vera solo in parte. Infatti la
moneta, mentre ruota, mantiene sempre ben distinte le due facce. Al limite con una
moderna osservazione “stroboscopica” non sarebbe impensabile vedere ad ogni istante
una determinata faccia. Nel caso di una particella, invece, lo stato di sovrapposizione è
proprio uno stato di totale non-definizione, in cui gli stati possibili sono sovrapposti e
non-definiti e anche tali da prendere connotazione solo all’atto della misura [Ang03].
Le due situazioni, pur avendo forti analogie, sono profondamente diverse. Nel caso della
moneta, i due stati sono sempre presenti e prendono forma stabile all’atto dell’impatto,
nel caso di una particella microscopica lo stato di sovrapposizione è una “realtà
indistinta”, una sovrapposizione delle varie possibilità, che prende forma solo con la
misura. È, dunque, il processo di misura che permette di configurare una delle varie
possibilità altrimenti indistinguibili. Intorno a quest’ultimo concetto è nata una diatriba
non ancora del tutto esaurita sul significato profondo dell’operazione di misura in fisica.
Principio di non-località (Paradosso EPR):
Partendo dalla considerazione che lo spin è una grandezza conservativa, consideriamo un
sistema quantistico costituito da due protoni, localmente molto vicini fra loro, e con spin
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2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
totale nullo (↑↓). Questa situazione corrisponde ad avere gli spin dei due protoni orientati
in sensi opposti ovvero: se un protone ha spin +1/2 lungo una direzione (↑), l’altro avrà
necessariamente spin –1/2 lungo la stessa direzione (↓).
Si immagini ora che i due protoni vengano allontanati indefinitamente l’uno dall’altro
fino a raggiungere enormi distanze reciproche (anche moltissimi anni luce) si deve
ammettere, per la menzionata conservazione, che la relazione di antiparallelismo degli
spin resta sempre conservata. Pertanto, allorquando si effettui la misura dello spin di una
delle due particelle, forzandolo in uno stato determinato, necessariamente, anche la
particella lontana verrà forzata immediatamente in uno stato determinato conservando,
lungo la stessa direzione, la relazione di antiparallelismo di partenza. Per indicare la
stretta interdipendenza sopradescritta fra queste particelle viene usato il termine
entanglement [Ang03].
La possibilità d’avere un effetto a distanza in un tempo nullo si configura come una
violazione del principio di località, secondo il quale ciò che avviene in A non può avere
alcuna relazione con ciò che avviene in B allorquando A e B siano separati da una
distanza ∆l > c∆t (eventi al di fuori del cono di luce).
L’azione istantanea a distanza è stata quindi per lungo tempo considerata paradossale
(paradosso EPR), finché J. Bell dimostrò che questo strano effetto risulta essere
effettivamente verificato in natura (disuguaglianza di Bell).
Nei modelli quantici che verranno successivamente illustrati spesso vengono citati
alcuni fenomeni propri della meccanica quantistica. Pertanto devono essere conosciuti
fenomeni come la condensazione di Bose-Einstein (coerenza quantistica), la
superradianza, l’effetto tunnel e il fenomeno dell’auto trasparenza indotta:
Coerenza quantistica:
Gli atomi, anche se normalmente vengono considerati delle particelle, presentano, in
accordo con la teoria quantistica della materia, anche delle proprietà tipiche delle onde. In
particolare possiamo associare ad ogni atomo una lunghezza d’onda, chiamata lunghezza
d’onda di De Broglie (λ = h/mV). A temperatura ambiente la lunghezza d’onda di De
Broglie è di molti ordini di grandezza inferiori alle distanze medie fra i singoli atomi di
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2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
un generico elemento. I singoli atomi possono dunque essere considerati come totalmente
indipendenti gli uni dagli altri. Se la temperatura viene però progressivamente diminuita,
anche l’energia cinetica media degli atomi diminuisce, con conseguente aumento della
lunghezza d’onda di De Broglie dei singoli atomi.
Circa 70 anni fa Einstein predisse che a temperature sufficientemente basse (vicine a zero
gradi Kelvin) la lunghezza d’onda di De Broglie superi la distanza media fra i singoli
atomi. In altre parole le onde associate ai singoli atomi iniziano a sovrapporsi. Gli atomi
diventano così indistinguibili e perdono il loro carattere di entità singole. Essi entrano in
uno stato della materia inusuale: i singoli atomi inizialmente separati e distinti si trovano
tutti in un medesimo stato quantico. Questo fenomeno prende il nome di condensazione
di Bose-Einstein.
Il fenomeno non si manifesta con qualunque tipo di atomo: esso è valido solo per atomi
(particelle) con spin intero. Cioè, per tutte le particelle che compongono la categoria dei
bosoni, come ad esempio i fotoni e i mesoni. In questo caso, gli atomi divengono
indistinguibili tra loro perché hanno la stessa energia e si trovano tutti in un piccolo
intervallo di spazio, formando una specie di “superatomo” che appare come una singola
entità. Invece, tutti gli atomi (particelle) con spin non intero (protoni, neutroni, elettroni)
chiamati fermioni, hanno un comportamento completamente differente. Il principio di
esclusione di Pauli impedisce infatti loro di coesistere in più di uno nel medesimo stato
quantico.
La prima evidenza sperimentale della condensazione di Bose-Einstein fu ottenuta
sfruttando atomi di rubidio (caratterizzati anche da particelle appartenenti alla categoria
dei bosoni). Da allora essa è stata poi ottenuta con numerosi altri elementi come ad
esempio sodio e litio.
Superradianza:
La superradianza è un effetto in grado di convertire energia di vario genere da uno stato
“disordinato” in una energia elettromagnetica coerente, per così dire “ordinata”. Il
passaggio da questi due differenti livelli comporta un’emissione di radiazioni, con un
pompaggio spontaneo e coerente di fotoni.
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2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
Effetto tunnel:
L’effetto
tunnel
quantistico
è
un’interessante
conseguenza
del
principio
di
indeterminazione di Heisenberg. Classicamente una particella può oltrepassare un
ostacolo (o una barriera di potenziale) soltanto se possiede energia sufficiente. In ambito
macroscopico una situazione simile può essere immaginata pensando ad una palla che
debba superare un muro alto diversi metri. Stando alle conoscenze di fisica classica, e
semplificando molto la situazione, ipotizzando assenza d’attrito, l’unico modo perché la
palla superi il muro è quello di farle raggiungere la cima, portandosi ad una energia
potenziale gravitazionale più alta rispetto a quella del muro. L’arrampicata costerà alla
pallina un certo valore di energia pari al guadagno di energia potenziale gravitazionale.
Scendendo dalla parte opposta, la palla riacquisterà poi l’energia spesa sotto forma di
energia cinetica. Se ci rifacciamo invece alla fisica quantistica si scoprirebbe, in linea
teorica, l’esistenza d’un altro metodo col quale sarebbe possibile valicare il muro: infatti
la “pallina” potrebbe rotolare dritta verso il muro, oltrepassandolo. Ciò che è sbalorditivo
è il fatto che esista una probabilità non nulla che la palla attraversi il muro stesso (senza
demolirlo) e si ritrovi a scorrere indisturbata dalla parte opposta, come se avesse
attraversato un tunnel fittizio (figura 18). Chiaramente la nostra esperienza quotidiana ci
suggerisce che questo fenomeno non avviene mai per gli oggetti macroscopici. Viene
invece spesso osservato, sotto vari aspetti, nello scenario quantistico delle particelle
elementari.
Solitamente l'interazione di una particella con una barriera di energia potenziale (dovuta a
un campo elettrico o alla combinazione di forze attrattive e repulsive) viene descritta
sfruttando la natura ondulatoria delle particelle elementari. In questo modo è possibile
calcolare la probabilità che l'incontro con l'ostacolo produca una riflessione oppure, in
particolari circostanze, che la barriera sia attraversata. L'aspetto quantistico sta nel fatto
che la probabilità di attraversamento non si annulla nel caso in cui l'energia della
particella sia inferiore all'altezza della barriera. La "trasparenza" è determinata
essenzialmente dall'altezza della barriera, dalla sua larghezza e dalla massa della
particella. Come risulta intuitivo, l'attraversamento è tanto più facile quanto la barriera
risulta bassa (rispetto all'energia della particella) e stretta; inoltre si riduce rapidamente a
zero non appena la massa della particella in esame supera i limiti del modo subatomico
46
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
(si tenga presente che la massa di un elettrone è dell'ordine di 10-30 kg). Abbiamo
precedentemente affermato che questo effetto è una conseguenza del principio
d’indeterminazione di Heisenberg, vediamo il perché. Il grado di indeterminazione
esistente tra i livelli di energia e tempo, si traduce in rapidissime fluttuazioni dei sistemi
microfisici. E’ stato calcolato che per tempi che si aggirano intorno al miliardesimo di
trillionesimo di secondo, un gruppo di elettroni può prendere in prestito dal sistema
sufficiente energia per oltrepassare una barriera di potenziale altrimenti insuperabile. Il
principio di indeterminazione vincola però la relazione di una tale transizione alla
rapidissima restituzione dell’energia utilizzata in prestito.
L’effetto tunnel ha validità universale ed è alla base di fenomeni quali il “tunneling
elettronico” e la radioattività. Infatti, il nucleo di un atomo è normalmente circondato da
un’altissima “barriera” che non permette ai neutroni e ai protoni di allontanarsi da esso.
Nonostante ciò (specialmente nei minerali di Uranio e di Radio) in seguito ad effetto
tunnel, i nucleoni possono “scavarsi profonde gallerie” e lasciarsi alle spalle le barriere di
potenziale rappresentate dall’attrazione nucleare, dando così vita al fenomeno della
radioattività.
Figura 18: Manifestazione dell’effetto tunnel in meccanica quantistica
2.3 Modelli quantistici cerebrali
Dalla prima metà degli anni 70 sono stati sviluppati un gran numero di modelli
teorici per spiegare il funzionamento del cervello su base quantistica. Questi modelli,
spesso innovativi e molto discussi, si affiancano ai sistemi classici per fornire
un’interpretazione sempre più completa e convincente delle meccaniche e dei processi
propri della mente umana [Mat&Pat00, Sei00]. Grandi fisici, neurobiologi e
47
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
neurofisiologi hanno dato il loro contributo allo sviluppo di teorie che fossero complete e
rappresentative. Ad oggi, i modelli più convincenti e meglio argomentati sembrano essere
quelli teorizzati da Stuart Hameroff in collaborazione con Roger Penrose, e quello di Karl
Pribram.
In sostanza è senz’altro possibile affermare come la ricerca sui modelli quantistici
cerebrali sia in continua evoluzione e come si stia affermando prepotentemente nel
panorama delle neuroscienze.
2.4 Fenomenologie fondamentali dei modelli quantistici cerebrali
In linea teorica, fenomeni di coerenza quantica a lungo raggio, possono
manifestarsi, in biologia, all’interno dei microtubuli di qualsiasi cellula dotata di attività
metabolica. Questo fenomeno, studiato da decenni, prende il nome di “ultraweak
photonemission” (UPE) oppure di radiazione biofotonica. Per molto tempo, nella
comunità scientifica, rimase aperto un vigoroso dibattito sul ruolo funzionale di queste
emissioni fotoniche; fino a quando Dicke, Popp, Hagan e Jibu, in collaborazione anche
con Hameroff, svilupparono la concezione secondo la quale i fotoni giocano un ruolo di
primo piano nella comunicazione neurone - neurone. Il principio alla base di questo
fenomeno si basa principalmente su alcuni concetti cari alla fisica quantistica quali: la
superradianza, l’effetto tunnel e la trasparenza auto-indotta.
Molte caratteristiche cerebrali sono state scoperte essere in completa analogia con
l’universo quantistico. Ad esempio, le dinamiche cerebrali sono caratterizzate da
complessi “pattern” compositi di un gran numero di entità distribuite in maniera estensiva
in tutta l’area cerebrale. Nonostante questa grande estensione spaziale tutti i processi
cognitivi hanno una indiscutibile “unità” difficilmente spiegabile in termini classici.
Molti scienziati ipotizzarono quindi, già negli anni ’90, l’insorgenza di possibili fenomeni
di coerenza quantistica tra più neuroni, in grado di fornire l’unità necessaria per spiegare
in termini fisiologici quello che è sempre stato conosciuto come “binding problem”.
L’idea di poter applicare i principi della meccanica quantistica al mondo biologico
cellulare si sviluppò a partire dal 1968, quando il fisico tedesco Fröhlich osservò,
focalizzandosi sul sottile strato compreso al di sotto della membrana cellulare, che in
48
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
questa regione poteva essere depositata energia sottoforma di onde coerenti dipolari
senza che si verificasse alcuna dissipazione termica. Molecole biologiche con attività
dipolare vibrazionale adiacente alla membrana cellulare potevano così manifestare uno
stato globale coerente, dove questo sottile strato che si creava poteva essere visto sia
come un medium superconduttivo, oppure, come plasma biologico isolante dal rumore
termico esterno. Le onde di Fröhlich furono stimate essere comprese intorno a valori di
frequenza di 1013 e 1014 s–1 e, in onore del grande fisico vennero chiamate appunto
frequenze di Fröhlich. Già trent’anni fa, quindi, si riuscì a stabilire che l’energia fornita
alle cellule, con frequenze pari a quelle di Fröhlich, determinasse un immagazzinamento
della energia stessa in un modo altamente organizzato e soprattutto senza alcuna
dissipazione energetica sottoforma di calore [Hag&Al02].
Ispirati dall’idea di applicare modelli e metodi quantistici al cervello e anche ad
altre cellule biologiche, come fatto dallo stesso Fröhlich, numerosi altri scienziati
iniziarono a considerare il cervello da un punto di vista microscopico quantistico durante
gli inizi degli anni ’80.
Come detto, uno dei modelli più convincenti e avvalorati che queste ricerche
produssero risulta essere quello di Stuart Hameroff. La sua teoria si fonda sul fatto che a
livello di qualsiasi cellula neurale si realizzi un’emissione fotonica. Da un punto di vista
fisico, i fotoni sono dei quanti elettromagnetici la cui natura è quella di interagire con
cariche elettriche come ad esempio elettroni o aggregati di cariche come atomi, molecole
o macromolecole. Pertanto secondo Hameroff sarebbe possibile pensare ad una
comunicazione a livello biofisico e biochimico tra cellule nervose grazie a scambi
fotonici [Jib&Al94]. Sostanzialmente Hameroff sviluppò, in collaborazione come
vedremo con Roger Penrose, una teoria quantistica cerebrale complessa, basandosi sul
fatto che i microtubuli possano essere considerati come “onde guida” per i fotoni. Inoltre,
in questo modello teorico, la struttura reticolare periodica dei microtubuli potrebbe
presentare, a livelli sub-atomici, delle fenditure regolari causate da piccoli intervalli tra i
dimeri di tubulina, attraverso i quali i fotoni potrebbero diffondersi anche all’esterno.
Il modello di Hameroff, come verrà spiegato di seguito, è caratterizzato dal fatto
che i microtubuli siano caratterizzati da specifiche proprietà sistemiche in grado di
generare dinamiche quantiche attraverso la superradianza e la trasparenza auto-indotta.
49
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
In particolare, il sistema quantico delle molecole d’acqua, e il campo elettromagnetico
quantizzato confinati entrambi all’interno della cavità dei microtubuli, possono
manifestare uno specifico stato di dinamica collettiva (superradianza) attraverso la quale i
microtubuli possono trasformare qualsiasi energia termica, atomica, molecolare,
elettromagnetica incoerente in fotoni coerenti all’interno del microtubulo stesso
[Mei&Al97]. Questi fotoni creati mediante superradianza penetrano perfettamente lungo
la cavità interna del microtubulo, come se esistesse un “medium” ottico trasparente per la
propagazione di questi fotoni (trasparenza auto-indotta) [Jib&Al94].
Il passo successivo fatto da Hameroff è stato quello di caratterizzare
dettagliatamente come potesse essere organizzato questo sistema di comunicazione
biofotonico, cercando anche di caratterizzare, ovviamente, la “fonte generatrice” della
luce.
A questo punto, per facilitare il problema e la comprensione del modello quantico
di Hameroff, consideriamo il microtubulo come se fosse rappresentato da un cilindro
cavo di raggio rMT e lunghezza lMT. Solitamente il valore di rMT si aggira intorno ai 12 nm,
mentre il valore di lMT è di circa 102-103 nm. Si indichi la regione interna al microtubulo
con la lettera V, e per ora, si restringa la trattazione delle dinamiche quantiche
esclusivamente in questa regione. Introduciamo quindi anche un sistema di coordinate
Cartesiane Oxyz, col piano-xy parallelo ad una delle due terminazioni del cilindro
microtubulare (figura 19).
rMT
Asse z
V
lMT
Piano-xy
Figura 19: Rappresentazione fisica semplificata di un microtubulo
L’asse z è coincidente con l’asse longitudinale del microtubulo cilindrico. Quindi, ogni
posizione nella regione V può essere espressa mediante coordinate r(x,y,z).
50
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
La regione spaziale V interna al microtubulo non è vuota, ma è verosimilmente
riempita, oltre che da molecole di acqua, anche da altre molecole, sebbene la loro
concentrazione rimanga relativamente bassa. Si consideri il caso ideale in cui queste
impurità vengano trascurate, in quanto, è piuttosto probabile che la densità dell’acqua
confinata all’interno del microtubulo rimanga per lo più sempre costante. E’ possibile
quindi fissare il numero totale di molecole d’acqua all’interno della regione V pari, ad
esempio, ad un valore generico N.
Concentriamo l’attenzione ora sul comportamento di una singola molecola
d’acqua j-esima all’interno del microtubulo; quello che si vuole determinare è la totalità
delle forze in gioco e delle energie caratterizzanti una singola molecola di acqua j-esima.
Ovviamente j è un valore compreso tra 1ed N. La posizione della molecola d’acqua è
costantemente espressa attraverso la terna r(xj,yj,zj).
Da un punto di vista fisico, la molecola d’acqua è caratterizzata da un dipolo elettrico
costante. A causa del suo momento di dipolo elettrico (µ=2epP con P = 0,2Å ed ep =
carica del protone), la molecola d’acqua può interagire fortemente con il campo
elettromagnetico quantizzato sempre presente nella regione spaziale V interna al
microtubulo.
In sostanza le forze che agiscono sulla nostra molecola d’acqua j sono essenzialmente di
tre tipi e vengono espresse mediante tre differenti operatori Hamiltoniani:
1) Hamiltoniana caratterizzante le dinamiche quantistiche della molecola j-esima:
ℋ = єsj, dove sj rappresenta la variabile di spin, mentre є è la differenza di energia
caratterizzata da un valore reale di 200 cm-1. Nel complesso, considerando le N
molecole contenute in V, otteniamo il seguente operatore totale:
2) La seconda Hamiltoniana esprime il valore energetico del campo elettromagnetico
quantizzato considerando la direzione della polarizzazione lineare:
51
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
3) Il terzo termine prende in considerazione l’interazione tra il campo
elettromagnetico quantizzato, scisso nelle due parti di frequenze positive e
negative, e la totalità delle molecole d’acqua attraverso le quali può essere
scambiata energia per la creazione e la annichilazione dei fotoni:
Quindi, l’Hamiltoniana totale in grado di governare le dinamiche quantistiche all’interno
dei microtubuli può essere definita dalla seguente equazione, che altro non è che la
somma dei tre contributi Hamiltoniani sopradescritti:
E’ interessante notare che l’Hamiltoniana totale, considerate N molecole d’acqua e il
campo elettromagnetico interno alla regione V, ha la stessa forma di una particolare
Hamiltoniana: l’Hamiltoniana di Dicke [Dic54].
Questa viene solitamente utilizzata per descrivere un sistema d’emissione laser, pertanto
ci si può aspettare, al pari di un dispositivo laser, un’attività otticamente coerente da parte
dei microtubuli.
Tutto ciò chiaramente risulta essere di grande interesse in quanto potrebbe aprire
una nuova visione dei processi funzionali cerebrali, analizzandoli sotto una prospettiva
drasticamente differente rispetto a quella convenzionale universalmente accettata. Stando
ad un modello fotonico di questo tipo, il sistema cerebrale potrebbe quindi utilizzare un
altro meccanismo fisico, microscopico e più elaborato, in grado di sfruttare emissioni di
fotoni coerenti trasferiti mediante microtubuli.
Tuttavia, sebbene i microtubuli manifestino lo stesso comportamento quantodinamico dei dispositivi laser, c’è una differenza sostanziale tra i due sistemi. Nei
dispositivi laser esiste un meccanismo definito di pompaggio, rappresentato ad esempio
da una lampada flash allo xenon, che permette d’innescare continuativamente l’emissione
di fotoni coerenti. Sarebbe quindi essenziale determinare questo dispositivo anche nelle
cellule nervose in quanto, per determinare l’emissione fotonica, le molecole d’acqua
necessariamente devono essere inizialmente portate ad un livello energetico maggiore.
52
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
Chiaramente, non possiamo aspettarci l’esistenza all’interno dei neuroni di una luce come
quella dei dispositivi laser in grado di compiere l’operazione di pompaggio. Perciò è stato
pensato che dovesse esistere un meccanismo differente per l’emissione di fotoni coerenti.
Grazie a fenomeni spaziali di interazione a lungo raggio caratterizzanti una determinata
regione, se ne potrebbe verificare uno in grado di influenzare la dinamica collettiva delle
molecole d’acqua all’interno del cilindro V, dando origine poi ad una emissione
spontanea di fotoni senza bisogno di alcuna luce di pompaggio [Jib&Al94].
Tutte le energie incoerenti e disordinate, cedute alle molecole d’acqua a causa di
dinamiche termiche macroscopiche caratterizzanti le subunità proteiche polimerizzate
(tubuline), possono essere tutte radunate in una dinamica coerente ed ordinata al fine di
poter emettere fotoni coerenti. Questo meccanismo di pompaggio senza luce venne per la
prima volta introdotto dal fisico Dicke e fu chiamato superradianza [Dic54].
Si consideri l’effetto di superradianza nel microtubulo cilindrico V. A causa della
corta lunghezza del cilindro lMT ≡ 102 – 103 nm, la “modalità di pulsazione” che si
propaga lungo il cilindro, nella direzione dell’asse z, risulta essere localizzato nella cavità
V solamente per un cortissimo periodo di tempo tMT ≡ lMT /c, dove c è la velocità della
luce. Siccome questo tempo di transizione (tMT) è molto più piccolo rispetto al tempo
caratteristico d’interazione termica, il sistema di molecole d’acqua ed il campo
elettromagnetico quantizzato sono di conseguenza esenti da dissipazioni termiche e
possono essere considerati quindi come un sistema chiuso descritto efficacemente dalle
equazioni di Heisenberg. In sostanza, quindi, l’attività di pulsazione del campo
elettromagnetico quantizzato nella cavità cilindrica microtubulare segue la dinamica
collettiva dell’acqua interna al microtubulo. In altre parole, un’attività collettiva a lungo
raggio è creata dalla dinamica delle molecole d’acqua, a cui segue un’emissione coerente
di campi magnetici quantizzati sottoforma di fotoni.
Osservando la figura 20, è possibile comprendere meglio gli eventi caratterizzanti
il fenomeno della superradianza. In questa figura, gli ovali senza una freccia
rappresentano molecole d’acqua in uno stato energetico stazionario. Viceversa, tutti gli
ovali con una freccia rappresentano invece molecole d’acqua in uno stato energetico
eccitato. Il processo è ciclico: si passa dallo stato a allo stato b, quindi a c, a d, per poi
tornare nuovamente allo stato iniziale a, e così via dicendo. Lo stato a, è definito come
53
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
stato iniziale del sistema. In questo stato, le molecole d’acqua del microtubulo sono
caratterizzate da uno stato stazionario che, progressivamente, a causa delle fluttuazioni
termiche dei dimeri di tubulina, tende ad aumentare giungendo a stati energetici eccitati.
In seguito, attraverso processi casuali a lungo raggio, viene raggiunto uno stato di
coerenza quantistica (stato b).
Figura 20: Processo di superradianza in un microtubulo
Nello stato c, invece, le molecole d’acqua eccitate perdono collettivamente la loro
energia, creando all’interno del microtubulo fotoni coerenti. Infine, nello stato d, le
molecole d’acqua che hanno dissipato il loro stato energetico ad alto livello mediante
superradianza riiniziano, a questo punto, a riguadagnare energia grazie alle fluttazioni
termiche dei dimeri di tubulina, e così l’intero sistema si ritrova nuovamente nello stato a
iniziale.
Ora, le dinamiche quantiche collettive delle molecole d’acqua e il campo
elettromagnetico quantizzato nel cilindro del microtubulo manifestano fenomeni coerenti
54
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
di superradianza a lungo raggio, nel quale l’eccitazione delle molecole d’acqua può
essere indotta da perturbazioni incoerenti e disordinate generate dalle dinamiche termiche
macroscopiche delle molecole proteiche che formano la parete del microtubulo delle
cellule nervose. Ciò presuppone che ogni microtubulo nei neuroni (ma anche negli
astrociti) possa giocare un ruolo di primaria importanza nel processamento e nel
meccanismo di comunicazione biofotonica.
Nei microtubuli, oltre al processo di superradianza, molto importante risulta
essere anche il fenomeno di trasparenza auto-indotta. Abbiamo già detto che la
superradianza è un fenomeno caratterizzato da una durata molto più corta rispetto alla
interazione termica acqua - tubuline. Perciò i microtubuli potrebbero essere pensati anche
come “linee guida fotoniche”. Poiché non era chiaro se l’attività pulsante microtubulare
creasse dei fotoni coerenti che potessero essere trasmessi in maniera sicura preservando
la loro coerenza a lungo raggio, oppure se questi perdessero immediatamente la loro
coerenza una volta generati a causa del rumore circostante, fu ipotizzata anche l’esistenza
di questo principio.
Si supponga che l’attività di pompaggio sia creata in un piccolo segmento
cilindrico del microtubulo mediante superradianza. Questi fotoni si potranno propagare
lungo l’asse longitudinale, quindi lungo il solito asse z. Se la regione V all’interno del
cilindro venisse mantenuta vuota, il meccanismo di pompaggio sopradescritto
trasmetterebbe i fotoni in maniera perfettamente coerente lungo tutta la lunghezza lMT.
Tuttavia, sappiamo che la regione V è riempita da molecole d’acqua (e da altre impurità),
quindi ciò potrebbe far insorgere fenomeni di assorbimento oppure di perdita di coerenza,
che disturberebbero la trasmissione fotonica. Perciò, introducendo particolari
approssimazioni (semi-classical approximation, Equazione di Sine-Gordon), è possibile
considerare che i fotoni si diffondano come se fossero immersi in un dielettrico
microtubulare completamente “trasparente”, questo fenomeno di tipo non-lineare viene
definito “trasparenza auto-indotta” [Jib&Al94].
Combinando l’attività fisica della superradianza e della trasparenza auto-indotta è
possibile spiegare quindi fenomeni cerebrali quanto-dinamici a lungo raggio. Questi
fenomeni caratterizzerebbero l’attività quantica non solo dei microtubuli di un singolo
55
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
neurone, ma anche l’attività di diverse cellule nervose a distanze di centinaia di
micrometri.
In seguito a queste considerazioni e grazie ad altre evidenze sperimentali, molti
neuroscienziati e fisici teorici, di cui Karl Pribram risultò essere il massimo esponente,
ipotizzarono anche che nel cervello potessero insorgere delle interferenze fra le sorgenti
coerenti dei microtubuli. Questo diede avvio, come vedremo successivamente, allo
sviluppo di alcune teorie di tipo olonomico-olografico per spiegare il funzionamento del
cervello.
2.5 Teoria orch-OR di R.Penrose e S.Hameroff
Nei primi anni ’90 l’eminente fisico Roger Penrose e il dottor Stuart Hameroff
svilupparono un modello, ancora oggi considerato uno dei più completi ed argomentati,
per la descrizione sia delle dinamiche cerebrali che per la caratterizzazione dell’essenza
della coscienza umana (intesa come attivo stato cognitivo della mente) [Pen94].
Per costruire l’impalcatura della loro teoria, essi dovettero sfruttare la fisica
spazio-temporale, descritta nella teoria della relatività generale di Albert Einstein, e
sfruttare inoltre i principi della meccanica quantistica. Il tentativo di unificare questi due
rami della fisica porta a definire la teoria della gravità quantistica (quantum gravity). Le
teorie di questa branca della fisica moderna vengono impiegate da Roger Penrose nel
modello “orch-OR” (orchestrated Objective Reduction), in quanto il grande fisico è
profondamente convinto della loro validità persino nel campo della neurobiologia
[Pen91].
Cerchiamo, innanzitutto, di comprendere che cosa significhi il termine “riduzione
oggettiva” (OR). Sappiamo che qualsiasi sistema, in fisica quantistica, viene definito
tramite un funzione d’onda la quale ad un certo punto, a causa di una perturbazione, può
collassare (ridursi) assumendo uno specifico autovalore. Nel modello proposto da
Penrose – Hameroff
ad ogni processo di riduzione, o meglio di auto-riduzione,
corrisponderebbe un passaggio dallo stato di pre-coscienza ad uno di coscienza.
L’autocollasso di uno stato quantico cerebrale insorgerebbe solamente quando viene
superato un valore energetico di soglia: objective threshold. Perciò, in questa teoria non
56
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
vi è nessun collasso determinato da alcun evento di misurazione, né un collasso
determinato a causa dell’azione di un osservatore. Per questo viene definito valore soglia
oggettivo insorgente per auto-riduzione. Affinché un evento di coscienza possa
manifestarsi nella teoria di Penrose - Hameroff è essenziale quindi che insorga un’autoriduzione degli stati coerenti [Ham&Pen96].
Generalmente, la sovrapposizione degli stati di coerenza quantistica cerebrale
devono rispettare determinate caratteristiche per poter dar luogo ad uno stato di
coscienza, ovvero:
-
Le particelle (tubuline/fotoni) devono essere in sovrapposizione quantistica per un
periodo piuttosto lungo per poter raggiungere il valore di objective threshold
(valore soglia).
-
Il processo OR che si verifica in una cellula nervosa deve essere isolato dal
rumore dell’ambiente circostante fino a che non si verifichi un’auto-riduzione
spontanea o per così dire autonoma.
-
La cascata di eventi OR nel tempo costituisce un vero e proprio “stream of
consciousness”.
Raggiungendo il valore soglia gravitazionale quantico ogni evento OR determinerebbe
implicitamente, secondo Penrose e in accordo con la “quantum gravity”, uno specifico
effetto sulla geometria spazio temporale. Anzi, si potrebbe affermare che una cascata di
eventi OR determini la selezione di geometrie spazio temporali differenti.
Sembrerebbe sorprendente che la gravità quantistica possa influenzare anche la
fisica dei processi cerebrali, essendo già assai poco percettibile nelle classiche dimensioni
ordinarie. Invece, come postulato in questa teoria, i principi propri della “quantum
gravity” risulterebbero essere molto rilevanti proprio nei processi di coscienza cerebrale.
Cerchiamo ora di comprendere meglio il meccanismo della “Riduzione Oggettiva” nel cervello, cercando di caratterizzarlo sia in base ai principi quantistici che
ai principi spazio temporali gravitazionali impiegati da Penrose.
Nel modello OR si parla di riduzione oggettiva, quindi di primaria importanza
risulta essere comprendere quanti tipi di riduzioni possano esistere considerando un
sistema in sovrapposizione quantica, e, comprendere quindi quali siano anche le
sostanziali differenze (tabella 2). Le riduzioni di una funzione d’onda possono essere
57
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
sostanzialmente di due tipi: una riduzione soggettiva ed una oggettiva. Sebbene non siano
ancora ben conosciute le cause, si verifica riduzione soggettiva (R o SR) solo allorquando
l’osservatore, oppure uno strumento di misura, perturbi il sistema per effettuare la
misurazione (interpretazione di Copenhagen). La riduzione oggettiva avverrebbe, invece,
senza che l’osservatore perturbi il sistema. Infatti, in accordo con la teoria quantistica
gravitazionale, più stati quantici sovrapposti possono raggiungere, col procedere del
tempo, un valore soglia che determini spontaneamente il loro collasso.
Tabella 2: Descrizione del collasso delle funzioni d’onda
Cerchiamo invece di comprendere ora come la gravità quantistica possa risultare
d’aiuto nella interpretazione dei meccanismi riguardanti il cervello, e quindi in seguito,
nella caratterizzazione anche della coscienza.
Sappiamo che la visione classicista proposta da Newton per descrivere i fenomeni
d’attrazione gravitazionale tra due corpi, è stata interamente rivista da Einstain nella
teoria generale della relatività. Nel 1915 Einstein assegnò alla gravità un ruolo chiave
nella descrizione della totalità di qualsiasi fenomeno fisico:
-
La gravità influenza la relazione degli eventi spazio temporali.
La gravità è in grado di deformare lo spazio tempo curvandolo (precedentemente
questo era stato sempre considerato essere piano), ipotizzando anche l’esistenza di
onde gravitazionali (figura 21).
-
Figura 21: La deformazione dello spazio-tempo causa onde gravitazionali
58
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
Da queste considerazione emerge quindi che la gravità non possa essere più considerata
solo come un fenomeno emergente, secondario ad altri effetti fisici, ma come una
componente fondamentale della realtà fisica [Pen91].
Penrose ed Hameroff ebbero la brillante idea di sfruttare la meccanica quantistica con la
teoria della relatività generale e di applicarle entrambe contemporaneamente ai sistemi
celebrale, ipotizzando una nuova chiave di lettura che potesse fornire una precisa
spiegazione di fenomeni fisici non ancora ben caratterizzati come, del resto risulta essere,
la mente umana.
Precedentemente abbiamo assunto che un evento OR determini la selezione di
una specifica geometria spazio temporale, cerchiamo ora di comprendere meglio che cosa
succeda in queste circostanze.
Innanzitutto, secondo la visione fisica moderna, la realtà è costituita da quattro
dimensioni, ovvero: le tre dimensioni spaziali e la dimensione temporale. Secondo quanto
espresso da Einstein nella teoria della relatività generale, la realtà spazio temporale,
considerata come un’unica entità e non come composizione della realtà spaziale separata
da quella temporale, è inoltre leggermente curvata. Questa “distorsione” è determinata da
ogni densità di massa anche di dimensioni molto esigue. A questo punto, considerando
che la massa determina una curvatura dello spazio tempo (figura 22), e ricordandoci che
in meccanica quantistica esistono stati quantici sovrapposti, caratterizzati da differenti
probabilità di distribuzione di massa, questo implica necessariamente che la
sovrapposizione
delle
geometrie
spazio
temporali
risulti
essere
“instabile”
[Ham&Pen03]. Quindi, in queste condizioni, la sovrapposizione (coerenza) di stati sarà
destinata a collassare mediante il meccanismo OR in un singolo stato (geometria spazio
temporale) ben determinato.
Figura 22: Rappresentazione della sovrapposizione quantica coerente come separazione dello spazio-tempo
59
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
In figura 22 è schematicamente illustrato come la geometria spazio temporale sia
definita quando due distribuzioni di massa differenti si manifestano in un effetto quantico
di sovrapposizione. In questa rappresentazione è stato utilizzato uno schema molto
semplice, dove la distanza fra i due fogli rappresenta la divergenza tra due regioni spazio
temporali in sovrapposizione; chiaramente in questo caso s’è sfruttata una descrizione
bidimensionale di un’entità che invece è tetradimensionale come già detto; per cui, per
descrivere esaustivamente il sistema considerato, si sarebbero dovuti impiegare strumenti
matematici astratti molto più complessi. E’ bene comunque risottolineare il fatto che
questa è una separazione spazio temporale e non esclusivamente spaziale. Pertanto, il
tempo di separazione e la separazione spaziale contribuiscono in ugual maniera alla
misura finale di separazione delle due regioni sovrapposte. In definitiva, solo se il
prodotto del “tempo di separazione” per la “separazione spaziale” raggiunge e supera un
certo valore critico (objective reduction) si verificherà l’evento di riduzione oggettiva OR
altrimenti le due regioni rimarranno sovrapposte.
Il valore soglia dell’objective reduction viene definito calcolando il valore di energia
gravitazionale E delle due distribuzioni di massa:
E=h
T
Dove h è la costante di Planck su 2π, mentre T è il tempo di durata della coerenza delle
geometrie spazio temporali [Ham03].
Vogliamo ora comprendere dove, in base alla teoria di Penrose ed Hameroff, si
possa verificare il fenomeno di sovrapposizione coerente e quello della riduzione
oggettiva OR. Penrose ed Hameroff sostengono che questi fenomeni si manifestino
principalmente nei microtubuli, sebbene possano insorgere anche in cellule gliali, in vari
organelli, ed in altre strutture biomolecolari. In figura 23 è rappresentata la regione
centrale di un neurone. In questa rappresentazione è visibile una serie di microtubuli
paralleli, interconnessi dalle proteine MAP, le quali determinano un reticolo
citoscheletrico tipico delle cellule nervose. E’ visibile come i microtubuli assonali siano
lunghi e continui, mentre quelli dendritici siano interrotti e quindi molto più corti. E’
anche evidente come il citoscheletro, all’interno dei neuroni, ne stabilisca la corrispettiva
forma, mantenendo e regolando anche le connessioni sinaptiche del neurone.
60
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
Figura 23: Rappresentazione schematica dei microtubuli all’interno di un neurone
Abbiamo precedentemente descritto che i maggiori componenti dei microtubuli
sono dimeri proteici chiamati tubuline. Ogni tubulina è una “subunità” polare di carica
negativa e dimensioni totali di 8 nm (4 nm per ciascuno dei monomeri α e β che la
compone).
Figura 24: Differenti conformazioni del dimero di tubulina
In figura 24 sono rappresentate le differenti conformazioni in cui il dimero si può
presentare. Ogni molecola di tubulina è caratterizzata da almeno due conformazioni
possibili: quella rossa e quella blu nell’immagine a colori. In questi due stati, l’elettrone
presente all’interno della tasca idrofobica centrale, in base alla sua delocalizzazione,
determina una delle due conformazioni proteiche globali. Il passaggio da una
61
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
conformazione all’altra può richiedere un periodo di tempo compreso nell’ordine dei
nano o picosecondi. Inoltre, le molecole di tubulina possono anche presentare uno stato di
sovrapposizione quantistica coerente.
Tradizionalmente considerati come strutture ossee delle cellule, i microtubuli e le
altre strutture citoscheletriche, sembrerebbero possedere invece anche un importante
ruolo comunicativo. Sono stati sviluppati molti modelli teoretici, e sono state fatte anche
alcune simulazioni, con lo scopo di dimostrare che le tubuline, in uno stato
conformazionale specifico all’interno del microtubulo (quello di sovrapposizione
quantica per l’appunto), possano interagire con altre tubuline prossimali per poter
propagare degli impulsi.
In figura 25 è rappresentata schematicamente una piccola porzione di un microtubulo
mostrante le tubuline in otto differenti step consecutivi. E’ possibile osservare come
queste tubuline siano sempre caratterizzate da un preciso stato quantico (rosso o blu se ci
rifacciamo alla figura 24, nero e bianco in figura 25).
Figura 25: Modalità classica di interazione tubulina - tubulina
In figura è possibile osservare come i diversi “pattern” si evolvano allo scorrere del
tempo portando alla formazione sempre di nuovi e differenti pattern ben definiti.
Tuttavia, da un “pattern” classico (step 1 di figura 26) potrebbe anche insorgere una
62
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
sovrapposizione di stati coerenti quantici di tubulina (step 2). Successivamente, poiché
come è stato detto, lo stato di sovrapposizione quantistica caratterizzante una tubulina
può anche estendersi alle tubuline a lei vicine, questo stato di coerenza quantistica si
accrescerebbe per risonanza (step 2 – 6). Lo stato 6, caratterizzato da tutte le tubuline in
stato di sovrapposizione, e a loro volta in coerenza con tubuline di altri microtubuli, si
manterrebbe fino al raggiungimento del valore di soglia al quale corrisponde un
autocollasso per gravità quantica (orch-OR). In seguito a tutto ciò, secondo Hameroff e
Penrose, si manifesterebbe un singolo evento di “consciousness” [Ham98].
Figura 26: Insorgenza dell’interazione quantica coerente tubulina - tubulina
Il settimo step di figura 26 rappresenta nuovamente una situazione classica, dove le
tubuline sono caratterizzate tutte da un preciso stato quantico. La coerenza quantistica
inizia invece a riemergere solo a partire dallo step numero 8.
Nel modello di Penrose ed Hameroff, la coerenza quantistica insorge e si
mantiene isolata nei microtubuli, fino a che il valore delle differenze della distribuzione
di massa – energia, fra gli stati di tubulina sovrapposti non raggiunga la soglia di
instabilità precedentemente descritta, collegata alla gravitazione quantica. Il risultato del
collasso OR, considerato essere un processo irreversibile nel tempo, crea un evento
istantaneo di coscienza rispetto alla dimensione temporale. In figura 27 è rappresentato
63
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
un evento di coerenza quantistica emergente nei microtubuli (considerando il numero di
tubuline) rispetto al tempo. Attraverso studi condotti dal medico Libet intorno agli anni
’80, venne stimato che il tempo di pre-coscienza avesse una durata di 500 ms. Questo
valore è impiegato e considerato valido anche nel modello orch-OR [Ham&Al02].
Figura 27: Dinamica dell’evento di collasso orch-OR
L’area sotto la curva relaziona differenti masse – energie con il tempo di collasso della
coerenza in accordo con la riduzione oggettiva OR. Il grado di differenza della
sovrapposizione spazio-temporale porta ad una repentina riduzione quantica (autocollasso o meglio “riduzione oggettiva orchestrata”).
Fin’ora non è stato ancora chiarito il perché la riduzione venga detta da Penrose
ed Hameroff orchestrata. Per chiarire questo punto si consideri quindi la figura 28.
Figura 28: Sovrapposizione quantica tra più microtubuli di uno stesso neurone
64
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
Il fenomeno di coerenza quantica raggruppa (collega) non solo le tubuline sovrapposte
all’interno di uno stesso microtubulo ma anche fra diversi microtubuli. Come detto,
qualsiasi microtubulo all’interno della propria cavità è caratterizzato principalmente da
molecole d’acqua in grado di generare per superradianza fotoni coerenti, i quali si
propagano sulla superficie delle tubuline costituenti il microtubulo come se il tubulo
fosse una “onda guida”. A questo punto, molte tubuline di un singolo microtubulo
neurale sono in coerenza, ma non quelle di microtubuli adiacenti. Per far sì che anche
altre tubuline appartenenti a differenti microtubuli risuonino in coerenza sono necessarie
le proteine MAP. Le MAP infatti, attaccandosi fra diversi microtubuli, generano una
breccia nell’isolamento del sistema tubulare impedendo in questo modo che una coerenza
quantistica sia in grado di propagarsi in maniera isolata esclusivamente in un singolo
microtubulo. Infatti, come è ben visibile dalla figura 28, le MAP agiscono come “nodi” e
sono in grado di orchestrare le oscillazioni quantiche fornendo la possibilità per la
manifestazione di un collasso orch-OR [Ham98].
Un altro aspetto cruciale è, come sappiamo, la temperatura di ogni sistema. Il
cervello opera a circa 37° gradi Celsius (310 gradi Kelvin) il che è considerato essere un
valore molto alto, potenzialmente inadatto per l’insorgenza di fenomeni di coerenza
quantica [Woo&Ham01]. Questo tuttavia non è un problema, infatti un punto di forza
della teoria orch-OR è proprio il fatto che essa fornisca una ragionevole spiegazione della
possibilità d’insorgenza dei fenomeni di coerenza cerebrale senza effettuare uno
stravolgimento delle classiche concezioni sulla fase citoplasmatica del neurone. Come
sappiamo, il citoplasma può esistere in due fasi: Sol e Gel; e questo è sufficiente per dare
fondamento alla coerenza quantica cerebrale. Il Sol, una fase liquida nella quale l’actina è
depolimerizzata, permette al microtubulo di ricevere input dall’ambiente esterno. Questo
potrebbe innescare o meno fenomeni di superradianza consentendo poi la propagazione
di output microtubulari (figura 29). Il Gel, invece è una fase a stato solido in cui l’actina
circonda densamente i microtubuli. In questa fase, l’acqua sui microtubuli e l’actina
divengono ordinate, così che l’acqua accoppiata col citoscheletro agisce non come
ambiente destabilizzatore, bensì come scudo. Inoltre, gli amminoacidi terminali della
tubulina si estendono anche leggermente al di fuori dalla struttura del microtubulo, verso
il citoplasma, delocalizzando quindi una certa carica negativa nella zona esterna. Tutto
65
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
ciò avrà l’effetto d’attrarre cariche positive. Di fatto, quindi, si verrebbe a creare un
doppio strato di cariche in grado di schermare il microtubulo da possibili eventi di
decoerenza [Woo&Ham01]. Come descritto in figura 29, il passaggio da Sol a Gel
sarebbe attivato da una cascata di secondi messaggeri. L’acetilcolina, attraverso il
recettore muscarinico, attiverebbe una cascata di reazioni promosse dal secondo
messaggero (PI-PLC) il quale attiverebbe due proteine chinasi (PKC e CaMK) in grado
di fosforilare specifici siti delle proteine MAP, permettendo “l’embedding” del
microtubulo e successivamente l’esplicazione del fenomeno di coerenza quantico.
Figura 29: Influenza dello stato Sol – Gel citoplasmatico sulla coerenza
Fino a questo momento s’è caratterizzato efficacemente il modello orch-OR, di
Penrose e Hameroff, considerando tutte le possibili dinamiche all’interno di una singola
cellula nervosa e quindi di un singolo neurone. Tuttavia è bene comprendere come gli
stati quantici, descritti in questo modello, possano estendersi attraverso la membrana e le
regioni anatomiche fino ad altri neuroni [Mat99]. Secondo Hameroff questo sarebbe
possibile postulando l’esistenza di fenomeni di “tunnel quantico” attraverso le “gap
junction” delle sinapsi elettriche. Questo meccanismo permetterebbe infatti la diffusione
di stati quantici intracellulari fra più neuroni. L’effetto tunnel potrebbe essere mediato
anche da qualche organello specifico come ad esempio il “corpo dendritico lamellare”.
Da notare come, nonostante le gap-junction siano in numero molto inferiore rispetto alle
66
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
sinapsi chimiche (in media solo tre per neurone), il processo quantico, una volta
innescato, sia delocalizzato efficacemente in tutta l’area cerebrale. Questo tipo di
connessionismo quantico che si crea fra tutti i tipi di neuroni cerebrali è stato definito
“hyper-neuron” [Woo&Ham01].
Infine, Penrose ed Hameroff forniscono anche una stima approssimativa del
numero di tubuline necessarie per dare origine ad un fenomeno di coscienza istantaneo.
Essi ipotizzando che il tempo di coerenza T sia uguale a 500 ms. Conoscendo il valore
soglia E, stimano il numero di tubuline necessarie per innescare una riduzione oggettiva
OR orchestrata ad intervalli T regolari. Da questi calcoli risultò che dovessero essere
impiegate circa un miliardo (109) di tubuline. Considerando inoltre che, in media, in un
neurone il numero totale di tubuline si aggira intorno a valori di 107, e che solamente il 10
% di queste, all’interno di un neurone, potrebbero essere coinvolte nell’insorgenza di uno
stato quantico coerente, allora sarebbero necessari un migliaio di neuroni (103) per
sostenere una coerenza di durata 500 ms, al termine della quale si potrebbe verificare
quindi un evento di coscienza istantanea [Ham&Pen03].
2.6 Teoria Olonomica di K. Pribram
Un modello del funzionamento mentale in cui, come nella fisica subatomica,
l’osservatore non possa essere considerato indipendente dall’oggetto osservato, è stato
sviluppato agli inizi degli anni ’90 da Karl Pribram.
Secondo questa teoria, mutuata dal principio sul quale si fonda l’olografia ottica,
la mente fa esperienza delle immagini grazie a un processo che coinvolge il cervello e la
sua interazione con l’ambiente ad un livello compenetrato [Gra&Al04].
Per capire quali fossero le motivazioni che spinsero il Prof. Pribram a formulare
tale concezione, è necessario comprendere prima la natura degli ologrammi. Un
ologramma è una “fotografia” tridimensionale prodotta con l’aiuto di un laser: per creare
un ologramma l’oggetto da fotografare viene prima immerso nella luce di un raggio laser,
poi, un secondo raggio laser viene fatto rimbalzare sulla luce riflessa del primo e lo
schema risultante dalla zona di interferenza dove i due raggi si incontrano viene impresso
sulla pellicola fotografica (figura 30). Quando la pellicola viene sviluppata risulta visibile
67
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
solo un intreccio di linee chiare e scure ma, se questa viene illuminata da un altro raggio
laser, ecco apparire il soggetto originale in tre dimensioni. La tridimensionalità di tali
immagini non è l’unica caratteristica interessante degli ologrammi, difatti se l’ologramma
di una rosa viene tagliato a metà e poi illuminato da un laser, si scoprirà che ciascuna
metà contiene ancora l’intera immagine della rosa. Anche continuando a dividere le due
metà, vedremo che ogni minuscolo frammento di pellicola conterrà sempre una versione
più piccola, ma intatta, della stessa immagine. Diversamente dalle normali fotografie,
ogni parte di un ologramma contiene tutte le informazioni possedute dall’ologramma
integro.
Figura 30: Schema di generazione di un ologramma
La matematica utilizzata da Dennis Gabor (premio Nobel nel 1948), per la descrizione di
un ologramma laser (Equazioni olografiche di Gabor), si basa su delle equazioni di
calcolo note come trasformate di Fourier. Queste sono in grado di descrivere qualsiasi
immagine ottica alla stregua di oscillazioni ondulatorie regolari e periodiche che
differiscono fra loro solo in frequenza, fase ed ampiezza.
La teoria di Pribram, messa a punto in collaborazione con lo stesso Gabor, si basa
su una descrizione in termini puramente matematici dei processi e delle interazioni
neuronali capaci di interpretare sotto forma di onde tutte le informazioni che gli vengono
presentate, per poi convertirle in schemi di interferenza e trasformarle infine in immagini
tridimensionali [Pri91].
Risulterebbe essere vero che quando osserviamo qualcosa alcune porzioni del
nostro cervello siano in grado di risuonare su specifiche frequenze, per cui, la percezione
68
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
avverrebbe come premendo specifici tasti di un pianoforte che stimolerebbero le corde
corrispondenti. In questo modo noi non vedremmo gli oggetti per quello che sono (in
accordo con quanto messo in luce dalla teoria della relatività generale), ma riusciremmo a
captarne solo la loro informazione.
Tale modello renderebbe conto anche della vastità della memoria umana, in
quanto l’olografia possiede una straordinaria capacità di immagazzinare informazioni
semplicemente cambiando l’angolazione con cui due raggi laser colpiscono una lastra
fotografica. Questo risolverebbe il problema della localizzazione degli “engrammi”
(pensieri che rimangono nella memoria sotto forma di energia) messo in evidenza da Karl
Lashley, in quanto il cervello distribuirebbe le informazioni su vaste aree nello
spostamento concettuale senza immagazzinarle allora in specifici “siti”.
Che le cellule del sistema visivo di alcuni animali siano sintonizzate su frequenze
specifiche è stato dimostrato dalla coppia di neurofisiologi californiani De Valois e
Fergus Campbell dell’Università di Cambridge. La stessa cosa fu ipotizzata da Pribram
per cercare di dare supporto all’idea che anche a livello della corteccia le informazioni
fossero trasmesse nel linguaggio delle onde e delle loro configurazioni [Pri91].
Questo modello di funzionamento cerebrale è riconducibile al concetto di totalità
ininterrotta postulata dal fisico David Bohm, il quale considerava potenzialmente valida
l’esistenza di legami non-locali tra le particelle subatomiche. Lo stesso Bohm, Pribram,
Geoffrey Chew e Stapp, unirono le loro forze al fine di giungere ad una descrizione
matematica che riflettesse l’unificazione in fisica sia dei fenomeni subatomici che dei
microprocessi cerebrali. Un grande contributo venne fornito anche dal fisico giapponese
Kunio Yasue, il quale mostrò come effettivamente reti dendritiche operino attraverso
campi vibrazionali che si comportano in accordo con le proprietà osservate nel mondo
quantistico.
2.7 Considerazioni riguardo ai Quantum Brain Models
Diversi Quantum Brain Models stanno conoscendo una rapida diffusione nel
mondo delle scienze neurobiologiche sebbene, ancora oggi, siano incompleti e dimostrati
solo parzialmente. Tuttavia, allorquando verranno giustificati e sperimentalmente
69
2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali
dimostrati, potrebbero spalancare allora la conoscenza approfondita della mente umana,
in sostituzione o in accompagnamento dei modelli classici di interpretazione fin’ora
accetati.
70
3. Strumentazione hardware
3. Strumentazione
hardware
71
3. Strumentazione hardware
3.1 Set-Up sperimentale
Il protocollo sperimentale utilizzato per l’indagine di fenomeni non-classici
riguardanti neuroni derivati da cellule staminali neurali, si basa su una complessa
strumentazione hardware (figura 31).
Figura 31: Set-up sperimentale degli esperimenti condotti
I principali componenti di tali esperimenti sono:
-
Le piastre MEA sulle quali vengono fatti differenziare e crescere i nostri neuroni.
-
Un dispositivo laser mediante il quale le cellule nervose vengono eccitate.
-
Un amplificatore per facilitare l’analisi dei segnali, migliorando il rapporto
segnale rumore.
-
Un oscilloscopio, per avere immediatamente un’informazione qualitativa del
livello del segnale registrato.
-
Una scheda d’acquisizione per la conversione di dati dal formato analogico in
formato digitale.
-
Il tutto organizzato e controllato attraverso un sistema software di gestione.
In questo capitolo verranno quindi fornite le informazioni necessarie per
comprendere in dettaglio i differenti step e i principi alla base degli esperimenti condotti.
Si comincia quindi proprio partendo dallo strumento chiave rappresentato dall’array
72
3. Strumentazione hardware
planare di microelettrodi (MEA), per poi giungere ad una descrizione di tutti gli altri
strumenti ad esso collegati.
3.2 Prime esperienze d’interfaccia neuroni-chip e meccanismi di comunicazione
Già dai primi anni ottanta furono condotte con successo, per la prima volta, delle
ricerche aventi l’obiettivo di stabilire un’interfaccia elettrica biunivoca tra le cellule
nervose e le microstrutture semiconduttrici. Inizialmente vennero utilizzati i neuroni delle
sanguisughe, grandi e quindi facili da manipolare, accoppiati con dei microtrasduttori
integrati in una piastra di materiale conduttore. In queste condizioni si sfruttavano
impulsi capacitivi per innescare i potenziali d’azione, e FET (field effect transistor) per
monitorarne l’attività.
Di particolare rilevanza furono gli esperimenti condotti da Peter Fromherz presso
il Max Planck Institute of Biochemistry di Monaco intorno agli anni ‘90. In questi
esperimenti Fromherz riuscì a definire al meglio gli aspetti prettamente fisico-elettrici
propri della giunzione cellule nervose e chip [Wei&Al96]. Egli riuscì a definire quali
dovessero essere i principi di un mezzo conduttivo interfacciato ad un substrato di
carattere biologico:
Disponibilità di una tecnologia solida e avanzata nel campo dei semiconduttori
per la fabbricazione di dispositivi elettronici microscopici (spessore compreso tra
10-1.000 nm).
Necessità di sopprimere il trasferimento di elettroni, necessità di eliminare
processi elettrochimici che causano la corrosione del materiale conduttore e il
concomitante danneggiamento delle cellule.
Necessità che il substrato sia inerte per consentire la coltura di neuroni.
Frohmerz individuò nel silicio (Si) tutte le proprietà necessarie per dare origine
all’interfaccia neurone–chip in maniera rigorosa e scientifica. Il silicio, per essere reso
inerte, poteva essere infatti ricoperto da un sottile strato di biossido di silicio (SiO2)
[Fro03].
Come sappiamo le cellule nervose, aventi un diametro di 20 µm, sono circondate
da una membrana elettricamente isolante. Un sottile strato, spesso circa 5 nm, separa
73
3. Strumentazione hardware
l’elettrolita intracellulare dall’ambiente extracellulare. Inoltre, la corrente elettrica
attraverso la membrana è mediata da specifici canali proteici per il sodio e il potassio con
una conduttanza di circa 10-100 pS.
I neuroni e gli elettroliti sono conduttori di ioni, mentre il silicio è un conduttore
di elettroni. In linea teorica, l’accoppiamento del segnale ionico neurale e del segnale
elettronico del semiconduttore può essere ottenuto attraverso il fenomeno di
polarizzazione elettrica. Se lo strato lipidico isolante del neurone è in diretto contatto con
il sottile strato isolante di biossido di silicio del chip, si dovrebbe venire a formare un
dielettrico in grado di mediare un’interazione capacitiva (figura 32a e 32b). Un campo
elettrico che attraversa la membrana, come quello solitamente instaurato dall’attività
neurale, è in grado di polarizzare il biossido di silicio in modo tale che la struttura della
banda elettronica del silicio e il transistor integrato vengano eccitati (figura 32a).
Viceversa, un campo elettrico causato da un voltaggio applicato al chip attraversante il
biossido di silicio, è in grado di polarizzare la membrana in maniera tale che le
conformazioni delle proteine di membrana sensibili a campi elettrici, come ad esempio i
canali ionici voltaggio dipendenti, siano attivati (figura 32b).
In realtà, quando una cellula nervosa cresce sul chip non ci si può aspettare che lo
strato lipidico della cellula e lo strato ossidato di silicio (SiO2) formino un dielettrico
coerente e compatto. L’adesione cellulare è mediata infatti da molecole proteiche che
protrudono dalla membrana cellulare (integrine, glicocalice) e si depositano sul substrato.
Queste proteine mantengono il core lipidico della membrana ad una certa distanza dal
substrato, generando un distacco tra la cellula e il chip, che verrà riempita dall’elettrolita
(figura 32c e 32d). Questa situazione ha l’inconveniente di schermare il campo
elettrico e di sopprimere una diretta mutua polarizzazione del biossido di silicio e della
membrana.
La giunzione cellula-silicio rappresenta quindi un conduttore elettrico planare
definito core-coat per le sue caratteristiche di conduttore. Il coat è rappresentato dallo
strato di biossido di silicio e dalla membrana i quali isolano il core, rappresentata dalla
regione fra il neurone ed il chip, dall’ambiente conduttivo del citoplasma e del silicio.
A questo punto l’attività di un neurone porta ad una corrente ionica dislocata
attraverso la membrana. Questo determina una concomitante corrente lungo il core che dà
74
3. Strumentazione hardware
origine poi ad un Transductive Extracellular Potential (TEP) tra la cellula e il chip. Per
contro, un transiente di voltaggio applicato al silicio porta all’insorgenza di una corrente
dislocata sul “coat” di SiO2. Di conseguenza, un secondo TEP apparirà tra il chip e la
cellula, a causa della corrente che scorre lungo il core. Il TEP viene infine registrato
attraverso appositi “device” presenti in prossimità del chip. Infatti, il “Transductive
Extracellular Potential” indotto dal neurone origina un campo elettrico che attraversa il
biossido di silicio per venir poi registrato da un apposito transistor (rappresentato in
giallo in figura 32c). Il TEP indotto dal chip invece origina un campo elettrico attraverso
la membrana che è registrato dai canali ionici voltaggio dipendenti (figura 32d).
Figura 32: Interfaccia iono-elettrica
I neuroni e il silicio sono pertanto accoppiati attraverso il “Transductive Extracellular
Potential”, che è il risultato del bilancio di corrente esistente nella giunzione del
conduttore core-coat [Fro03]. Per descrivere correnti e voltaggi di questi sistemi
solitamente vengono utilizzati due modelli equivalenti (figura 33).
75
3. Strumentazione hardware
Vj
Figura 33: Modelli di contatto cellule-semiconduttore
La giunzione cellula-semiconduttore ha una natura fisica simile a quella di un
nucleo conduttore isolato.
Le correnti elettriche e la diffusione degli ioni sono le entità che governano le
stimolazioni e le registrazioni dell’attività delle cellule nervose sui chip. L’eccitazione di
una cellula neurale causa l’insorgenza di un potenziale d’azione. Durante un potenziale
d’azione, le correnti capacitive e ioniche scorrono attraverso la membrana in contatto col
chip. La corrente è spinta attraverso la resistenza del nucleo conduttore dando così
origine nella giunzione ad un voltaggio extracellulare Vj(t) dipendente dal tempo (figura
33) [Fro95]. Se sufficientemente forte, lo stimolo è in grado di influenzare la membrana
cellulare, e quindi aprire i canali ionici voltaggio-dipendenti e generare quindi un
potenziale d’azione.
L’efficienza dell’accoppiamento neurone-silicio dipende dalla resistenza della
giunzione e dalla corrente che attraversa la membrana cellulare collegata alla giunzione
stessa, ma non solo: è importante capire anche quale debba essere la distanza che separa
il chip dalla cellula e quale sia la sua resistenza elettrica.
La misurazione della distanza tra chip e cellula è stata determinata attraverso una
procedura denominata microscopia FLIC ( fluorescence interference contrast), che si basa
su alcune proprietà del silicio, tra le quali quella di riflettere la luce visibile (figura 34).
76
3. Strumentazione hardware
Figura 34: FLIC (fluorescence interference contrast)
Consideriamo un doppio strato lipidico in contatto con il biossido di silicio (figura 35).
La membrana deve essere marcata con sonde fluorescenti di molecole anfifiliche con
transizione di dipolo giacente nel piano della membrana (rappresentate in nero).
Figura 35: Sezione del doppio strato lipidico marcato su SiO2
Sotto illuminazione, la luce è riflessa sotto qualsiasi interfaccia. Anche la luce
fluorescente emessa dalle molecole sonda viene riflessa. A causa degli effetti
d’interferenza l’eccitazione, e quindi la fluorescenza delle sonde, dipende dalla distanza
tra la membrana e il silicone. Perciò, in base a queste considerazioni è possibile derivare
la distanza dj esistente tra chip e membrana neurale: in quanto è possibile direttamente
misurare l’intensità di fluorescenza Jn, e come presentato di seguito sfruttando
l’equazione inversa, è possibile risalire al valore di dj che si desidera stimare [Fro03]:
77
3. Strumentazione hardware
E’ stato osservato che variando i tipi di cellule utilizzate variava significativamente anche
la distanza dj. Questo differente comportamento è imputabile alle diverse forze
entropiche delle molecole proteiche ancorate alla membrana e ovviamente depositate sul
chip. Esse originano forze antropiche repulsive che bilanciano le forze attrattive fra
cellule e integrine e laminine. Un importante traguardo in futuro sarebbe quello di
riuscire a diminuire la distanza tra cellule e superficie del chip anche attraverso
modificazioni genetiche della membrana.
A questo punto, cerchiamo d’approfondire maggiormente il funzionamento e
l’interazione del chip col substrato biologico. Sappiamo che un potenziale d’azione
conduce una corrente elettrica attraverso la membrana della cellula e attraverso il gap che
separa cellula e chip. Il voltaggio extracellulare Vj(t), che modula la struttura del
semiconduttore, nasce quindi da una sovrapposizione di tutte le correnti, ioniche e
capacitive, presenti nel contatto. La forma e l’ampiezza del segnale è controllata invece
dall’accumulo e dal rilascio delle conduttanze di ioni (nella membrana) e dalla specifica
conduttanza della giunzione [Fro95]. E’ stato osservato che i chip sono in grado di
registrare una grande quantità e varietà di segnali possibili, in base al tipo di cellula e in
base alla superficie di contatto tra le cellule e il biossido di silicio, sono stati stereotipati
quindi tre principali classi (figura 36) [Sch&Fro98]:
Figura 36: Le tre classi del segnale: Vm = potenziale intracellulare
Vj = potenziale extracellulare
78
3. Strumentazione hardware
1) Il voltaggio extracellulare è proporzionale alla derivata prima del potenziale
d’azione. Questa risposta, definita di tipo A, si manifesta quando tutta la
conduttanza ionica (G= 1/R [S]) è esaurita, e domina la corrente capacitiva.
2) Il voltaggio extracellulare è proporzionale al potenziale d’azione stesso. Questa
risposta definita di tipo B s’osserva tipicamente quando una conduttanza prevale
nel contatto col chip in modo che una corrente ohmica, attraversante la membrana
e il gap, sia in grado di controllarne il voltaggio extracellulare.
3) Il voltaggio extracellulare assomiglia all’inverso della derivata prima del
potenziale d’azione. Questo segnale si presenta quando diverse conduttanze di
ioni si accumulano nella giunzione.
Spesso l’ampiezza delle registrazioni del potenziale extracellulare è piccola a causa di
un’alta conduttanza di giunzione se confrontata con la conduttanza ionica effettiva
[Piz&Al04A]. L’obbiettivo futuro sarà pertanto quello di ottimizzare maggiormente la
fase di registrazione migliorando il contatto tra cellule e silicio, aumentando la resistenza
specifica e riducendo l’ampiezza del gap di giunzione; oppure abbassando il rumore dei
transistor migliorandone il design e la fabbricazione.
Una volta definita l’interfaccia elettrica di un singolo neurone, il passo successivo
è stato quello di creare una rete neurale biologica complessa interfacciata con il chip. I
percorsi della matrice extracellulare, dove far sviluppare le connessioni, vengono creati
mediante fotolitografia UV . Posizionando una cellula in una regione di “partenza” è stato
osservato un preciso sviluppo delle biforcazioni secondo i pattern stabiliti (figura 37a).
Questo tipo di organizzazione ottenuto in fase di crescita fu definito chemical guidance.
Figura 37: Sviluppo dei neuriti attraverso pattern chimici
79
3. Strumentazione hardware
Tuttavia questa metodologia evidenziava due principali problemi:
Inizialmente i neuriti seguono le guide chimiche tracciate, ma nelle fasi
successive uscivano dalle linee guida (figura 37b).
I neuriti seguivano tutti i pattern guida ma non era possibile specificare la crescita
in base ad un solo pattern né in una specifica direzione.
Ultimamente è stata definita una nuova soluzione al problema relativo alla genesi
di reti nervose biologiche su piastre d’interfaccia neuroni - chip. Oggi, infatti, si è
principalmente abbandonata l’idea di creare specifiche reti biologiche. Ciò che si cerca di
creare è invece una rete neurale “caotica”, ottenibile facendo crescere i neuroni
liberamente sul substrato di silicio, cercando di caratterizzarne le risposte in seguito a
stimoli [Can&Al97, Mis&Al98].
Questo è anche il modo di procedere messo a punto negli esperimenti condotti dal nostro
gruppo di ricerca.
In sostanza numerosi passi in avanti devono essere ancora compiuti per cercare di
migliorare i risultati ottenibili attraverso questa interessante e innovativa tecnologia.
Per quanto riguarda i semiconduttori, si dovranno costruire microstrutture meno sensibili
al rumore, potenziandone le qualità di registrazione del chip nelle “gap junction”.
Per quanto concerne le cellule, invece, sarà necessario risolvere i problemi di carattere
strutturale (glicocalice, canali ionici) e sviluppare una tecnologia in grado di far crescere i
neuroni in modo predicibile e controllato per poter creare successivamente reti neurali
con precise caratteristiche connettive-topologiche.
3.3 Microelectrode array (MEA)
Un array planare di microelettrodi (MEA) è un arrangiamento di molti elettrodi
(tipicamente 60) che consentono il raggiungimento di differenti siti per effettuare in
contemporanea una stimolazione e una registrazione extracellulare (figura 38). Le
differenti linee cellulari possono essere coltivate direttamente su MEA per un periodo di
qualche settimana, mentrei tessuti sezionati (tissue slices) vengono adagiati sull’array.
80
3. Strumentazione hardware
Figura 38: Dispositivo MEA
Applicazioni tipiche riguardanti i MEA sono: lo screening di canali ionici, il
“testing” di nuovi farmaci, lo studio della neurogenesi, l’analisi di microecefalogrammi
(EEG) e studi di altro genere. Inoltre questi microelectrode array possono anche essere
impiegati per effettuare studi sia in vitro che in vivo.
Un biosensore MEA standard è caratterizzato da un’area quadrata di dimensioni
variabili tra i 700 µm e i 5.000 µm di lunghezza. In quest’area, 60 elettrodi sono allineati
in una griglia 8 x 8 con una distanza variabile fra gli elettrodi di 100, 200, o 500 µm. Gli
elettrodi planari sono solitamente disponibili in dimensioni di 10, 20, o 30 µm [Lei05]
(figura 39a e 39b).
Figura 39: Analisi della struttura di un MEA
Oggigiorno i microelettrodi possono essere costituiti da differenti materiali:
possono essere di platino (Pt) (la maggior parte dei MEA nel recente passato utilizzava
81
3. Strumentazione hardware
questo materiale a causa delle sue buone proprietà sfruttabili in questa applicazione), di
nitruro di titanio (TiN), che oggi pare essere il materiale più utilizzato, o infine d’oro
(Au), potenzialmente molto buono e resistente ma ancora poco utilizzato a causa del suo
alto costo.
Evidenziamo ora le peculiarità che rendono il TiN leder nella progettazione degli array
planari di microelettrodi. La microstruttura del nitruro di titanio è infatti caratterizzata da
una larga area superficiale che permette di creare elettrodi con un eccellente rapporto
segnale rumore. TiN è un materiale molto stabile, con una lunga vita e adatto, per le sue
caratteristiche, ad essere impiegato più volte in diversi esperimenti. E’ stato stabilito che
un MEA con microelettrodi di nitruro di titanio possa essere riutilizzato in media per una
trentina di misurazioni. L’impedenza di un elettrodo di TiN piatto e circolare varia tra 20
e 400 Kilohms, in base al suo diametro. Più piccolo è un elettrodo e tanto maggiore sarà
la sua impedenza. Da un lato in un elettrodo è desiderabile avere un basso valore di
impedenza, ma dall’altro, è bene avere anche delle piccole dimensioni, quindi nella
progettazione si cerca un compromesso.
Come già accennato i valori di rumore risultano essere molto bassi, infatti il livello medio
s’attesta attorno ai 10-15 µV anche se molto dipende dalle dimensioni dell’elettrodo
considerato: infatti tanto minore è l’elettrodo e tanto maggiore è il rumore che si registra.
Molto importante è infine sottolineare che l’attività di spike di un neurone può essere
registrata, mediante MEA, fino ad una distanza massima di 100 µm tra neurone ed
elettrodo. Ovviamente più piccola è la distanza e tanto migliori saranno le caratteristiche
del segnale extracellulare registrato [Lei05].
Tutti gli elettrodi, i quali devono essere necessariamente di alta qualità e
altamente biocompatibili, vengono fissati in un materiale di supporto, solitamente vetro. I
circuiti standard in un MEA sono fatti di titanio (Ti) o di ossido di indio stagno (ITO) e
sono elettricamente isolati con nitruro di silicio (PEVCD). La superficie di contatto e i
circuiti sono trasparenti consentendo anche una perfetta visione al microscopio.
Differenti tipi di biosensore MEA sono oggi disponibili sul mercato. Le
sostanziali differenze riguardano i tipi di materiali utilizzati, la geometria dell’area di
registrazione, le dimensioni degli elettrodi e le distanze esistenti tra essi:
82
3. Strumentazione hardware
Standard-MEA: caratterizzato da una griglia di elettrodi circolari di nitruro di
titanio 8 x 8, impiegabile per tutti i generi di applicazione.
Hexal-MEA: caratterizzato da un layout esagonale, perfetto per effettuare
registrazioni dalla retina.
Thin-MEA: caratterizzato da uno spessore di soli 180 µm, ideale per ottenere
risultati ad alta risoluzione.
3-D MEA: Utilizzato per studiare l’atività elettrica di porzioni di tessuto (tissue
slices) sfruttando i suoi elettrodi di platino in grado di penetrare in strati più
profondi.
Flex-MEA: costituito di materiale flessibile, ideale per le applicazioni in vivo.
Negli studi condotti dal nostro gruppo di ricerca è stato sempre impiegato lo “StandardMEA”.
Prima di poter registrare qualsiasi tipo di segnale tramite un array planare di
microelettrodi è necessario effettuare alcune necessarie operazioni di “pre-trattamento”.
Infatti, qualsiasi biosensore tra un esperimento e l’altro tende naturalmente a diventare
idrofobico. Questo comportamento previene l’attacco delle cellule (idrofiliche). Quindi,
la prima operazione da compiere è quella di rendere la superficie nuovamente
sufficientemente idrofilica per stabilizzare l’adesione cellulare. L’operazione standard è
un particolare lavaggio, che verrà descritto più avanti.
Prima di procedere con la stesura di materiale organico come cellule o tessuti, è anche
necessario effettuare un’operazione di sterilizzazione, solitamente mediante l’impiego di
etanolo al 70% o luce UV, è sufficiente solitamente effettuare questo trattamento per
circa mezz’ora.
Successivamente per aumentare e migliorare sia l’attacco che la crescita di una cultura
cellulare si ricoprire il biosensore con diversi materiali, ad esempio nitrocellulosa,
polietileneimmina, fibronectina o concanavilina A.
Concluse tutte queste operazioni si giunge quindi alla fase di stimolazione e di
registrazione. Punto nodale di questa fase è la messa a terra del sistema. Infatti, se questo
non venisse eseguito correttamente, si registrerebbe un segnale in output affetto da
un’alta instabilità e da uno specifico rumore in prossimità della frequenza di 50 Hz e dei
sui multipli (figura 40).
83
3. Strumentazione hardware
Figura 40: sx) Registrazione di un segnale corretto dx) Segnale non correttamente messo a terra
Per quanto riguarda l’invio dello stimolo, ovviamente dall’elettrodo alla cellula, bisogna
tenere in considerazione il particolare comportamento dell’elettrodo, che si comporta
come un tipico condensatore piano. In particolare bisogna tener conto del tempo di
scarica necessario tra due stimoli consecutivi, poiché è stato osservato che in qualche
modo questo interferisce con la fase di registrazione del segnale.
In aggiunta, s’è osservato come, alla lunga, gli elettrodi possano andare anche
incontro a deteriorazione a causa dell’elettrolisi. Per ridurre questo effetto è bene
utilizzare, come accorgimento, un impulso “bifasico” per la stimolazione delle cellule
adese su MEA. Il segnale utilizzato come stimolo deve quindi essere seguito da un
segnale inverso di ugual area, che abbia la funzione di scarica dell’elettrodo. Il modo più
semplice per far ciò è quello d’utilizzare un segnale di ugual ampiezza ma di polarità
opposta. L’impulso bifasico, rispetto a quello monofasico, ha anche l’importante
peculiarità di riportare a zero il potenziale elettrico dell’elettrodo così che il successivo
impulso possa essere di nuovo prontamente e correttamente misurato (figura 41) [Lei05].
Figura 41: sx) Impulso monofasico di stimolazione dx) Impulso bifasico di stimolazione
84
3. Strumentazione hardware
Nel momento in cui tutti i precedentemente punti vengono correttamente eseguiti,
la fase successiva è quella di iniziare poi l’interpretazione degli output di registrazione
della rete biologica coltivata.
3.4 Interfaccia delle nostre cellule staminali neurali con dispositivi MEA
Negli esperimenti che verranno illustrati in questo lavoro di tesi, le cellule
staminali neurali fetali descritte nel primo capitolo sono state impiegate per la
generazione di reti nervose adese su dispositivi MEA a nostra disposizione (figura 42).
Figura 42: Dispositivo Standard-MEA utilizzato
Come precedentemente descritto le cellule staminali si prestano perfettamente ad
esperimenti di questo tipo, in quanto mostrano un’alta capacità di adattamento,
proliferano in modo esponenziale, sono capaci di differenziare e maturare efficacemente
su MEA.
Lo stock di cellule staminali neurali a nostra disposizione sono, come detto, sotto
forma di neurosfere; pertanto per poterle far crescere su MEA queste devono subire un
trattamento di dissociazione meccanica che le renda prone ad essere piastrate sul supporto
bidimensionale di crescita dell’array di microelettrodi. Quindi le cellule vengono adagiate
su un letto di matrigel a contatto con i microelettrodi.
Il matrigel è un “composto” costituito da laminina, collagene IV, proteoglicani,
entactina, nidogeno e altre proteine fibrose, e in buona sostanza rappresenta il substrato
sul quale le NCS dovranno maturare e differenziarsi.
85
3. Strumentazione hardware
Secondo i passaggi descritti precedentemente nel paragrafo 3.3 anche i MEA da
noi utilizzati devono essere lavati e sterilizzati dato che sono dispositivi assemblati
sfruttando silicone, il quale essendo neurotossico potrebbe provocare la morte delle
cellule nervose coltivate [Whe03] (figura 43).
Silicone
Figura 43: Visualizzazione dello strato di silicone sui dispositivi MEA
Di seguito sono stati riportati i passaggi eseguiti per la sterilizzazione dei nostri
biosensori. Quest’operazione è eseguita prima di ogni sessione sperimentale:
-
Lavaggio della piastra del “microelectrode array” con alcool 70%.
-
Esposizione della piastra per 6 ore in H2O distillata.
-
Esposizione della piastra per altre 6 ore in alcool 70%.
-
Nº 4 risciacqui della piastra con detergente acido non saponato, nuovo lavaggio
con alcool al 70%.
-
Lavaggio con H2O distillata.
-
Esposizione della piastra a raggi UV “overnight” in H2O distillata.
-
Asportazione H2O ed esposizione della piastra sotto cappa sterile fino a completo
asciugamento.
Terminato il processo di sterilizzazione, è possibile procedere all’adesione del
matrigel. Questa “molecola”, ricavata dal sarcoma di topo, si trova allo stato liquido a
4°C e gelifica in 20 minuti se portata a 37°C. In questo caso si sono fatte delle piccole
modifiche alla procedura standard. Infatti, nei nostri esperimenti il matrigel viene fatto
gelificare overnight anziché in soli 20’, questo per prevenire problemi di adesione
cellulare riscontrati in precedenti esperimenti.
86
3. Strumentazione hardware
Successivamente, avendo piastrato 50.000 NCS su ogni MEA e avendo fornito
alle NCS il giusto “cocktail” di fattori di crescita (FGF2, GDNF, BDNF, CTNF per 10
gg. e FCS al 2% per i successivi 15 gg.), dopo 25 giorni si sono ottenute cellule nervose
mature a stadio completo. Successivamente, è possibile iniziare la fase di registrazione.
Infine, osservando al microscopio i MEA così trattati, è possibile notare come
numerose cellule nervose differenziate si localizzino in prossimità dei microelettrodi
(figura 44).
Figura 44: Cellule nervose derivate da NCS
3.5 Schermature elettromagnetiche ed ottiche
Avendo l’ambizione di indagare fenomeni non classici riguardanti la
comunicazione di cellule nervose nella scala dell’ultra-piccolo, è stato essenziale mettere
a punto un sistema di schermatura sia elettromagnetica che ottica che prevenisse
eventuali interferenze che avrebbero potuto falsificare i risultati degli esperimenti
condotti.
Per ottenere una buona schermatura dei fenomeni di natura elettromagnetica,
l’intero box di plexiglass dove vengono poste le diverse piastre sottoposte a registrazione,
è rivestito interamente con una rete d’ottone di maglia 1 mm. Il principio fisico che sta
alla base di questa schermatura è la così detta “gabbia di Faraday” che permette di
confinare tutte le cariche elettriche e magnetiche esclusivamente sulla superficie esterna
87
3. Strumentazione hardware
della gabbia, rendendo conseguentemente l’ambiente interno perfettamente isolato da
qualsiasi tipo di fenomeno elettromagnetico [Can97]. In aggiunta, durante la fase di
registrazione, alcune piastre possono anche essere ricoperte da un doppio strato di fogli
d’alluminio avvolgenti uno spesso cilindro cavo di plastica (spessore 2 mm), agente
anch’esso come ulteriore schermo elettromagnetico nel caso in cui la prima gabbia di
Faraday non risultasse sufficiente. Ovviamente tutto il sistema è scaricato a terra.
Per ottenere invece la schermatura ottica di una determinata piastra, chiaramente
non sottoposta a stimolazione laser, viene aggiunta alla schermatura in alluminio uno
spesso strato di cartone (3,5 mm) il quale, seppur non costituendo una sicurissima
protezione e un sicurissimo isolamento fotonico, dovrebbe essere più che sufficiente nella
schermatura di particelle fotoniche emesse dalla fonte laser. Infatti, la luce laser è per sua
definizione coerente e non presenta fenomeni di rifrazione.
Figura 45: Schema schermatura piastre
In figura 45 è stata schematizzata la situazione in cui si effettua, nei nostri esperimenti, la
stimolazione laser. Le piastre (rappresentate circolarmente in blu) sono contenute in una
grossa gabbia di Faraday (quadrato arancio). Il laser (freccia blu) si trova esterno alla
gabbia di Faraday e colpisce una singola piastra. Le piastre rimanenti all’interno della
gabbia, possono essere una schermata dalla seconda gabbia di Faraday attraverso il
cilindro concavo rivestito di alluminio, che funge anch’esso da scudo ottico (cerchio
rosso), il tutto avvolto anche dal box di cartone (quadrato verde); l’altra invece è
circondata esclusivamente dallo spesso strato di cartone che la rende otticamente
88
3. Strumentazione hardware
impenetrabile alle particelle di fotoni. L’aggiunta dello strato di cartone rappresenta una
precauzione introdotta solo in seguito all’esperimento IX.
3.6 Emissione impulsi laser
Negli esperimenti condotti, si effettua una stimolazione delle cellule nervose
adese su una piastra per mezzo di una sorgente luminosa emessa da un diodo laser.
Il motivo dell’utilizzo di un dispositivo laser è in linea con tutte le teorie emerse
dai Quantum Brain Models che affermano la possibilità che i neuroni (cellule nervose)
possano dare origine a specifiche vie comunicative subatomiche sfruttando particelle
fotoniche. Quindi, per poter indagare fenomeni non classici di questo genere si deve
necessariamente impiegare, come detto, un’adeguata sorgente laser.
La parola laser deriva dall’acronimo “Light Amplification by Stimulated
Emission of Radiation” (amplificazione della luce per mezzo dell’emissione stimolata di
radiazioni). Già dal nome si comprende che il funzionamento si basa sul principio
dell’emissione stimolata della luce. Fornendo all’atomo una certa quantità di energia,
sotto forma ad esempio di calore o attraverso un campo elettrico applicato, gli elettroni
presenti nell’ultima orbita vengono resi liberi (operazione di pompaggio). In una
rappresentazione a bande di energia questo fatto corrisponde alla transizione di un
elettrone da un livello energetico inferiore (banda di Valenza) ad uno superiore (banda di
Conduzione) superando la zona interdetta denominata GAP (figura 46).
Banda di conduzione
Fotone incidente
GAP
Banda di valenza
Figura 46: Schema di emissione luce stimolata
L’elettrone, tuttavia, non rimane per molto tempo nel livello energetico superiore perché
tende spontaneamente a ritornare al livello fondamentale; in questa fase di ritorno esso
89
3. Strumentazione hardware
cede l’energia che prima era servita al salto energetico, emettendo una radiazione
luminosa (fotone) [Sve91].
Il fenomeno dell’ emissione stimolata avviene, invece, quando un fotone esterno
colpisce un elettrone che si trova sul livello d’energia superiore forzandolo a tornare al
livello fondamentale; l’elettrone cede allora l’energia in eccesso sotto forma di un
ulteriore fotone, caratterizzato sempre dalla stessa direzione e dalla stessa fase di quello
incidente. Inoltre i fotoni generati mediante l’emissione stimolata hanno anche una
medesima lunghezza d’onda, dato che tutti compiono la stessa transizione energetica.
Per dare continuità al processo di emissione stimolata occorre confinare una parte
dei fotoni generati in modo da instaurare un regime di oscillazione. A tale scopo vengono
realizzate ai lati del diodo laser due superfici ad elevato indice di rifrazione. Su queste
superfici i fotoni vengono continuamente riflessi avanti e indietro, determinando un
regime di oscillazione all’interno della cavità in cui il fenomeno di emissione stimolata
continua a generare fotoni che in parte verranno emessi (in base all’angolo di rifrazione),
ed in parte rimarranno confinati nella cavità risonante. Solitamente la superficie emittente
è caratterizzata da un indice di rifrazione tale che l’ angolo risulti molto piccolo, per cui
solo i raggi che raggiungono la superficie con angolo di incidenza minore dell’ angolo
limite vengono emessi dal dispositivo, ottenendo così un fascio di luce diretto,
unidirezionale, coerente e monocromatico [Sve91].
Negli esperimenti eseguiti è stato utilizzato un laser a gas elio-neon a luce visibile
caratterizzato da una lunghezza d’onda pari a 630 nm e potenza di 2 mW (figura 47), con
una modulazione picco – picco di 500 mV per responsi lineari. La potenza di emissione è
stata però volutamente ridotta per evitare lesioni alle cellule sottoposte a luce coerente.
Figura 47: Struttura diodo laser utilizzato
90
3. Strumentazione hardware
Infine per quanto riguarda il modulatore laser questo è controllato da un apposito
circuito elettronico il quale, oltre a produrre gli impulsi di modulazione in OOK (On Off
Key), mantiene costante la corrente fornita al diodo laser.
3.7 Amplificatore
Una volta che il segnale elettrico viene registrato da uno dei microelettrodi planari
tramite un cavo schermato, questo viene inviato ad un amplificatore ad alta impedenza in
ingresso (A1) per ottenere una prima amplificazione, successivamente questo passa
attraverso due filtri Notch, accordati sulla frequenza di 50 Hz, al fine di eliminare
l’eventuale presenza di disturbi generati dalla rete elettrica. Dopo i filtri il segnale subisce
un’ulteriore amplificazione (A2) e tramite accoppiatori isolati (ISO) è trasferito alla
scheda di acquisizione installata a bordo del computer di gestione e registrazione (figura
48).
Figura 48: Schema circuito amplificatore
91
3. Strumentazione hardware
3.8 Oscilloscopio
L’oscilloscopio è uno strumento utile nell’analisi dei segnali in quanto permette di
visualizzare come sono fatte realmente le funzioni d’onda. Nell’uso più comune
l’oscilloscopio effettua la presentazione sullo schermo dell’andamento nel tempo (asse x
orizzontale) di una tensione elettrica (asse y verticale).
L'elemento essenziale dell'oscilloscopio è il tubo a raggi catodici (CRT), nel quale
un fascio di elettroni emessi dal catodo, viene focalizzato e accelerato colpendo
internamente lo schermo fluorescente del tubo (figura 49). Il fosforo che riveste la parete
interna del tubo produce un punto luminoso visibile sullo schermo.
Figura 49: CRT di un oscilloscopio
Sincronizzando opportunamente l'oscillatore locale al segnale d'ingresso, grazie alla
persistenza della luce sulla retina dell'occhio, e' possibile vedere la rappresentazione della
tensione elettrica nel dominio del tempo [Buf04].
Il grafico rappresentato sullo schermo dell’oscilloscopio può fornire molteplici
informazioni in maniera istantanea, quali ad esempio:
-
La tensione massima e minima del segnale, e quindi l’escursione picco – picco.
-
Il periodo di una forma d’onda (quindi anche la frequenza).
-
La presenza di distorsioni.
-
La presenza di disturbi e rumore.
-
Infine, persino la forma d’onda.
Avendo a disposizione questo importante strumento, sono state conseguentemente fatte
prove volte a determinare il rumore presente in ognuno dei quattro canali. Il rumore
92
3. Strumentazione hardware
durante tutti i test si è mantenuto sempre al di sotto dei 2 µV, indicando quindi l’assenza
di auto-oscillazioni o segnali spuri nella fase di registrazione.
Un’altra importante verifica è stata quella di evidenziare eventuali problemi di
“cross-talk” tra i canali di uno stesso dispositivo MEA. Per far ciò sono stati
progressivamente “iniettati” in un singolo canale diversi segnali caratterizzati da un
potenziale compreso tra i 5 e gli 80 mV. In seguito s’è cercato di determinare la possibile
presenza dello stesso segnale, sebbene attenuato, anche negli altri canali utilizzati per la
registrazione. Il risultato è stato negativo in quanto non vi era alcuna traccia del segnale
iniettato nel canale usato “come riferimento”. In seguito, sono state compiute le
combinazioni relative ai 4 canali le quali hanno mostrato sempre risultati negativi.
3.9 Scheda d’acquisizione (NI 6052E DAQ)
L’importanza della scheda d’acquisizione nella registrazione di qualsiasi segnale è
importantissima, infatti la conversione dei segnali da analogici a digitali può avvenire
solamente grazie ad essa.
La scheda di acquisizioni dati utilizzata in questi esperimenti è una scheda
multifunzione della National Instrument, nella fattispecie una 6052E. Le caratteristiche
tecniche della scheda sono le seguenti:
-
Numero 16 canali analogici di input con acquisizione a 16-Bit, 333 kS/s.
-
Due canali di output analogici a 16-bit.
-
Numero 8 linee di I/O digitale
-
Due contatori/timer a 24-bit
3.10 Caratteristiche generali del circuito elettronico per la registrazione
Tutto il circuito elettronico è completamente isolato e racchiuso in uno spesso
contenitore metallico, il cui corpo viene connesso ad un conduttore di terra. Inoltre, al
fine di evitare che eventuali segnali spuri potessero influenzare il sistema di
amplificazione si è provveduto ad isolare completamente tutto il circuito elettronico della
sezione di amplificazione.
93
3. Strumentazione hardware
I segnali analogici entranti (acquisizione) e uscenti (dopo l’amplificazione) sono
completamente isolati dall’ambiente esterno tramite speciali circuiti elettronici realizzati
dalla Texas Instruments. Questi circuiti impediscono, di fatto, qualsiasi accoppiamento
tra i circuiti esterni e quelli interni.
Anche i segnali digitali di controllo sono completamente disaccoppiati dal circuito
interno tramite fotoaccoppiatori. In questo modo gli elettrodi connessi alle cellule non
vengono a contatto con l’ambiente esterno di misura/controllo.
Quattro batterie ricaricabili a Ioni di Litio provvedono ad alimentare tutti i circuiti
elettronici, in modo tale da garantire una tensione pulita.
Una sonda termometrica, posta all’interno del box di plexiglass, è stata connessa
ad un circuito elettronico di controllo che provvede ad alimentare alcune resistenze
(figura 50), anch’esse situate all’interno dell’alloggiamento delle vaschette delle cellule,
al fine di mantenere la temperatura costante a 37 ºC. Queste resistenze sono state
realizzate in carbone e alimentate tramite corrente continua. Chiaramente, il box
termoregolato non risolve il problema del mantenimento a livelli ottimali dell’ossigeno e
dell’anidride carbonica, quindi la sopravvivenza delle cellule nervose potrebbe essere
migliorata agendo su questi due importanti parametri.
Figura 50: Box termostatico dove vengono localizzate le piastre
94
3. Strumentazione hardware
3.11 Protocollo esperimenti
Di seguito sono stati riportati i protocolli degli esperimenti più significativi
condotti per evidenziare la presenza di fenomeni non classici in reti biologiche nervose
sviluppate su piastre MEA (figura 51 / 52).
Figura 51: Protocollo esperimento IX
In questo esperimento s’è voluto stabilire inizialmente l’attività elettriche delle cellule
nervose, effettuando una registrazione a vuoto (senza alcuno stimolo eccitatorio) per 15 s.
Successivamente, attraverso differenti e multiple stimolazioni laser (impiegando anche un
elettromagnete) s’è cercato di stabilire e caratterizzare la capacità di generare risposte
coerenti nelle differenti piastre impiegate. Inoltre s’è cercato di indagare la capacità di
generare possibili spike allorquando le vaschette fossero stimolate anche mediante diodi
LED (λ = 466 nm) oltre che da diodi laser.
95
3. Strumentazione hardware
Figura 52: Protocollo esperimento X
In questo esperimento s’è invece voluto stabilire l’effettiva capacità e sensibilità
delle cellule nervose nel fornire risposte organizzate allorquando stimolate in particolari
condizioni. Infatti in questo esperimento sono state introdotte delle schermature ottiche
aggiuntive. Inoltre, sono adottati schemi di stimolazione differenti rispetto agli
esperimenti precedentemente eseguiti al fine di indagare e comprendere in maniera più
esaustiva l’essenza dei fenomeni che precedentemente sono stati registrati.
Tutti i risultati sono descritti in dettaglio nel capitolo 5.
96
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
4. Analisi segnali
registrati in Matlab / R
97
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
4.1 Dai segnali analogici ai segnali digitali
Combinare insieme più mezzi d’espressione è divenuto oggi giorno sempre più
semplice grazie agli sviluppi dell'informatica. I segnali del mondo che ci circondano sono
grandezze analogiche e, per poter trattare queste grandezze con un elaboratore
elettronico, è necessario dapprima convertirle dal formato analogico in formato digitale.
Un segnale è universalmente definito come la variazione di una qualsiasi
grandezza fisica in funzione del tempo. Ad esempio, la pressione dell’aria in un punto
dello spazio è un segnale sonoro; la velocità di un punto della crosta terrestre è un segnale
sismico, la differenza di potenziale tra due elettrodi è un segnale elettrico.
Un segnale è detto analogico quando risulti essere definito per qualsiasi istante di
tempo e possa assumere qualsiasi valore all’interno di un intervallo; chiaramente questo
tipo di segnale è descritto matematicamente sfruttando funzioni continue in ogni punto. A
sua volta, un segnale analogico può essere definito deterministico se è possibile
prevedere con certezza il suo valore ad un istante assegnato una volta che sono noti pochi
parametri. Ad esempio, una sinusoide di cui sia nota l’ampiezza, la frequenza e la fase in
un dato istante, è un segnale deterministico in quanto è possibile ricavare il suo valore in
qualsiasi altro istante successivo. I segnali deterministici in realtà non esistono, in quanto
ogni segnale fisico possiede una certa indeterminazione per cui il suo valore non può
essere mai previsto con infinita esattezza. Altri segnali analogici possono essere definiti
aleatori. In questi tipi di segnale è possibile prevedere solamente la probabilità che il
segnale assuma un certo valore ad un dato istante. Per caratterizzare un segnale aleatorio
devono essere definite due funzioni: la densità di probabilità e la funzione di
correlazione. La prima dà la probabilità che il segnale assuma un dato valore, la seconda
fornisce una relazione tra i valori del segnale ad istanti di tempo diversi. Il caso più
frequente è quello in cui la distribuzione del segnale è di tipo gaussiana, mentre se il
valore del segnale ad un dato istante è completamente scorrelato da quello di istanti
precedenti e successivi allora in questo caso si parla di rumore bianco.
Per permettere ad un calcolatore di elaborare un segnale analogico di qualsiasi
natura bisogna dapprima convertirlo in un segnale di tipo elettrico. In questo modo è
possibile inviare il segnale ad una scheda di acquisizione che è in grado di trasformare il
segnale in una tabella di numeri binari interi, gli unici in grado di essere gestiti da un
98
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
calcolatore, e che infine l’utente leggerà come numeri decimali dopo un’appropriata
conversione (nei nostri esperimenti è utilizzata la scheda “NI 6052 DAQ National
Instruments”).
La scheda compie due distinte operazioni sul segnale analogico registrato:
La discretizzazione: consiste nel misurare l’ampiezza del segnale ad intervalli di
tempo prefissati.
La quantizzazione: consiste nella trasformazione dei valori misurati in numeri
interi binari.
La delicata fase di trasduzione del segnale, effettuata dalla scheda di acquisizione dati,
può a volte essere anche influenzata da “sorgenti rumore” che provocano fluttazioni del
segnale registrato. Le cause sono molteplici, si va dalla temperatura (rumore termico),
alla quantizzazione della carica dell’elettrone; dai campi elettrici presenti nelle vicinanze
dell’apparecchio (ad esempio la linea a 50 Hz), alle vibrazioni meccaniche. Ulteriore
rumore sarà introdotto nella trasduzione del segnale lungo la linea elettrica, o quando il
segnale verrà amplificato o manipolato.
La discretizzazione consiste nel misurare l’ampiezza del segnale ad intervalli di
tempo
prefissati
[Mit98].
Ovviamente
l’intervallo
di
tempo
∆T
dev’essere
sufficientemente piccolo in modo da riuscire ad individuare anche piccole variazioni del
segnale. Molto spesso invece di esprimere il valore di ∆T si preferisce definire la
frequenza di campionamento (fs) indicante quante volte al secondo viene effettuata la
misura dell’ampiezza del segnale.
fs = 1
∆T
Consideriamo il seguente esempio: ∆T = 5s quindi fs = (1/5)= 0,2 Hz.
I
s
Figura 53 : Esempio di discretizzazione
99
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
In questo esempio il campionamento utilizzato non è in grado di misurare bene né il
minimo, né le piccole irregolarità del segnale (figura 53). In questo caso sarebbe
auspicabile un campionamento più fitto e quindi ad una frequenza maggiore.
La quantizzazione consiste, invece, nella trasformazione delle ampiezze misurate
in numeri interi binari [Mit98]. La precisione con cui viene quantizzato il segnale dipende
solo dalle caratteristiche della scheda utilizzata. Per ottenere le massima risoluzione è
necessario che i valori di Vmax e Vmin registrati rientrino all’interno dell’intervallo
accettato dalla scheda, e che vi si adattino al meglio. A questo scopo è necessario
amplificare oppure attenuare il segnale trasdotto.
Il segnale che deriva dalla discretizzazione e dalla quantizzazione consiste
essenzialmente in una sequenza di 1 e 0. Un segnale di questo tipo è detto segnale
digitale.
La dimensione di un segnale può essere determinata considerando che in un
secondo vengono acquisiti 1/∆T = fs campioni di n bit ciascuno, quindi la dimensione del
segnale risultante sarà di fs * n bit * secondi di durata.
I passaggi principali che devono esser compiuti prima di poter analizzare un
segnale analogico in formata digitale possono essere così schematizzati (figura 54):
Segnale fisico
Trasduzione segnale
(microfono, fotodiodo,
etc…)
Scheda
Conversione
analogico -digitale
Calcolatore
Memoria di massa
(hard-disc, CD, USB,
etc…)
Analisi segnale
Figura 54 : Dal segnale fisico alla sua analisi
100
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Infine per effettuare una buona analisi di qualsiasi segnale bisognerebbe sempre
utilizzare valori di T e di fs i più grandi possibili. Tuttavia questo modo di procedere ha
l’inconveniente di limitare enormemente le prestazioni hardware dell’elaboratore che si
utilizza e di non essere sempre molto pratico. Allungare il tempo di lettura ed aumentare
fs porta infatti all’elaborazione di una grossa mole di dati, con problemi di spazio e di
velocità di elaborazione.
4.2 Descrizione algoritmo implementato (DSP-system)
La struttura generale dell’algoritmo per l’analisi dei risultati sviluppato (DSPsystem) è illustrata in figura 55.
DSP-system
MATLAB
Visualizzazione segnale
Piastre MEA con
cellule differenziate
•
Scelta file
•
Suddivisione campioni
Hardware
acquisizione segnali
MATLAB
Analisi segnale
•
Dominio del tempo
•
Dominio della frequenza
R
Validità modello
•
ARIMA
Figura 55 : Schema a blocchi del DSP-system
-
Una volta che i segnali provenienti dalle cellule nervose coltivate su MEA
vengono registrati, previa operazione di filtraggio ed amplificazione, possono in seguito
essere analizzati.
101
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Lo strumento d’acquisizione
che viene impiegato per la cattura dei segnali,
caratterizzato da una frequenza di campionamento di 10kHz, determina l’archiviazione di
un ingente quantitativo di dati per ogni fase di registrazione. Gli esperimenti condotti nel
progetto d’indagine di fenomeni non-classici hanno comportato lo screening di circa 750
Mbyte di dati totali. In media, considerando che la lunghezza di un evento di
registrazione varia da una durata minima di 15 s ad una durata massima di 40 s, è
calcolabile che le dimensione di ogni singolo file abbiano una dimensione variabile di
circa 8,4 e 22,4 Mbyte. Questa mole di dati risulta essere, per ovvi motivi, piuttosto
tediosa e molto difficile da processare sfruttando software già presenti sul mercato come
ad esempio Dataplore, SPSS, Sigview32 o altri. Per queste ragioni s’è cercato di
sviluppare un tool che permettesse di analizzare ad hoc i dati raccolti dai nostri
esperimenti.
La finalità che si è cercato di perseguire nell’implementazione del DSP-system è
sempre stata quella di creare uno strumento di visualizzazione e di analisi dei segnali che
fosse rapido, efficace e il più versatile possibile. L’algoritmo presentato è stato creato
anche con l’obbiettivo di mantenere alta l’interattività dell’utente, facendo in modo che
sia sempre quest’ultimo a cercare di indirizzare, passo a passo, il software verso
l’esaltazione e la messa in evidenza di caratteristiche interessanti; e di poter scegliere
anche quale tipo di analisi effettuare, di volta in volta, in base al tipo di segnale registrato.
Nella fase di “visualizzazione del segnale” vengono compiuti i seguenti passi. Per
prima cosa bisogna selezionare un file da caricare in memoria, ovvero, il segnale che
dovrà essere poi studiato. Secondariamente, il segnale deve essere sezionato in
sottointervalli di dimensioni più piccole, in modo tale di facilitare l’esecuzione e
l’interpretazione dei risultati che saranno in seguito ottenuti.
Nella fase di “analisi del segnale” sono state implementate diverse
procedure di carattere quantitativo e statistico, relative sia al dominio temporale che
frequenziale dei segnali, in modo tale di riuscire a fornire un’interpretazione quanto più
oggettiva dei fenomeni osservati [Piz&Al04B]. Sia la fase di visualizzazione che di
analisi sono state implementate utilizzando il linguaggio di programmazione ad alto
livello Matlab; tuttavia la terza ed ultima fase del DSP-system è stata scritta sfruttando un
linguaggio differente: R. Il motivo per cui si è scelto di passare da Matlab ad R è dovuto
102
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
principalmente al fatto che quest’ultimo risulta essere un programma, rispetto al primo,
molto più adatto per ricerche avanzate nell’ambito delle metodologie statistiche. Matlab,
a differenza di R, essendo molto più versatile nella gestione e rappresentazione dei
segnali è stato preferito per la implementazione delle prime due fasi del DSP-system.
Quindi, procedendo in questo modo, s’è cercato di creare un algoritmo che sfruttasse,
nell’implementazione delle differenti funzioni, solamente i punti di forza dell’uno e
dell’altro metodo, mascherando in questo modo le reciproche debolezze dei due
linguaggi.
- Visualizzazione del segnale
L’algoritmo implementato è stato in buona parte realizzato sfruttando
un’interfaccia interattiva a “menu”. In questo modo si permette all’utente finale di
procedere direttamente alla visualizzazione e all’analisi dei segnali salvati su un qualsiasi
archivio di massa (solitamente il disco rigido). Una volta entrati in Matlab, aperta la
directory “work”, selezionata la sottocartella “DSP-system”, l’unico comando necessario
per lanciare l’algoritmo è quello di digitare al prompt dei comandi l’istruzione “start”.
Fatto ciò, si accede al primo menu dell’algoritmo implementato relativo alla fase di
visualizzazione e selezione del segnale (figura 56).
Il file “start.m” che viene eseguito inizialmente per lanciare il DSP-system
potrebbe essere definito impropriamente, come vedremo di seguito, il cuore pulsante di
questa prima fase.
Infatti, in base alle scelte effettuate attraverso il menu e sfruttando l’istruzione
condizionale “switch” è possibile effettuare delle scelte multiple e, di volta in volta,
accedere ad altri file Matlab per la computazione di determinate funzioni; al termine delle
quali, il compilatore ritornerà nuovamente al file di inizio “start.m” in attesa di una
successiva scelta.
Il menu creato è composto da cinque istruzioni funzionali (le prime cinque) e da una
istruzione d’uscita (l’ultima), che ha la funzione di rompere il looping (while) facendo
terminare di conseguenza anche l’esecuzione del DSP. Questo è il frutto di un approccio
sinergico tra la funzione menu, che consente di creare una lista di scelte da sottoporre
all’utente (1>> Carica file, 2>> Plot globale, 3>> Scelta dei canali, 4>> Divisione dei
103
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
dati, 5>>Divisione specifica dei dati, 6>> Esci); e la funzione switch - case. Ad ogni
bottone del menu creato corrisponde un diverso case. Ad ogni ciclo iterativo, definito
come detto con l’ausilio della funzione while, verrà eseguito solamente un “caso” alla
volta.
Figura 56: Menu d’interfaccia della visualizzazione del segnale
Di seguito vengono dettagliatamente descritte le differenti procedure che sono
state implementate e che vengono compilate dal programma dopo esser state scelte
dall’utente attraverso l’interfaccia sopra enunciata.
Procedura 1: >> Carica file << (carica.m):
Il formato di ogni file contenente i valori campionati dai dispositivi MEA, amplificati e
filtrati dalla scheda d’acquisizione, è di tipo CSV. CSV significa “Comma Separeted
Values” (valori separati da virgola). Si tratta di un formato di solo testo, impiegato per
comprimere il salvataggio di ingenti moli di dati, ed è inoltre anche molto utilizzato nei
database software e nei fogli di calcolo come per esempio “Excel”. In un file CSV, i
104
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
campi di dati sono separati esclusivamente da virgole. Ciò consente quindi ai programmi
che leggono questi file di ricreare la struttura corretta del file stesso, iniziando un nuovo
campo ogni volta che sia presente una virgola.
Ogni nostro file CSV è caratterizzato da un numero variabile di righe, che dipende dalla
durata della misurazione fatta; e da un numero fisso di colonne. Le colonne rappresentano
i canali di stimolazione (solitamente del laser o del LED) e i canali di registrazione
(solitamente due per vaschetta).
Tutti i file CSV registrati al termine dei nostri esperimenti vengono archiviati in un’unica
sottodirectory del DSP-system (CARTELLA_SEGNALE), dalla quale potranno essere
selezionati per essere sottoposti ad un approfondito studio.
A questo punto, sfruttando la funzione dir, è possibile salvare tutti i file della
CARTELLA_SEGNALE in un unico “struct-array”, il quale è caratterizzato da quattro
differenti campi denominati: name, date, bytes e isdir. I campi rappresentano solamente
degli attributi che descrivono determinate caratteristiche dello struct-array. Il campo
“name” è il più importante, è quello infatti nel quale vengono localizzati i diversi
“filename” necessari per risalire in un secondo momento al contenuto numerico del file
da sottoporre alle analisi successive; il secondo campo rappresenta l’ultima data di
modifica di un determinato file; il terzo, il numero di byte di ogni file; e infine l’ultimo,
indicante la natura di ciò che si sta maneggiando (file, directory, o altri oggetti).
La selezione del file è effettuata tramite domande esplicite rivolte all’utente. Ciò è stato
possibile impiegando la specifica funzione input, la quale formula la domanda sottoforma
di stringa di testo al prompt di Matlab (figura 57) e aspetta l’inserimento del numero da
parte dell’utente relativo al file CSV da caricare in memoria. Questo numero è essenziale
per poter ricavare, dallo struct array precedentemente generato, il “filename” contenente
tutti i valori campionati in una singola fase di registrazione.
Dopo aver capito quale file dovrà essere utilizzato per il proseguo dell’analisi, è
necessario ora modificare leggermente il file che ci viene fornito dalla scheda
d’acquisizione. E’ infatti necessario che un file con estensione CSV, per essere caricato
nella memoria di Matlab attraverso il comando “csvread”, sia caratterizzato solamente da
dei valori numerici. I file datici in output dalla nostra scheda sono invece caratterizzati da
un certo numero di righe d’intestazione nelle quali sono dichiarati alcuni parametri di
105
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
settaggio utilizzati. Ciò che si è fatto, quindi, è di far cominciare la lettura del file
solamente dalla ventunesima riga in poi.
Nome del file da analizzare (filename)
Figura 57: Selezione da una lista del file da analizzare
In fine, è stato necessario attribuire una “identità” ai diversi canali di un file CSV. In tutti
gli esperimenti venivano attivati due canali per ciascuna vaschetta. Essendo il numero
delle vaschette variabile in base agli esperimenti, il numero di canali ottenuti variava tra
sei, nel primo caso, ad otto nel secondo caso.
Il primo canale rappresenta in qualsiasi file considerato il numero progressivo di
campionamenti; il secondo e il terzo canale rappresentano i segnali registrati da due
microelettrodi differenti, entrambi provenienti dalla prima vaschetta; il quarto ed il quinto
canale rappresentano i segnali registrati da altri due microelettrodi provenienti però dalla
seconda vaschetta; il sesto è il canale di stimolazione mediante il quale si causa
l’insorgenza di una risposta tra le cellule nervose; quindi gli ultimi due canali, il settimo e
l’ottavo, rappresentano, se presenti, i valori registrati da due microelettrodi della terza
vaschetta impiegata (solitamente quella di controllo). Tutto ciò è stato facilmente
106
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
implementato assegnando in maniera specifica a questi differenti canali delle variabili di
riferimento.
Procedura 2: >> Plot globale << (plot_globale.m):
D’ora in poi, principalmente per motivi
di convenienza, la descrizione di tutte le
procedure d’analisi che illustreremo di seguito saranno riferite ad un unico file scelto
arbitrariamente tra la lista presentata in figura 57. La scelta di quest’ultimo file può
essere fatta in maniera totalmente stocastica, in quanto, l’interpretazione dei risultati che
saranno generati di volta in volta nel corso della descrizione dell’algoritmo verrà indagata
in maniera approfondita in un secondo momento (capitolo 5). Potremmo perciò definire il
file “FASE_A_A4_05_magneteFisso”, a questo punto, come un file-pilota illustrativo. Le
sue principali caratteristiche sono: una fase di registrazione che dura 60 s, un numero di
campionamenti totali per canale di 60 x 104, e infine 6 canali, poiché vengono utilizzate
solo 2 vaschette di cellule.
Selezionando con il cursore la seconda voce del menu (figura 56) viene quindi lanciata la
procedura “plot_globale.m”.
L’obiettivo che si è voluto perseguire è stato quello di fornire una rappresentazione
complessiva della stimolazione e della risposta neurale per tutta la durata della fase di
registrazione, sia per la vaschetta A che per la vaschetta B. Una visualizzazione di questo
tipo permette di aver un colpo d’occhio completo ed efficace dell’andamento del segnale
registrato. Inoltre in questo modo è possibile determinare quale sia, fra i segnali registrati
da ogni singola vaschetta (tenendo presente che un segnale MEA per essere considerato
soddisfacente deve mediamente oscillare tra valori di 0,1 e 0,4 mV [Chi&Al01]) il
segnale migliore per poter svolgere le analisi successive. Con questa rappresentazione
grafica complessiva è possibile anche avere una visione totale di quale sia il pattern di
stimolazione impiegato per eccitare le cellule nervose adese sugli array planari di
microelettrodi.
I grafici ottenuti in figura 58 e 59 sono stati generati sfruttando la funzione “plot” che ha
permesso di rappresentare le coppie dei canali delle due vaschette in relazione al
trascorrere del tempo di stimolazione.
107
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Figura 58: Plot globale vaschetta A
Figura 59: Plot globale vaschetta B
108
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Procedura 3: >> Scelta canali << (canali.m):
Come rappresentato in figura 58 e 59 il numero di canali da cui il segnale neurale viene
registrato è doppio, ovvero, per ogni vaschetta impiegata, vengono utilizzati due
microelettrodi dei 64 presenti mediamente su un dispositivo MEA. Il numero di canali
totali di registrazione relativi al file pilota impiegato (FASE_A_A4_05_magneteFisso) è
quindi pari a quattro. Inizialmente la scelta di questi quattro canali è effettuata in seguito
ad analisi al microscopio. Le regioni caratterizzate da una alta densità di cellule nervose
in prossimità dei microelettrodi determinano quale elettrodo scegliere fra i 64 a
disposizione. Questa piccola “ridondanza”, se così la si vuol chiamare, nelle fasi di
registrazione, è voluta al fine di scegliere quale sia il canale migliore, cioè quello in grado
di fornire le maggiori garanzie per effettuare le successive analisi. Nel file “canali.m”,
sfruttando nuovamente due funzioni input, viene richiesto all’utente, in seguito alla
visualizzazione globale precedentemente osservata, di decidere quali siano i canali da
sfruttare (figura 60).
Figura 60: Scelta dei canali
Chiaramente la procedura “scelta canali” può essere anche bypassata dall’utente
allorquando non vi siano delle caratteristiche tali da far prediligere la scelta di un canale
rispetto ad un altro. In questo caso, il compilatore sfrutterà sempre il secondo canale della
vaschetta A e il primo della vaschetta B (canale 2 e 3 dei file CSV). Questa scelta è
definita di default ed è stata stabilita osservando la bontà media dei segnali registrati nelle
diverse fasi di registrazione, tuttavia questa opzione può essere chiaramente modificata.
Procedura 4: >> Divisione dei dati << (divisione.m):
Questa procedura permette di dividere in maniera automatica il segnale pilota in un
numero prefissato di sotto-intervalli. Consideriamo la FASE_A_A4_05_magneteFisso,
109
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
sfruttando il rapporto fra il numero totale di campionamenti registrati e un qualsiasi
valore di estensione precedentemente impostato, è possibile ricavare il numero di sottointervalli analizzabili. Essendo il file costituito da 60 x 104 campionamenti, avendo
impostato un valore d’ampiezza di 2 x 103, il numero di sotto-intervalli di questo segnale
è 300. In sostanza, invece di analizzare l’intero segnale di registrazione per un’estensione
di 60 s, si analizzeranno 300 piccoli intervalli di durata 0,2 s. La procedura scritta,
attraverso un ciclo iterativo for, permette d’effettuare un’efficiente archiviazione,
attraverso l’assegnamento di tutti i sotto-intervalli in un’unica variabile di carattere
matriciale. Le dimensioni di tale variabile, nel caso del segnale-pilota analizzato,
risultano essere 2000 x 300; e rappresentano la “porzione di segnale di volta in volta
analizzato” per il “numero di sotto-intervalli considerati”. Il comando for è quindi
essenziale consentendo la ripetizione di una certa serie di istruzione fino ad un valore
massimo predefinito che in questo caso, è ovviamente rappresentato dal numero di sottointervalli generati.
Procedura 5: >> Divisione specifica dei dati << (divisione_specifica.m):
Nel caso in cui l’utente voglia visualizzare, e successivamente analizzare, un determinato
file in prossimità di particolari regioni, poiché considerate più significative oppure più
importanti, è allora possibile sfruttare la quinta procedura del menu e compiere una
divisione specifica dei dati.
Da questo momento in poi sarà l’utente, interrogato dal programma, a dover inserire gli
estremi delle regioni di suo interesse nonché l’ampiezza dell’intervallo che dovrà essere
visualizzata.
Considerando la FASE_A_A4_05 è possibile procedere ad una specifica e particolare
suddivisione del file stesso. Ad esempio, poniamo di essere interessati ad analizzare un
lasso temporale di soli 20 secondi (anziché i 60 secondi totali della registrazione) e
poniamo di voler analizzare la regione compresa tra i 20 x 104 e i 40 x 104 campioni.
Volendo mantenere un’ampiezza di circa un secondo s’è impostato che il range di
campioni da considerare fosse 10 x 103 (figura 61). Specificando tutti questi dati sarà
possibile ottenere poi la suddivisione inizialmente voluta.
A un certo punto in questa procedura è stata impiegata anche un’istruzione condizionale
if…else per cercare di prevenire l’insorgenza di alcuni “fatal-error” che avrebbe causato
110
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
sicuramente l’arresto del DSP-system. Molto spesso, infatti, è facile invertire gli estremi
da considerare oppure commettere errori di battitura che non consentono al programma di
evidenziare alcuna regione d’interesse. In questi casi, viene visualizzato nel prompt di
Matlab un messaggio informativo di errore (figura 62). Ovviamente, in caso venga
intrapreso questo percorso, il DSP-system tornerà nuovamente a richiedere le stesse
informazioni preventivamente specificate: ovvero gli intervalli superiore ed inferiore. Se
questa volta i dati inseriti sono corretti (e cioè l’estremo inferiore è effettivamente minore
dell’estremo superiore) allora la procedura può continuare fino a creare anche in questo
caso una variabile matriciale che contenga tutti i dati relativi al sottocampionamento.
Figura 61: Divisione specifica dei dati
Figura 62: Errore nella fase di divisione specifica dei dati
Al termine sia della procedura 4 che della procedura 5, viene di seguito caricato
automaticamente un particolare file Matlab: “dsp.m”. Questo file consente di accedere
alla seconda fase del DSP-system, ovvero alla fase di “analisi del segnale”. Il passaggio
da una fase, quella di visualizzazione, all’altra, per l’appunto quella d’analisi, avviene in
111
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
maniera diretta allorquando tutti i parametri fin qui descritti, necessari per dare inizio allo
screening dei segnali, siano stati correttamente definiti.
- Analisi del segnale:
Il file Matlab “dsp.m” ha la medesima struttura del file “start.m”. Una volta che
questo viene caricato, il DSP-system visualizza un secondo menu, molto simile al
precedente, che è il punto cardine di questa seconda fase. Infatti, l’utente può selezionare
le differenti voci visualizzate del menu, così che dal file “dsp.m” si acceda alle differenti
directory nelle quali sono salvati i file che permettono l’esecuzione delle procedure
d’analisi prescelte, terminate le quali si ritornerà al file “dsp.m” per l’esecuzione di una
nuova procedura. Questo ciclo, creato usando l’istruzione iterativa while, viene terminato
esclusivamente selezionando il dodicesimo bottone di questo menu, ovvero il bottone di
uscita. Ciò consente di accedere nuovamente alla fase di scelta del file, in modo che lo
studio possa proseguire in maniera continuativa.
Analizziamo ora le procedure d’analisi (figura 63):
Figura 63: Menu d’interfaccia analisi del segnale
112
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Così come nell’implementazione del primo menu del DSP-system, anche in
questo caso, s’è impiegata l’istruzione di scelta multipla switch – case. Ora, i casi
possibili sono 12, di cui l’ultimo è solamente di uscita.
Procedura 1: >> Seleziona plot << (seleziona_plot.m):
Mediante la solita funzione input viene richiesto all’utente quale sia l’intervallo da
sottoporre alle successive analisi (figura 64).
Figura 64: Interfaccia selezione intervallo
Sovente può capitare che l’utente digiti un numero corrispondente ad un plot inesistente.
Ciò avviene quando si sfori il tetto massimo di plot disponibili indicato nel prompt di
Matlab, oppure, nel caso in cui si immetta un numero negativo. Pertanto, sfruttando
un’istruzione condizionale if…else, è possibile far ripetere la selezione nel caso in cui si
verifichi una situazione di cui sopra. Attraverso una serie di messaggi di avvertimento si
fa presente all’utente il fatto che debba ripetere quindi l’operazione di selezione (figura
65).
Figura 65: Messaggio d’errore nella selezione del sotto-intervallo
Se la scelta viene eseguita rispettando i limiti di selezione, allora il passo successivo è
quello di calcolare l’inizio e la fine del sotto-intervallo prescelto, risalendo poi
113
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
all’estensione temporale della porzione di segnale considerata. Fatto ciò, devono essere
estratti dalla “variabile matriciale”, definita in precedenza nella fase di “divisione dati” o
in quella di “divisione specifica dati”, anche i valori numerici del potenziale dell’attività
delle cellule nervose adese sulle due vaschette relative all’intervallo prescelto. In buona
sostanza, a questo punto, avremo a che fare con due vettori relativamente piccoli su cui
effettuare le analisi che verranno descritte successivamente. Rifacendosi come sempre al
file pilota (FASE_A_A4_05), ciò che è stato detto finora può essere così riassunto: dei
300 sotto-intervalli ricavati tutte le analisi condotte di seguito saranno effettuate
prendendo in considerazione, nel caso di una divisione standard aspecifica,
esclusivamente i 2000 valori del canale della vaschetta A e i 2000 valori relativi al canale
della vaschetta B. Chiaramente il valore di estensione d’analisi può essere aumentato o
diminuito mediante una divisione specifica dei segnali.
Inoltre, i valori di potenziale campionati verranno salvati anche in due appositi file di
testo mediante il comando fopen / fclose. Queste istruzioni consentendo di aprire un file
già esistente in una specifica cartella (C:\Programmi\R\Mat_txt\…) ma vuoto, copiare i
valori di potenziale registrati dal canale della vaschetta A e dalla vaschetta B, per poi
facilitare e velocizzare il calcolo della ARIMA cross-correlata tramite il linguaggio R.
Figura 66: Visualizzazione di un sotto-intervallo selezionato
114
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Al termine della selezione del sotto-intervallo, s’è proceduto ad una sua visualizzazione
(figura 66). Questo consente di avere fin da subito un riscontro visivo della correttezza
della scelta fatta; consentendo, se fosse necessario, anche di compiere degli
ingrandimenti in particolari regioni del plot.
D’ora in avanti per descrivere le successive fasi del DSP-system si farà riferimento
sempre al file pilota “FASE_A_A4_05_magneteFisso”, e in particolare si analizzerà il
sotto-intervallo 90, quindi la regione compresa tra 17,8 e 18 secondi.
Procedura 2: >>Informazioni statistiche << (statics.m):
Selezionando dal menu di figura 63 il tasto “informazioni statistiche”, vengono fornite
all’utente una serie di dati e informazioni di statistica descrittiva riguardanti sia il segnale
della vaschetta A che il segnale della vaschetta B (figura 67). Ciò è stato fatto per poter
conoscere i principali parametri descrittivi dei segnali sottoposti ad analisi, e per poter
quindi avvalorare anche attraverso indici numerici significativi il comportamento similare
o differente dell’attività delle cellule nervose localizzate sulle due piastre.
Figura 67: Box informativo caratteristiche generali dei segnali analizzati
115
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Tutte le informazioni visualizzate sono state ricavate tramite l’ausilio di semplici funzioni
statistiche reperibili in Matlab. Per entrambi i canali s’è calcolato il valore di massimo e
minimo assoluto, il valore di media, mediana, gli indici di varianza, covarianza ed infine
il valore di deviazione standard.
Per prima cosa è stata determinata l’estensione dei due segnali, ciò è facilmente
derivabile sfruttando la funzione length. I valore di massimo e minimo sono stati invece
desunti integrando i vettori numerici dell’attività nervosa delle due vaschette considerate,
rispettivamente nelle funzioni max e min. Queste funzioni danno quindi in output un solo
valore rappresentante il massimo e il minimo assoluto.
Rifacendoci ancora una volta al file FASE_A_A4_05, la funzione mean permette di
calcolare il valore medio fra i 2000 campioni caratterizzanti i segnali del sotto-intervallo
considerato. Per derivare il valore della mediana è stata invece impiegata la funzione
median relativamente ai vettori-segnali considerati.
Gli indici di varianza e covarianza vengono derivati dalle funzioni preimpostate Matlab
var e cov, le quali restituiscono un indice normalizzato rispetto alla lunghezza del segnale
fornito. Infine, il comando std ha consentito di calcolare velocemente il valore di
deviazione standard.
Procedura 3 >>Identifica spike<< (spikes.m):
L’algoritmo implementato è in grado di effettuare l’individuazione dei potenziali
d’azione, ovvero degli spike, sfruttando una particolare procedura denominata “peak
detection”. Solitamente, nei software che permettono l’analisi dei segnali raccolti tramite
MEA, esistono algoritmi che sfruttano finestre mobili in grado di spostarsi lungo tutto il
segnale registrato per individuare, porzione dopo porzione, dei picchi significativi (figura
68).
Figura 68: Peak detection
116
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Per poter stabilire se un picco di registrazione possa considerarsi significativo oppure no,
si sfrutta un valore soglia di minimo assoluto. In sostanza, quando il valore di potenziale
tra due picchi, ovvero tra un massimo ed un minimo consecutivo, risulti essere superiore
ad un valore soglia sperimentalmente stabilito di 0,120 mV [Chi&Al05], allora con un
buon margine di sicurezza è possibile affermare che in quell’istante sia stato registrato
uno spike.
Attraverso la procedura “spikes.m” s’è cercato di utilizzare un procedimento analogo a
quello descritto sopra. Considerando sempre i due soliti canali del sotto-intervallo 90
della FASE_A_A4_05, sono stati determinati per ambedue i canali tutti i punti di massimo
e di minimo mediante un ciclo for effettuato sull’intera ampiezza del sotto-intervallo
considerato. Successivamente s’è dovuto derivare il delta (∆V) fra i vari massimi e
minimi, quindi, verificata la veridicità del valore soglia di 0,120 mV descritto in
precedenza, è stato possibile procedere alla determinazione della locazione degli spike.
Per ragioni di praticità, i valori delle ascisse sono stati espressi in base al numero di
campionamenti effettuati, anziché in base allo scorrere del tempo. Poiché il sottointervallo 90 analizzato era caratterizzato da un’estensione temporale compresa tra i 17,8
e i 18 s, il numero di campionamenti totali indicato è quindi di 2000.
Figura 69: Spike del segnale vaschetta A tra 17,8 e 18 secondi
117
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Figura 70: Spike del segnale vaschetta B tra 17,8 e 18 secondi
Osservando le figura 69 e 70 si nota come tutti gli spike individuati abbiano un uguale
valore d’intensità. Ricordando tuttavia che i neuroni comunicano in base ad una
modulazione di frequenza e non in base a differenti valori d’intensità, questo modo di
rappresentare i differenti potenziali d’azione risulta essere coerente.
Procedura 4 >>Identifica burst<< (burst.m):
Un burst altro non è che una rapida sequenza di un elevato numero di spike (train-spike)
separati l’un l’altro da qualche millisecondo. L’intervallo di tempo tra un burst e il
successivo, definito IBI (InterBurst-interval), è piuttosto variabile. L’IBI è stato
caratterizzato sperimentalmente, mediante studi elettrofisiologici, essere di durata
variabile fra qualche decina di millisecondo fino a qualche secondo se non addirittura, in
certe condizioni, a qualche minuto.
Per poter studiare i burst, si è messo a punto una procedura per individuarli
automaticamente. Il presupposto su cui si basa l’algoritmo implementato, non è una
ricerca dei burst che si basa sull’analisi delle registrazioni MEA, bensì si utilizzano le
informazioni dei dati processati in precedenza mediante la procedura di “peak-detection”
(spikes.m). Il vantaggio di utilizzare i dati derivati dalla precedente procedura
118
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
d’individuazione degli spike, è che i dati sono “ridotti”, di minor complessità, perciò più
facilmente maneggiabili anche da un punto di vista computazionale.
Il file “burst.m”, eseguito dal DSP-system selezionando la quarta scelta dal secondo
menu (figura 63), procede quindi ad un’efficace individuazione di cluster di spike. Se due
spike consecutivi sono caratterizzati da una distanza reciproca inferiore ad un
determinato valore soglia (10 ms [Gra&Al01]), allora, questi spike costituiranno un unico
cluster. Viceversa se lo spike successivo risultasse essere localizzato ad una distanza
superiore di quella stabilità come soglia questo, e altri spike successivi, andrebbero a
costituire un altro burst. Considerando che un potenziale d’azione ha una durata di un
solo millisecondo, il valore soglia impostato può essere considerato ragionevole per
desumere l’esistenza di un burst o meno.
In figura 71e 72 sono riportate, rispettivamente per la vaschetta A e la vaschetta B del
sotto-intervallo 90, le visualizzazioni dei rispettivi burst. Questi grafici rappresentano i
cluster di spike e le loro ampiezze in livelli arbitrari di voltaggio, rappresentati dalla
somma delle ampiezza dei singoli spike appartenenti a un determinato cluster.
Figura 71: Rappresentazione burst vaschetta A tra 17,8 e 18 secondi
119
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Figura 72: Rappresentazione burst vaschetta B tra 17,8 e 18 secondi
Dalle rappresentazioni di figura 71 e 72 possono essere ricavate informazioni importanti
concernenti:
-
L’istante di comparsa di un’attività neurale di una certa importanza.
-
L’estensione e la durata di un burst.
-
L’IBI (InterBurst Interval), definito come il tempo trascorso tra la fine di un burst
e l’inizio di quello successivo.
-
L’ampiezza di un burst (in unità arbitrarie), e indirettamente un’indicazione sulla
qualità della modulazione in frequenza del fire potential.
Infine il file burst.m è stato implementato al fine di sintetizzare l’apparente attività
stocastica di “fire” di una cultura di cellule nervose in una visualizzazione concertata e
più significativa.
Procedura 5 >>Autocorrelazione<< (autocorrelazione.m):
L’autocorrelazione è una funzione che fornisce una misura di quanto un segnale
s’assomigli, si correli, abbia proprietà comuni con se stesso, ritardato di un periodo di
tempo t. Senza ritardo il segnale è per definizione sempre lo stesso.
120
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
L’autocorrelazione nei segnali casuali (aleatori) è molto importante, poiché ci fornisce
una stima della regolarità del processo rappresentato nel tempo. Infatti, ritardando un
segnale contenente numerose componenti di disturbo è possibile verificare se esistano
delle periodicità significative. Spesso è interessante determinare la funzione
dell'autocorrelazione di un segnale desiderato affetto da una componente di rumore non
voluta. La funzione d'autocorrelazione risultante fornisce il segnale voluto pulito dal
rumore [Shu&Sto05] (figura 73).
Analiticamente è possibile definire l’autocorrelazione (Rh) come il rapporto fra la
funzione di autocovarianza (Ch) e la funzione di varianza (C0):
Da notare che Rh può assumere tutti i valori compresi tra +1 e –1, Yt è invece il valore
della serie ad un certo periodo t.
La rappresentazione grafica di una funzione di autocorrelazione, chiamata correlogramma
(figura 74), ha lo scopo di determinare la correlazione del segnale considerando diversi
delay o time-lag. Se i valori di autocorrelazione si avvicinano a zero per la maggior parte
dei “time-lag” considerati, allora il segnale non è correlato e le variazioni del segnale
sono casuali; invece, se i valori di autocorrelazione sono lontani dallo zero, è possibile
affermare che i dati precedenti sono correlati coi dati successivi. Normalmente in un
correlogramma il numero di “time-lag” considerato è uguale a 20 (figura 74) , le linee
orizzontali rappresentano invece l’intervallo di confidenza ricavabile dalla seguente
formula
dove N è il numero dei campioni, z è il valore percentuale di una funzione normale di
distribuzione e α è il livello di significatività.
121
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Figura 73: Visualizzazione segnale e Autocorrelazione segnale vaschetta A
Figura 74: Correlogramma segnale vaschetta A
122
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Figura 75: Visualizzazione segnale e Autocorrelazione segnale vaschetta B
Figura 76: Correlogramma segnale vaschetta B
123
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Analizzando i grafici di figura 73, 74, 75 e 76 è possibile in definitiva ricavare numerose
informazioni riguardo alla:
-
Correlazione dei dati adiacenti o precedenti.
-
Presenza di “white noise” nella serie temporale analizzata.
-
Presenza di andamenti sinusoidali nel tempo.
-
Possibilità di considerare un modello lineare (Y = constante + errore) come
appropriato e sufficiente per la descrizione della serie temporale considerata.
-
Casualità dei dati.
Tutto ciò è stato implementato in Matlab sfruttando due funzioni analoghe, “ccorr” e
“autocorr”.
Per ottenere l’autocorrelazione considerando un time-lag superiore a quello sfruttato
normalmente nei classici correlogrammi è stata scritta una funzione apposita “ccorr”,
mediante la quale sono state ottenute le rappresentazioni grafiche di figura 73 e 75. Il
valore di lag impostato in questo caso è stato molto alto, ovvero pari alla metà
dell’ampiezza del solito sotto-intervallo 90. In questo modo, una volta specificata la serie
temporale stocastica da analizzare, dapprima il segnale della vaschetta A e in seguito
quello della vaschetta B, sono stati derivati tutti i coefficienti di correlazione per ottenere
i plot finali ad alto dettaglio e significatività. E’ da notare, infine, che se nella serie
temporale ci fossero dei valori NaN (non numerici) questi verrebbero automaticamente
convertiti in “0”, causando un aumento dell’errore dei coefficienti calcolati, ma evitando,
per contro, l’arresto della procedura. La funzione “autocorr” pre-definita in Matlab è stata
invece impiegata per ottenere i classici correlogrammi di figura 74 e 76. Questa funzione,
una volta specificato il vettore della serie temporale univariata (relativo cioè ad un’unica
variabile) del segnale della vaschetta A e poi della B, fornisce in output i valori di
autocorrelazione di interesse. Questi sono salvati in un vettore di lunghezza 21,
corrispondenti ai valori di “lag 0, 1, 2,…,20”. Ovviamente il primo elemento di questo
vettore sarà sempre uguale ad 1, poiché l’autocorrelazione del segnale con se stesso è per
definizione massima, e quindi uguale all’unità.
Procedura 6 >>Autocorrelazione parziale<< (pacf.m):
Solitamente è possibile osservare che l’autocorrelazione per ritardi (lag) superiori al
primo, risulta essere diversa da zero e assume spesso valori non banali. Sappiamo anche
124
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
che l’autocorrelazione, per bassi valori di lag, risulta essere un’analisi piuttosto spuria.
Infatti, la correlazione che si misura al ritardo 2 è legata intrinsecamente al fatto che Yt-1
sia generato a partire dal valore precedente, ovvero Yt-2; e allo stesso modo, Yt sia
generato a partire da Yt-1. Quindi, l’autocorrelazione ottenuta fra Yt e Yt-2, pur essendo
diversa da zero è, in buona parte, influenzata da Yt-1. Per aggirare questo problema è
possibile impiegare un altro tipo di correlazione: l’autocorrelazione parziale [Mit98].
La funzione di autocorrelazione parziale misurata considerando un ritardo k, altro non è
che l’autocorrelazione tra Yt e Yt-k, non considerando il primo lag.
L’autocorrelazione parziale è anche un utile strumento, come si vedrà in seguito, per
poter identificare l’ordine dei modelli autoregressivi (AR). Un modello autoregressivo
(AR(p) dove p è l’ordine di AR) è un insieme di formule statistico matematiche lineari che
consentono di predire un output Yt di un sistema, basandosi solamente su output
precedenti a questo. L’autocorrelazione parziale di un processo AR(p) assume valori nulli
per tutti i lag superiori a p+1. In sostanza possiamo affermare che, se il grafico
dell’autocorrelazione permette di affermare che un modello lineare (AR) sia appropriato,
allora il grafico dell’autocorrelazione parziale permette d’identificare l’ordine (p) di tale
modello. Il valore dell’ordine (p) coincide in questo caso col numero del lag dove il
grafico dell’autocorrelazione essenzialmente si annulla.
Figura 77: Autocorrelazione parziale segnale vaschetta A&B
125
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Per effettuare la computazione dell’autocorrelazione parziale in Matlab, una volta che
l’utente seleziona il sesto tasto del secondo menu del DSP-system, è stata impiegata la
funzione “parcorr”.
In input vengono forniti i segnali registrati dalla vaschetta A e, in seguito dalla vaschetta
B; rappresentanti serie temporali stocastiche univariate. La funzione “parcorr” calcola
questo tipo di correlazione sfruttando modelli autoregressivi successivi di ordine 1, 2, 3,
…, eliminando l’ultimo coefficiente d’ogni regressione. E’ anche possibile impostare un
valore di confidenza per la funzione “parcorr” che, nelle nostre analisi, è sempre stato
settato al 95 %. La tipologia di rappresentazione grafica ottenuta è quella di figura 77. In
questo caso, per rappresentare l’autocorrelazione parziale di entrambe le vaschette, s’è
impiegato un unico grafico in maniera tale da consentire un confronto immediato delle
analogie e delle differenze dei due segnali registrati dalle due vaschette.
Procedura 7 >>Cross-correlazione<< (cross_correlazione.m):
La cross-correlazione viene solitamente impiegata per comprendere quanto i valori di due
serie storiche X e Y siano fra esse correlate. Ciò significa tentare di capire se le due serie
siano rappresentative di una stessa fenomenologia.
Analiticamente la funzione di cross-correlazione calcolata in base ai ritardi d = 0, 1, 2,
…, N-1 (dove N è il numero di campioni totali), quello che si ottiene come risultato è in
definitiva una serie cross-correlata φxy(d) di lunghezza doppia rispetto alla lunghezza
della serie originale.
dove:
-
xi = i-esimo valore della serie X.
-
yi = i-esimo valore della serie Y.
-
µx = media della serie X.
-
µy = media della serie Y.
Viene definito coefficiente di cross-correlazione fra i valori delle due serie il parametro r,
il cui valore assoluto varia tra il valore di 0 (nessuna correlazione) e 1 (le due serie sono
totalmente rappresentative dello stesso fenomeno).
126
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Se il valore r di correlazione è positivo e prossimo ad 1 significa che, più il valore della
variabile considerata aumenta in un segnale, e più il valore dell’altra variabile tenderà ad
aumentare a sua volta. Se invece il valore di correlazione è negativo, ciò significa che
all’aumentare del valore della variabile del segnale A, il valore della variabile del segnale
B tenderà a diminuire [Shu&Sto05].
Per il calcolo della cross-correlazione nel DSP-system è stata messa a punto una
procedura (cross_correlazione.m) in grado di impiegare due differenti funzioni (xcorr e
crosscorr) per il computo dell’indice r.
Mediante xcorr si genera un grafico che permette, grazie all’alto numero di lag
considerati (2*N-1, ovvero 3998 lag sempre considerando il sotto-intervallo 90), di avere
una descrizione dettagliata della variazione dell’indice di cross-correlazione nel tempo
(figura 78). In queste impostazioni di calcolo è stato anche specificato che la correlazione
calcolata sia sempre normalizzata, in questo modo assicuriamo che le autocorrelazione al
lag zero siano sempre uguali ad uno. Infine è da notare che nel grafico il lag zero è
sempre posto al centro.
La classica rappresentazione impiegata per la visualizzazione della correlazione (figura
79) viene implementata sfruttando la funzione chiave “crosscorr” già presente nel toolbox
statistico di Matlab a differenza della funzione precedente. I valori contenuti nelle due
differenti serie devono esser caratterizzate dal fatto di contenere osservazioni che vanno
da una scala temporale più lontana ad una più vicina, quindi le ultime osservazioni
saranno quelle più recenti. Sfruttando questa funzione sono stati determinati anche i
valori dei limiti di confidenzialità, facendo l’assunzione che le serie in input fossero
completamente scorrelate l’un l’altra. Nella figura 79, per il fatto che si effettua una
correlazione su due segnali, il numero di lag considerati raddoppia passando dagli usuali
20 fino a 40 lag. A differenza della prima rappresentazione grafica, che ci fornisce una
dettagliata funzione di cross-correlazione, in questo caso è possibile invece indagare
l’esistenza di particolari trend della serie derivata.
127
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Figura 78: Cross-correlazione tra i segnali delle vaschette A&B impiegando funzione xcorr.
Figura 79: Cross-correlazione tra i segnali delle vaschette A&B impiegando funzione crosscor.
128
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Procedura 8 >>Trasformata di fourier<< (trasformata_finale.m):
Molto spesso risulta interessante indagare un segnale, non solo in base al dominio
temporale, ma anche in relazione al dominio delle frequenze. Analiticamente possiamo
definire la trasformata di Fourier nel seguente modo:
Posto che i segnali a nostra disposizione sono aleatori e non periodici, l’operatore che
consente di descriverli in base alle frequenze si chiama trasformata di Fourier X(f), mentre
x(t) è l’operatore simmetrico, definito antitrasformata, che consente il passaggio inverso:
dal dominio frequenziale a quello temporale. Essendo casuali i segnali temporali
registrati dalle due piastre MEA, anche le relative trasformate di Fourier saranno funzioni
casuali.
Chiariamo l’utilità del passaggio dal dominio del tempo a quello delle frequenze.
Analizziamo il segnale blu di figura 80: questo è caratterizzato dal fatto di essere casuale
e di essere caratterizzato principalmente da basse frequenze. Sempre in figura 80, il
segnale rosso è caratterizzato invece da frequenze più alte, circa 6000 Hz.
10-3 s
Hz
Figura 80: Visualizzazione di due segnali differenti rispetto al tempo e alla loro frequenza
Poniamo ora di effettuare una somma dei segnali sopra descritti (figura 81 in verde). I
due segnali ora non possono essere più distinti nel dominio del tempo, bensì restano ben
separati nel dominio delle frequenze. Quindi analizzando la trasformata di Fourier è
129
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
anche possibile comprendere quali siano le armoniche (onde sinusoidali) fondamentali
che compongono un segnale complesso.
10-3 s
Hz
Figura 81: Somma di due segnali differenti sia nel dominio del tempo che della frequenza
Quello che possiamo ricavare da un’analisi che sfrutti la trasformata di Fourier, è il
cosiddetto, spettro d’ampiezza della serie temporale [Mit98]. In altre parole, è possibile
risalire al valore di ampiezza di qualsiasi sinusoide di frequenza generica fk = k/T.
Una misura esatta dello spettro d’ampiezza di un segnale fisico è tuttavia impossibile in
quanto:
-
E’ impossibile maneggiare segnali di durata infinita.
-
La trasformata è per definizione una funzione continua e pertanto non è possibile
sperare di misurare tutti i punti.
Una soluzione a tale problema è quella di misurare solo una parte del segnale di durata T,
considerare questa porzione come singolo periodo di una funzione, e calcolarne poi la
serie di Fourier. In questo modo è possibile trovare i coefficienti di ampiezza Ak
corrispondenti alle frequenze fk = k/T. La distanza tra due frequenze successive è 1/T,
per cui la risoluzione che si ottiene è dell’ordine di 1/T e ovviamente migliora
all’aumentare di T.
In sostanza, quello che si effettua è quindi il calcolo della trasformata discreta di Fourier.
In questo caso, le “formule” precedentemente descritte si trasformano: innanzitutto, gli
integrali vengono sostituiti da sommatorie. In secondo luogo, per i motivi che
spiegheremo di seguito, la serie non risulta più formata da infiniti elementi, ma solamente
da N/2 elementi, dove N è il numero di osservazioni che costituiscono la serie temporale
considerata. Quindi, le frequenze alle quali viene misurato lo spettro, sono frequenze di
1/T, 2/T, 3/T, …N/2T ovvero ½ ∆T = fs/2, e la frequenza massima contenuta nella serie
130
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
discreta di Fourier risulta essere quindi uguale a metà della frequenza di campionamento.
Supponiamo di voler ora campionare una sinusoide di frequenza generica f0.
Intuitivamente,
per
riuscire
ad
ottenere
un
campionamento
che
rappresenti
realisticamente il segnale dobbiamo essere in grado di misurare almeno due volte
l’ampiezza all’interno di un periodo, in modo tale da riuscire ad evidenziare come il
segnale oscilli e cambi di segno. Perciò la frequenza di campionamento minima per
riuscire a ricostruire il segnale è pari al doppio della frequenza generica f0. In altre parole,
se il segnale viene campionato ad una frequenza fs, allora sarà possibile campionare
correttamente solo i segnali di frequenza inferiore a fs/2 (Teorema di Shannon-Nyquist).
Questa particolare frequenza è detta frequenza di Nyquist.
Per contro, se campionassimo un segnale di frequenza generica f0 ad una frequenza
troppo bassa, l’errore che si commetterebbe sarebbe quello di considerare una sinusoide
di frequenza più bassa di quella caratterizzante il segnale originale. Il fenomeno per cui le
frequenze maggiori della frequenza di Nyquist vengono riconosciute come frequenze
inferiori è detto aliasing [Mit98] (figura 82).
Figura 82: Fenomeno di aliasing
Per esempio, le frequenze di 5 Hz e 20 Hz appariranno assolutamente uguali se
campionate alla frequenza di 25 Hz; per contro risulteranno differenti solo se campionate
a frequenze uguali o superiori a 40 Hz.
Riassumendo possiamo affermare che il campionamento con intervallo ∆T = 1/fs fa sì che
la massima frequenza misurabile sia la frequenza di Nyquist, ovvero fN =fs/2. Le
131
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
frequenze superiori vengono confuse e mescolate con quelle inferiori, provocando degli
errori nella misura dello spettro. Per avere una buona misura bisogna quindi utilizzare T
ed fs più grandi possibili.
In Matlab la computazione della trasformata discreta di Fourier, è stata calcolata
impiegando la funzione fft (fast fourier transform). La FFT sfrutta un famoso algoritmo
che richiede N2 moltiplicazioni ed altrettante addizioni e che è in grado di ridurre
notevolmente il tempo di calcolo solitamente impiegato per il calcolo della trasformata.
Le prestazioni migliori s’ottengono per N uguale ad una potenza di 2, e in tal caso, il
numero di operazioni necessario ad effettuare il calcolo dipende da N, ed è
approssimativamente pari a N*logN.
Scegliendo dal secondo menu del DSP-system l’ottava opzione, automaticamente viene
lanciato il file “trasformata_finale.m”, poiché nel corso degli esperimenti effettuati il
valore della frequenza è stato sovente modificato, s’è preferito procedere direttamente
all’interrogazione dell’utente per poter definire il valore della frequenza di
campionamento dalla quale derivare poi la frequenza di Nyquist (figura 83).
Figura 83: Interfaccia richiesta frequenza di campionamento
Un esempio dell’output generato da questa procedura è riportato nelle figure 84 e 85.
Come è visibile, le frequenze analizzate variano tra un valore minimo di 0 fino ad un
valore massimo di 5.000 Hz in accordo con il teorema di Nyquist e il fatto che nella
FASE_A_A4_05 la frequenza fs è pari a 10 kHz. Concludendo, quando si effettuano delle
analisi nel dominio delle frequenze, è necessario scegliere sempre una frequenza
d’acquisizione almeno il doppio della frequenza più alta che ci interessa. Nel caso di
analisi di segnali neurali provenienti da MEA possiamo non considerare le frequenze
inferiori a 500 Hz, poiché non significative, e considerare invece, in base anche a quanto
fatto da altri gruppi di ricerca, le frequenze comprese tra 500 e 5.000 Hz poiché
significative in misurazioni eseguite con MEA. Infine, sarebbe sempre opportuno filtrare
anche le frequenze superiori alla fn per evitare effetti di disturbo di aliasing.
132
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Figura 84: FFT calcolata sul segnale derivato dalla vaschetta A
Figura 85: FFT calcolata sul segnale derivato dalla vaschetta B
133
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Procedura 9 >>Periodogramma<< (periodograma.m):
Il periodogramma è uno strumento frequentemente usato nell’analisi delle serie temporali
univariate. Questo metodo non-parametrico consente di determinare il PSD (power
spectral density) derivandolo direttamente dal segnale.
Il periodogramma può essere espresso calcolando lo spettro di potenza, ovvero il valore
dell’ampiezza della trasformata di Fourier al quadrato, semplicemente determinando il
valore della trasformata discreta di fourier mediante FFT per tutti i campioni del
fenomeno studiato. Analiticamente lo possiamo esprimere come:
dove:
Il periodogramma (PT) misura quindi l’intensità della frequenza k-esima all’interno della
serie di valori, e quindi, l’importanza che assume ogni periodo Pk della serie
[Shu&Sto05]. Il periodogramma consente inoltre di condurre un’analisi della varianza in
relazione alle diverse frequenze k; consentendo perciò di rispondere alla domanda:
“quanta varianza della serie può venire spiegata da una specifica sinusoide di frequenza
k?”.
Una volta che l’utente avvia la procedura del periodogramma, Matlab attraverso la
funzione “periodogram” determina il valore del PSD. Il dettaglio con cui viene calcolato
il periodogramma dipende dal numero di campioni su cui è stata determinata la FFT,
solitamente il numero minimo di default è impostato a 256 e comunque deve sempre
essere un multiplo di 2. La funzione periodograma esprime il valore di PSD in relazione
alla frequenza fisica (Hz) e, il PSD è espresso in decibel (dB) per unità di frequenza.
Analizzare un segnale fisico reale, l’intervallo di frequenze considerato varia tra 0 e fs/2.
Chiaramente, per effettuare un confronto diretto tra i due segnali delle due vaschette
analizzate, le funzioni “periodogramma” sono rappresentate in un unico plot (figura 86).
134
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Figura 86: Periodogramma segnali vaschetta A e B
Procedura 10 >>Coerenza<< (coerenza.m):
La coerenza è una funzione che permette di esprimere il grado di correlazione lineare tra
due segnali in funzione della frequenza. Ovvero, permette di stabilire quanto bene il
segnale di una serie temporale X corrisponda, ad ogni frequenza, al segnale di una
seconda serie storica Y. Analiticamente la funzione di coerenza k può essere espressa nel
seguente modo [Shu&Sto05]:
dove:
-
Gxx = spettro di intensità (Ak2X) della serie temporale X(t) derivato tramite FFT.
-
Gyy = spettro di intensità (Ak2Y) della serie temporale Y(t) derivato tramite FFT.
-
Gxy = spettro di intensità incrociato (Ak2X * Ak2Y) delle serie Gxx e Gyy.
Per effettuare un corretto calcolo della coerenza è essenziale che le due serie abbiano
uguale lunghezza.
135
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
In Matlab, la funzione di coerenza (figura 87) è stata calcolata sfruttando la funzione
preimpostata “cohere”. In questo modo è possibile determinare l’intensità della coerenza,
la quale può assumere valori compresi fra 0 e 1, indicanti completa assenza di coerenza
nel primo caso e massima coerenza nel secondo caso. La funzione di coerenza sfrutta il
metodo di Welch per il calcolo dello spettro di intensità di potenza. Il metodo di Welch
può essere così descritto: i segnali X e Y vengono suddivisi in diverse sezioni
sovrapponibili e, per ogni sezione, viene calcolata la Fast Fourier Transform.
Successivamente è calcolata la media al quadrato dello spettro della sezione della serie X
e della serie Y, successivamente, vengono calcolate le medie dei prodotti degli spettri
della serie X e Y. Infine, impiegando l’equazione descritta sopra, viene derivato l’indice
di coerenza k per valori di frequenza compresi tra 0 e ½ fs.
Figura 87: Coerenza fra i segnali della vaschetta A e B
Procedura 11 >>ARIMA (p=12 d=1 q=12)<< (arima.m):
Selezionando l’undicesima opzione del secondo menu del DSP-system è possibile
analizzare le serie temporali attraverso il cosiddetto approccio “moderno”. Mediante il
modello ARIMA si cerca di risalire dal dato di una serie temporale Xt, al processo
136
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
generatore che lo ha determinato. La tecnica ARIMA può essere dunque utilizzata per
approfondire la comprensione del fenomeno stocastico non stazionario (fenomeno
caratterizzato da una distribuzione di probabilità dipendente dal tempo e quindi da una
struttura dinamica anch’essa variante nel tempo) che ne sta alla base. Inoltre, l’ARIMA è
una tecnica che può essere anche utilizzata per effettuare previsioni, una volta stabilita la
veridicità del modello utilizzato, grazie all’accuratezza e soprattutto grazie ai fondamenti
matematici in grado di supportarla e definirla [[Shu&Sto05]].
ARIMA è l’acronimo di “modello autoregressivo integrato a media mobile”. Cerchiamo
di comprendere meglio questa sigla. La definizione di modello autoregressivo (MA) è già
stata fornita in precedenza, in buona sostanza un modello autoregressivo è un sistema che
dipende esclusivamente dagli output precedenti. Un modello che dipende invece
esclusivamente dagli input è definito modello a media mobile (MA). Chiaramente un
modello basato sia sugli input che sugli output è definito ARMA e, così come i modelli
AR e MA, esso è in gradi di effettuare un’interpretazione esclusivamente dei modelli
stazionari. Il modello ARIMA invece, effettuando uno o più ordini di integrazione (I), è
in grado di trattare sistemi non stazionari rendendoli, tramite queste operazioni
d’integrazione, stazionari. Un qualsiasi modello ARIMA è caratterizzato da tre ordini p, d
e q. Questi rappresentano rispettivamente l’ordine dell’autoregressione, dell’integrazione
e infine della media mobile. Solitamente p e q vengono facilmente derivati osservando le
funzioni di autocorrelazione e di autocorrelazione parziale. Mentre il componente di
integrazione d assume generalmente valori variabili di 0, 1 o 2. Solitamente s’utilizza lo 0
se i valori sono stazionari fin dall’inizio, 1 se c’è un trend lineare oppure 2 se c’è un trend
quadratico.
Studi precedenti, volti a identificare i valori degli indici p d q, hanno portato a stabilire
che gli ordini ottimali per la costruzione di un modello ARIMA utile a rappresentare le
serie storiche osservate, fossero solitamente gli indici 12, 1, 12.
In Matlab, per determinare quanto fosse appropriato il modello impiegato, sono stati
sfruttati il metodo del “run sequenze plot” per entrambe le serie storiche dei segnali della
vaschetta A e B, e il metodo delle autocorrelazioni dei residui del modello
(p=12,d=1,q=12) nuovamente per entrambe le serie considerate (figura 88). Nel “run
sequenze plot” i residui non violano le assunzioni di locazione e di scala costante,
137
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
essendo tutti compresi nel range compreso tra –1 e +1.Questo avvalora la bontà del
modello utilizzato. Anche nel test di verifica riguardante l’autocorrelazione è visibile
come per quasi tutti i lag considerati i residui cadano nel range del 95 % di confidenza.
Ciò dimostra che i residui appaiano essere casuali. Un buon modello ARIMA dovrebbe
riuscire a prevedere i residui secondo una distribuzione casuale (random) e quindi
secondo una normale.
Figura 88: Validazione modello ARIMA (12, 1, 12)
138
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
In figura 88 sono stati riportati solamente i due modelli p, d, q migliori (ovvero p=12,
d=1, q=12) relativi ai dati dei segnali della vaschetta A e B; tuttavia, è comprensibile
come attraverso questa procedura, sia possibile solamente stabilire il modello ARIMA
più rappresentativo del processo stocastico non stazionario delle serie temporali registrate
dai singoli canali delle vaschette A e B.
Invece, sarebbe di maggiore interesse cercare di derivare un modello ARIMA (p, d, q) in
grado di interpretare e spiegare a fondo i meccanismi di generazione delle risposte neurali
considerando le due vaschette contemporaneamente. Per fare questo è stato necessario
calcolare un modello ARIMA cross-correlato tra i segnali provenienti dai due differenti
dispositivi MEA di registrazione. Tuttavia, per far questo, è stato necessario lasciare
l’ambiente Matlab e passare ad R.
- Determinazione e validazione modello ARIMA cross-correlato:
Quest’ultima fase del DSP-system è stata implementata sfruttando un altro
linguaggio di programmazione ad alto livello: “R” (figura 89).
Figura 89: Prompt dei comandi R
I modelli ARIMA derivati in ambiente Matlab, erano tutti piuttosto semplici.
Infatti, mediante l’integrazione essi potevano essere considerati dei modelli stazionari.
139
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Molto spesso però, è interessante derivare modelli ARIMA non stazionari, molto più
complessi. Ciò può esser fatto in R aggiungendo delle variabili di regressione aggiuntive,
specificandole mediante la funzione “xreg”. Nel nostro caso la “variabile” xreg è uno dei
due segnali di registrazione derivati dai MEA.
In questo modo è possibile riuscire a stabilire un modello ARIMA a tutti gli effetti
cross-correlato fra i segnali raccolti dalle due differenti vaschette di neuroni.
L’operazione di diagnosi del modello ARIMA (p, d , q, xreg) proposto sfrutta
delle iterazioni numeriche ricorsive con l’obiettivo di approssimare di volta in volta in
maniera sempre migliore il valore d’accettazione, in modo tale di sfondare la soglia del
95 %. Questo metodo viene solitamente definito “maximum likelihood”.
Normalmente è possibile effettuare un “fitting” di un modello ARIMA (p, d, q),
relativamente ad un’unica serie storica Xt, ponendo che:
Xt = a + ARIMA (p, d, q)
La costante a è inclusa di default, ma è solitamente posta a zero se il parametro d è
maggiore di 0.
Invece se vogliamo che la serie Xt contenga un termine lineare del tipo (a + bt) in
modo tale che Xt – Xt-1 contenga il termine costante b in funzione del tempo; allora siamo
costretti ad utilizzare l’argomento xreg. Ciò consente in pratica di effettuare la
regressione di X su una o più covariate utilizzando i valori del vettore xreg proprio come
valori di covariata. Quindi è possibile validare i seguenti modelli [Iac&Mas03]:
Xt – Xt-1 = b + ARIMA (p, d=0, q)
Per far ciò, in R è stata implementata una procedura memorizzata nel file
“ArimaR (GRAPH).txt” [Ric04]. Questo file contiene istruzioni che consentono di
risalire ai valori di potenziale delle due vaschette neurali di nostro interesse (le nostre
serie storiche). Tutto ciò permette un calcolo efficiente dell’ARIMA poiché, nella
procedura numero 1 della seconda fase del DSP-system (seleziona_plot.m), si erano
salvati automaticamente tutti i valori dell’intervallo considerato nei file CNA3.txt e
CNB3.txt che, a questo punto, vengono ricaricati in ambiente R per poter effettuare
questa analisi.
140
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
Successivamente mediante la funzione “arima” viene effettuato il calcolo dei
coefficienti MA e AR, nonché dell’indice di xreg di nostro interesse (tabella 3). Affinché
il modello ARIMA pre-impostato (con coefficienti 4, 1, 5) possa essere considerato un
buon modello descrittivo del fenomeno cross-correlato analizzato, il parametro xreg deve
avvicinarsi il più possibile al valore nullo. Gli indici Sigma2, Log likelhood, e AIC
(Akaike Information Criterion) forniscono anch’essi una stima della bontà del modello, e
in particolare, permettono di individuare fra due o più modelli quello che meglio si adatti
a spiegare ed interpretare i dati.
In R, la validità di un modello ARIMA (p ,d ,q ,xreg) utilizzato viene valutata con
specifici test mediante la funzione “tsdiag (time sequenze diagnostic)” [Ric04] (figura
90).
Tabella 3: Coefficienti ed indici modello ARIMA (4, 1, 5) cross-correlata
Figura 90: Test di verifica per diagnosticare bontà di un modello ARIMA
141
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
I primi due test riportati in figura 90 sono i medesimi di quelli utilizzati nella verifica dei
modelli ARIMA (p, d, q) considerati in Matlab. Il terzo, invece è la versione di LjungBox del test di Portmanteau. Se la maggioranza, oppure la totalità dei p-value calcolati,
sono al di là del bound di confidenza sottoriportato, allora possiamo affermare con buona
certezza che il modello utilizzato spieghi il fenomeno analizzato in maniera
soddisfacente, esaustiva e piuttosto completa [Iac&Mas03].
4.3 Considerazioni finali
Il DSP-system creato è un tool che permette d’effettuare analisi mirate circa
l’esistenza di possibili fenomeni di natura non classica che si manifestano tra neuroni
derivati da cellule staminali neurali, sfruttando analisi lineari e non-lineari.
Data la complessità e l’ingente mole dei dati contenuta in ogni file le prestazioni
raggiunte in fase di visualizzazione, analisi, e rielaborazione potrebbero esser migliorate
di un fattore d’ordine 10 o superiore passando ad una compilazione dell’algoritmo DSPsystem in un linguaggio compilato come C oppure C++.
Infine in futuro si potrebbe cercare di interfacciare il linguaggio R con Matlab,
sfruttando l’interprete MEX, passando però dal sistema operativo Windows a Linux, in
modo tale che tutte le analisi possano essere efficientemente eseguite sfruttando le
maggiori funzionalità statistiche di R anche in ambiente Matlab.
142
4. Analisi segnali registrati in Matlab / R
4.4 Architettura dell’algoritmo DSP-system mediante schema a blocchi
1Fase visualizzazione (Matlab)
asd1-1Start
Cartella
segnali
CSV
Carica-file
Plot globale
Scelta
canali
Divisione
dati
Divisione
specifica
Uscita
2- Fase di analisi (Matlab)
Info. statistiche
Uscita
Trasformata
Fourier
Id. Spike
Id. Burst
Periodogramma
Seleziona Plot
Autocorrelazione
Coerenza
Autocorrelazione
parziale
Salvataggio sotto-intervallo
in 2 file (CNA3 e CNB3.txt)
ARIMA
(p, d, q)
Cross-correlazione
3- Validazione ARIMA cross-correlata (R)
Start
[Source(ArimaR (GRAPH).txt)]
ARIMA Cross-correlata
(p, d, q, xreg)
Figura 91: Schema a blocchi del DSP-system
143
5. Risultati ottenuti
5. Risultati ottenuti
144
5. Risultati ottenuti
5.1 Premessa
In questo capitolo verrà presentata una rassegna dei risultati ottenuti negli
esperimenti IX e X. Si cercherà di descrivere quale sia l’entità della risposta generata
dalle cellule nervose derivate da NSC adese su MEA in seguito a stimolazioni laser (λ=
633 nm / 2mW).
Per prima cosa, sarà visualizzata la spontanea ed intrinseca attività cellulare
precedente a qualsiasi stimolazione, essenziale per comprendere la tipologia dei segnali
che si stanno analizzando.
In seguito, verranno descritte tutte le fasi eseguite nel protocollo X e alcune fasi
dell’esperimento IX, al fine di riuscire ad estrapolare considerazioni relativamente alla
capacità delle cellule neurali di reagire attivamente agli stimoli fotonici. In aggiunta,
verranno visualizzati i risultati delle analisi statistiche implementate con il DSP-system.
Queste analisi indagheranno il comportamento sia di segnali neurali registrati da canali
appartenenti a differenti vaschette con adesi neuroni (esperimento IX); sia di segnali
neurali derivati da differenti canali di una medesima piastra MEA (esperimento X).
Questo potrebbe risultare d’interesse per una maggiore comprensione dei meccanismi alla
base del “binding sensoriale”.
Infine, verrà evidenziata l’inefficacia della stimolazione mediante LED (λ= 466
nm), nel determinare e nel far scaturire risposte neurali organizzate in seguito alla
stimolazione stessa (esperimento IX).
Chiaramente bisogna sottolineare anche il fatto che tutte le fasi di registrazione
vengano compiute in completa assenza di luce in modo tale che le risposte registrate
insorgano esclusivamente in seguito a nostre stimolazioni e non a causa di fonti esterne
incontrollate.
5.2 Problemi incontrati in fase di registrazione
Il problema più grosso incontrato durante questa fase è intrinseco alla delicatezza
del contatto fra i microelettrodi MEA e i processi neurali interagenti con essi. A volte,
durante le operazioni di schermatura delle differenti piastre, potrebbero infatti verificarsi
delle piccole e involontarie “micro-perturbazioni” dello schema di attachment neurale a
145
5. Risultati ottenuti
seguito di movimenti delle piastre stesse. Questo, in alcuni casi potrebbe determinare o
un distaccamento o, addirittura, un miglioramento delle interazioni neurone – chip,
influenzando parzialmente quindi la fase di registrazione stessa.
5.3 Registrazioni a vuoto esperimenti IX e X
In questo paragrafo sono visualizzati i tracciati a vuoto registrati dalle piastre
impiegate negli esperimenti IX e X.
Nell’esperimento IX il sistema di studio è caratterizzato da due piastre MEA sulle quali si
sono coltivate cellule neurali umane; una delle due piastre è libera, schermata solamente
dalla gabbia di Faraday in ottone, l’altra invece è schermata anche dalla seconda gabbia
di Faraday la quale funge anche da schermatura ottica.
Nell’esperimento X le piastre utilizzate sono invece tre, caratterizzate rispettivamente
dalla presenza di cellule nervose derivate da NSC fetali umane, di Matrigel, e infine del
liquido di coltura.
Le registrazioni a vuoto sono essenziali per osservare e meglio comprendere
l’attività spontanea registrata dalle cellule sui microelettrodi impiegati. Per ragioni di
chiarezza e semplicità espositiva verrà considerato solamente un sotto-intervallo di tempo
arbitrario di due secondi (3,5 - 5,5 s per quanto riguarda l’esperimento IX, 16 - 18 s per
l’esperimento X) rispetto all’estensione totale dei file.
Analizziamo dapprima le fasi di registrazione a vuoto dell’esperimento IX.
In figura 92, notiamo l’attività di scarica dei neuroni a riposo della piastra non soggetta a
schermature. Ponendo attenzione al box statistico descrittivo dei segnali di questa piastra,
è possibile affermare che: i due canali di registrazione di questa piastra presentano
caratteristiche piuttosto simili tra loro, le quali non determinano un’esclusione
aprioristica di un canale in favore dell’altro. Infatti, entrambi sono caratterizzati da una
corposa oscillazione del segnale dovuta all’alto rumore di fondo. Inoltre, ponendo
attenzione ai valori delle medie dei segnali sarebbe preferibile condurre le successive
analisi basandosi sulla selezione del secondo canale di questa piastra, in quanto
caratterizzato da un valore medio più consono agli standard di registrazione MEA. Per
contro, osservando il valore di deviazione standard notiamo che il valore del secondo
146
5. Risultati ottenuti
canale risulta essere maggiore rispetto a quello del primo canale. In sostanza, quindi,
possiamo affermare che la scelta possa essere fatta arbitrariamente in favore dell’uno o
dell’altro canale di registrazione senza che i risultati delle successive analisi ne risentano
in maniera particolare.
Figura 92: Registrazione a vuoto da canali piastra neuroni non schermata esperimento IX
Un discorso differente può essere fatto invece osservando l’attività di
registrazione dei canali della piastra schermata (figura 93). Anche da un punto di vista
visivo, nonostante vi siano sempre ampie oscillazioni del segnale, è possibile affermare
che il primo canale consente una registrazione sostanzialmente migliore. Nel complesso
tutti i parametri, a partire dalla media (0,1956 Vs –0,3097) passando per la mediana
(0,1880 Vs -0,3247) arrivando alla diviazione standard (0,00961 Vs 0,1948), individuano
nel primo canale il segnale migliore.
Figura 93: Registrazione a vuoto da canali piastra neuroni schermata esperimento IX
147
5. Risultati ottenuti
Cerchiamo ora di trarre delle analoghe considerazioni sull’attività di registrazione
relativamente per i canali delle piastre dell’esperimento X. In figura 94 è possibile avere
immediatamente un colpo d’occhio dell’attività dei neuroni adesi al microelettrodo di
registrazione della prima piastra impiegata, quella con adesi i neuroni. Dal box
informativo posto a fianco possiamo notare come il valore medio del segnale registrato
risulti essere, per entrambi i canali, in accordo con i tipici valori di registrazione degli
array planari MEA. Si osserva tuttavia che, confrontando soprattutto i valori di
deviazione standard, il rumore in fase di registrazione sia anche in questi casi
relativamente alto. Ciò risulta essere palese anche da un punto di vista visivo, infatti
entrambi i segnali sono ancora una volta caratterizzati da oscillazioni piuttosto ampie.
Figura 94: Registrazione a vuoto da canali piastra neuroni esperimento X
Lo stesso discorso è estendibile anche per le altre due piastre (matrigel e liquido di
coltura figura 95 – 96) in cui, il segnale registrato, risulta essere sempre affetto da alto
rumore. In aggiunta, uno dei canali di registrazione della seconda piastra MEA (matrigel)
presenta un probabile malfunzionamento in quanto il suo valore medio s’attesta sempre
attorno a valori medi negativi (-0,6918 mV).
Anche la piastra col solo liquido di coltura (figura 96) presenta il tipico
andamento e le caratteristiche dei segnali osservati sopra. Anche in questo caso è
possibile affermare che tra i due canali il migliore, quello con un andamento
maggiormente stazionario è il primo, caratterizzato da un valore di deviazione standard di
148
5. Risultati ottenuti
soli 0,0966 mV rispetto al secondo canale caratterizzato invece da un valore
considerevolmente più alto.
Figura 95: Registrazione a vuoto da canali piastra matrigel esperimento X
Figura 96: Registrazione a vuoto da canali piastra liquido coltura esperimento X
Infine, nonostante la presenza del rumore sia sempre piuttosto intensa, a causa
della forte impedenza sugli elettrodi dovuta all’ossidazione provocata dal liquido di
coltura, un occhio allenato all’analisi dei segnali di registrazione MEA può facilmente
notare l’assenza di qualsiasi forma e di qualsiasi evento di “spiking”. Infine, le
fluttuazioni del segnale registrato sono quindi intrinseche alla fase di registrazione a
causa di un rumore di fondo responsabile di un aumento considerevole della variabilità.
Pertanto nel corso delle nostre analisi, queste oscillazioni non devono essere
erroneamente considerate ipotetici spike neurali.
149
5. Risultati ottenuti
Da quanto qui visualizzato potremmo affermare quindi che la fase di registrazione
a vuoto dell’esperimento X, rispetto a quella dell’esperimento IX, è leggermente
migliore. Questa è un’implicita testimonianza del fatto che le condizioni sperimentali in
cui si è svolto l’esperimento X fossero oggettivamente migliori rispetto alle precedenti;
ciò può essere causato da una moltitudine di fattori e, sicuramente, il più importante
potrebbe essere il fatto di aver avuto a disposizione una migliore topologia di rete
biologica coltivata sulle piastre di microelettrodi.
5.4 Stimolazione piastra neuroni, seconda piastra neuroni schermata otticamente
Questa fase, propria dell’esperimento IX, è caratterizzata dalla presenza di due
sole piastre entrambe caratterizzate da neuroni maturi. La prima delle due vaschette è
sottoposta a stimolazione laser, la seconda invece viene posta sotto schermatura
impiegando la seconda gabbia di Faraday (la quale funge anche da schermo ottico). Il
sistema considerato è posto all’interno della prima gabbia di Faraday in ottone.
In figura 97 è possibile osservare, considerando la fase totale di registrazione (40
s), la presenza di alcuni potenziali d’azione (i più vistosi indicati mediante frecce).
Interessante è sottolineare il fatto che, nonostante la piastra stimolata fosse quella dei
neuroni esterna, vengono registrate intense attività di spike anche nella piastra MEA
schermata. Ogni attività di spike non sembra essere casuale poiché risulta essere sempre
coincidente con le stimolazioni laser.
Alla luce di questo anomalo comportamento si è dunque voluto indagare quale
fossero i meccanismi e le peculiarità dei segnali neurali generati da emissioni fotoniche di
luce laser a distanza, cercando di dare anche maggiore fondamento all’ipotesi di un
“binding sensoriale” a livello quantistico. Quindi, considerando solamente una piccola
regione che contenesse risposte neurali significative da entrambi i canali della piastra
MEA neurale, si sono svolte una serie di analisi statistiche su questi segnali. L’utilizzo di
strumenti statistici è assai utile nelle analisi neurofisiologiche in quanto, essendo questi
segnali sempre molto “caotici”, è possibile fare delle ipotesi sulla casualità o meno di un
segnale, per delineare probabili e possibili meccanismi descrittivi.
150
5. Risultati ottenuti
Il sotto-intervallo considerato è stato quello compreso tra 14,10 e 14,20 s. La
scelta di questa porzione è chiaramente comprensibile osservando, ancora una volta, il
grafico di figura 97 nel quale sono facilmente visibili, nonostante la presenza dell’alto
rumore di fondo, una serie di potenziali d’azione i quali costituiscono un vero e proprio
train spike molto pronunciato in seguito della stimolazione laser.
Figura 97: Stimolazione piastra neuroni esperimento IX
Per individuare meglio gli spike che visivamente risultano già evidenti ma che, in
parte, potrebbero essere “celati o acuiti” dal rumore di fondo, si esegue la procedura di
identificazione degli spike. Per quanto riguarda il segnale registrato da uno dei due canali
della piastra di neuroni stimolata dal laser (canale I piastra esterna non schermata) sono
stati individuati,nell’intervallo compreso tra 14,10 s e 14,20 s, ben nove differenti eventi
di spike (figura 98 in alto). Le rispettive localizzazioni sulla scala temporale risultano
essere le seguenti: 14.1185 s, 14.1220 s, 14.1250 s, 14.1280 s, 14.1290 s, 14.1310 s,
14.1840 s, 14.1870 s, 14.1900 s. Per il segnale registrato dalla piastra schermata invece
(canale I piastra otticamente schermata), vengono individuati solo sei eventi di spike ma
tutti contemporanei a quelli precedentemente individuati per la piastra neurale non
151
5. Risultati ottenuti
schermata. In questo caso le localizzazioni su scala temporale sono risultate essere le
seguenti: 14.1185 s, 14.1220 s, 14.1250 s, 14.1310 s, 14.1840 s, 14.1870 s. Questo, non
significa che gli spike mancanti non siano insorti, è invece molto più probabile ritenere
che l’algoritmo implementato non riesca ad individuarli correttamente a causa ad
esempio della maggiore variabilità del segnale di registrazione della piastra schermata
rispetto a quella non schermata. Ora, avendo individuato un elevato numero di spike
consecutivi s’è voluto fornire quindi anche una caratterizzazione di questi spike sotto
forma di burst. I risultati sono mostrati nuovamente in figura 98 (parte destra).
Interessante è notare che la prima serie di spike codifica per un burst di estensione 13 ms
che si estende al di sopra del terzo livello (definito in unità arbitrarie); pertanto, la mole
di informazioni contenuta nella serie di spike che lo costituiscono è maggiore rispetto a
quella contenuta nel successivo burst di estensione 6 ms, caratterizzato da un’intensità
informativa relativa di poco inferiore all’unità (espressa sempre in unità arbitrarie). Il
medesimo discorso è fattibile in maniera analoga per gli spike individuati dalla piastra
sotto schermatura sebbene, i livelli d’intensità relativi siano inferiori a causa della
probabile perdita di eventi di spike dovuta al rumore di fondo.
Figura 98: Individuazione spike – burst nell’intervallo compreso tra 14,10 e 14,20 s
152
5. Risultati ottenuti
A questo punto analizziamo le correlazioni interne al segnale stesso, e le
correlazioni fra i diversi segnali neurali registrati dalle due piastre neurali considerate. In
figura 99 è visualizzata l’autocorrelazione. Se analizziamo i grafici della porzione destra,
è chiaramente visibile come gli indici di autocorrelazione, per entrambi i segnali, si
aggirino sempre attorno a valori massimi compresi fra 0,8 e 1. Se consideriamo
l’andamento notiamo come questo sia assai simile per entrambi i segnali: rimane infatti
massimo per i primi valori (fino al quarto e il sesto lag rispettivamente) per poi calare
uniformemente e in modo graduale - lineare nei lag più distanti.
Figura 99: Autocorrelazione dei segnali neurali delle due piastre
Analizzando la porzione di sinistra della figura 99, notiamo invece come la funzione di
autocorrelazione calcolata su un ritardo di 500 abbia andamento oscillante decrescente,
meglio definito, ovviamente, nel segnale registrato dalla vaschetta neurale non schermata
rispetto a quella schermata.
Sapendo che l’autocorrelazione, è una misura piuttosto inconsistente soprattutto se
calcolata sui primi lag di ritardo, è interessante determinare a questo punto
l’autocorrelazione parziale. In figura 100 possiamo analizzare e confrontare le funzioni
153
5. Risultati ottenuti
derivate con la procedura di calcolo del DSP-system “pacf.m” per entrambi i segnali. Gli
andamenti sono tra loro molto simili, sebbene, non identici. Infatti, seppur entrambi
“dipingano” un andamento sinusoidale, queste funzioni sono caratterizzate da un periodo
differente: 6 lag per quanto riguarda la vaschetta non schermata, 4 lag per la vaschetta
coperta dalla seconda gabbia di Faraday.
Figura 100: Autocorrelazione parziale dei segnali neurali delle due piastre
Confrontando “lag by lag” i due segnali, notiamo che difficilmente i coefficienti di
autocorrelazione
parziale
calcolati
risultano
identici.
Le
principali
differenze
sostanzialmente riguardano il lag numero 5, 7, 10, 11, 12, 13 e 14.
Per quanto riguarda la correlazione fra i due segnali, è utile osservare
l’andamento della cross-correlazione (figura 101).
Figura 101: Cross-correlzaione dei segnali neurali delle due piastre
154
5. Risultati ottenuti
Nella porzione di destra di figura 101 osserviamo come gli indici di cross correlazioni si
mantengano al di là dei limiti confidenziali. Tuttavia il livello di cross-correlazione è
maggiore nei lag negativi rispetto a quelli positivi.
Alla luce di tutto questo è possibile affermare che, nel dominio temporale, la correlazione
fra i due segnali neurali è comunque molto alta. Ciò potrebbe dar maggior consistenza
all'ipotesi che la risposta neurale sia causata dallo stesso principio di base.
Per giungere ad una descrizione più completa dei segnali è inoltre possibile
indagare le caratteristiche fondamentali dei segnali considerati anche nell’ambito delle
frequenze. Innanzitutto deriviamo quali siano le frequenze fondamentali che determinano
il nostro segnale. Ricordando che qualsiasi frequenza inferiore ai 500 Hz è da
considerarsi poco significativa nelle registrazioni con array di microelettrodi, in figura
102 sono presenti importanti picchi in prossimità delle frequenze di 1000 Hz. Questo,
oltre a consolidare ancora una volta l’ipotesi che i segnali neurali siano molto simili l’un
l’altro e forse anche innescati da uno stesso meccanismo, può essere esplicato
considerando la capacità di determinati neuroni (in particolare interneuroni corticali) di
raggiungere frequenze di scarica proprio attorno ai 1000 Hz.
Figura 102: Trasformate di Fourier dei segnali neurali
In figura 103 vengono confrontati i due periodogrammi dei segnali neurali delle
differenti piastre considerate. Questa rappresentazione grafica è caratterizzata da una
leggera differenza nei due tracciati, tuttavia in accordo con quanto detto sopra, per
frequenze relative piuttosto basse comprese tra 500 e 2000 Hz (tra 0,05 e 0,2 Hz in figura
103) esiste un andamento assai simile, sebbene poi la divergenza si faccia molto più
pronunciata all’aumentare delle frequenze.
155
5. Risultati ottenuti
Figura 103: Periodogramma dei segnali neurali
Infine, come ultima analisi nel dominio frequenziale, è stata calcolata la coerenza fra i
due segnali. Sebbene, come visualizzato in figura 104, l’andamento generale non sia
proiettato verso altissimi valori di coerenza, è comunque vero che esistono molte
frequenze relative dove la coerenza dei segnali raggiunge valori di massimo molto alti e
consistenti, con dei picchi addirittura intorno a 0,85. Di particolare interesse risultano
essere le zone di coerenza intorno ai valori di 1000 Hz, dove, come detto, si raggiungono
i picchi significativamente più alti.
Figura 104: Coerenza dei segnali neurali
156
5. Risultati ottenuti
Al fine di testare l’esistenza di possibili effetti aggiuntivi del segnale registrato dal
primo canale della piastra di neuroni sulla struttura d’autoregressione del secondo canale,
e per verificare anche la comprensione e la validità delle considerazioni fatte, viene
costruito un modello ARIMA cross-correlato caratterizzato in questo caso da 7 termini
autoregressivi, 6 termini a media mobile e un singolo ordine di differenza. I risultati di
questo modello sono rappresentati in tabella 4.
Tabella 4: Coefficienti ARIMA (7, 1, 6)
Possiamo dire che più il valore dei coefficienti della serie stimata (S.E.) si avvicinano allo
zero e più il modello risulta essere rappresentativo della fenomenologia analizzata. In
questo caso, possiamo affermare che le due serie analizzate sono fra loro sufficentemente
correlate e quindi i valori di una hanno un discreto impatto sulla predizione dei valori
dell’altra. In seguito alla valutazione del modello ARIMA (7, 1, 6) impiegato (figura 105)
è possibile affermare che il modello definito potrebbe essere appropriatamente impiegato
anche per effettuare delle predizioni riguardo alla evoluzione di entrambe le serie
temporali, infatti tutti i test eseguiti risultano essere piuttosto consistenti.
Figura 105: Test validità ARIMA (7, 1, 6)
157
5. Risultati ottenuti
Alla luce di queste analisi è possibile sicuramente affermare che, sebbene
solamente una piastra venga stimolata dall’emissione laser, entrambi i meccanismi di
risposta delle cellule sembrano essere correlati e coerenti gli uni agli alti, dimostrando
alla base l’esistenza di un fenomeno anomalo ma simile in entrambe le vaschette. Questo
è piuttosto strano tenendo presente che la piastra dei neuroni schermati non dovrebbe
risentire affatto dell’attività di risposta della piastra stimolata.
5.5 Stimolazione piastra neuroni, piastre matrigel e liquido schermate otticamente
Torniamo a considerare le fasi dell’esperimento X. In questa fase il laser è puntato
sulla piastra dei neuroni. La piastra del matrigel è schermata dalla seconda gabbia di
Faraday e, assieme alla piastra del liquido di coltura, è protetta anche da uno spesso strato
di cartone che funge da isolante fotonico. Tutto il sistema è, come già detto, schermato
dalla prima gabbia di Faraday in ottone.
Sorprendentemente, in questa registrazione non si evidenzia alcuna attività di
spike in seguito a stimolazione laser in nessuna delle piastre, nemmeno in quella non
schermata (figura 106). Questo fatto potrebbe essere spiegato adducendo al fatto che si
sia verificato un possibile movimento della coltura neuronale sulla piastra MEA, come
detto in precedenza, durante le fasi di schermatura in seguito alla manipolazione delle
piastre stesse.
Figura 106: Stimolazione piastra cellule nervose
158
5. Risultati ottenuti
Attualmente la manipolazione dei bacini di registrazione rappresenta una fase
molto delicata della sperimentazione ed è la principale causa della differenza dei risultati
sperimentali ottenuti nel corso degli esperimenti condotti.
5.6 Stimolazione piastra matrigel, piastre neuroni e liquido schermate otticamente
In questa fase il laser viene puntato sulla piastra dove è contenuto il matrigel. La
piastra dei neuroni è schermata dalla seconda gabbia di Faraday e, assieme alla piastra del
liquido di coltura, è protetta dallo strato di cartone. Tutto il sistema è infine schermato
dalla solita gabbia di Faraday in ottone.
Osservando la figura 107 sono ora visibili, a differenza della fase
precedentemente descritta e analogamente alle fasi dell’esperimento IX già illustrate, per
tutta la durata della fase di registrazione, una serie consecutiva di spike (evidenziati in
figura mediante frecce). E’ evidente che l’insorgenza di questi eventi di spike non siano
affatto casuali, bensì mediati ogni volta dalla stimolazione mediante diodo laser.
E’ interessante sottolineare due aspetti chiave:
- La piastra stimolata è quella del matrigel e non quella dei neuroni; questa
volta, in aggiunta, la piastra di neuroni è schermata doppiamente:
dall’involucro di cartone, e dalla seconda gabbia di Faraday. Ma, nonostante
ciò, i neuroni riescono comunque a rispondere contemporaneamente agli
stimoli.
- Il laser è puntato sulla piastra matrigel, ed essendo il raggio laser coerente ed
unidirezionato sarebbe interessante a questo punto proporre un’interpretazione
della fenomenologia osservata.
Le piastre, sia del matrigel che del liquido di coltura, non evidenziano a differenza
della piastra neurale alcuno spike agli stimoli fotonici applicati.
Di seguito si procederà ad effettuare due tipi di analisi su questo sistema. Per
prima cosa si cercherà di caratterizzare il segnale registrato dal I canale della vaschetta
contenente matrigel con il canale I della vaschetta contenete neuroni sottoposta a
schermatura sia ottica che elettromagnetica, in maniera tale da evidenziare eventuali
analogie con le analisi condotte precedentemente nelle fasi dell’esperimento IX.
159
5. Risultati ottenuti
Successivamente si effettueranno una serie di analisi statistiche considerando questa volta
entrambi i canali della vaschetta con neuroni doppiamente schermati dalla luce laser.
Figura 107: Stimolazione piastra matrigel
160
5. Risultati ottenuti
Focalizziamoci sull’analisi di un sotto-intervallo significativo, tale intervallo sarà
ovviamente il medesimo per entrambe le analisi proposte sopra. Selezioniamo quindi
l’intervallo compreso fra gli estremi 59500 e 60500 (5,95 – 6,05 s).
In figura 108 è rappresentato il segnale neurale registrato dal primo canale della
vaschetta posta sotto la seconda gabbia di Faraday e lo strato di cartone, nonché il segnale
registrato dal primo canale della piastra caratterizzata dalla presenza di matrigel.
Figura 108: Dettaglio grafico dell’intervallo compreso fra 5,95 e 6,95 s
Nella figura 109 è visualizzata la corretta locazione del potenziale d’azione
presente esclusivamente nel segnale registrato dalla vaschetta neurale. Possiamo infatti
dedurre attraverso la funzione Zoom+ di Matlab che lo spike visualizzato in figura 108 è
insorto alla 59935a misurazione, ovvero alla 435a misurazione a partire dall’inizio del
sotto-intervallo considerato, che, per l’appunto, cominciava dalla 59500a misurazione.
Per quanto riguarda l’individuazione dei possibili potenziali d’azione del segnale
matrigel, non è necessario procedere alla compilazione della procedura “spike.m” in
quanto, anche visivamente, è evidente la loro completa assenza. Chiaramente, essendoci
un singolo spike, è inutile anche cercare di determinare dei burst in questa porzione di
segnale, in quanto il DSP-system non fornirebbe alcun risultato.
161
5. Risultati ottenuti
Figura 109: Potenziale d’azione del segnale neurale della piastra schermata
Procediamo quindi ora alla visualizzazione delle corrispettive funzioni di
autocorrelazione di questi segnali (figura 110).
Figura 110: Funzione d’autocorrelazione dei due segnali
Possiamo evidenziare, osservando dapprima la porzione di destra dei grafici riportati,
come il segnale neurale sia molto più autocorrelato rispetto a quello registrato dalla
vaschetta matrigel. Quest’ultimo, infatti, decresce in maniera lineare a partire dal lag
162
5. Risultati ottenuti
numero zero fino al quattordicesimo, assestandosi successivamente intorno a un valore di
correlazione di 0,6. Il segnale neurale invece procedendo a valori di lag via via superiori
non scende mai al di sotto di 0,9. Prestando attenzione alla funzione di autocorrelazione
calcolata rispetto ai 500 lag, porzione di sinistra di figura 110, è possibile notare nel
segnale neurale un andamento lineare decrescente più uniforme e costante rispetto a
quello evidenziato nel segnale della vaschetta matrigel.
Per approfondire le differenze emerse nei valori di autocorrelazione dei due
segnali analizzati sopra, è bene approfondire la nostra analisi rifacendoci ancora una volta
all’autocorrelazione parziale (figura 111).
Figura 111: Funzione d’autocorrelazione parziale tra i due segnali
E’ evidente come gli andamenti dei due segnali siano tra loro piuttosto differenti,
sinonimo questo del fatto che i due segnali, seppure autocorrelati, fra loro presentino
importanti differenze. L’andamento generale delle due funzioni, facendo un confronto tra
i diversi lag, è sostanzialmente dissimile soprattutto nella prima parte (tra il terzo e
l’ottavo lag) e nella regione centrale (tra l’undicesimo e il diciassettesimo lag).
163
5. Risultati ottenuti
Queste differenze possono essere indagate in maniera maggiormente approfondita
effettuando una analisi di cross-correlazione tra i due segnali considerati (figura 112).
Figura 112: Funzione di cross-correlazione tra i due segnali
Analizzando la porzione di destra della figua 112 gli indici della cross-correlazione, per
valori di lag negativi, sono contenuti all’interno del “confidential bound” e quindi per
definizione per lag negativi la funzione non è da considerarsi cross-correlata. Invece
l’andamento per ritardi positivi è differente mostrando una crescita via via lineare, che
raggiunge un massimo di –0,28 intorno al ventesimo lag. Osservando l’andamento
generale della cross-correlazione, porzione sinistra della figura 112, abbiamo un’altra
relativa conferma dell’andamento non costante e non lineare della funzione. Perciò, alla
luce dei risultati fino a questo punto raccolti, è possibile affermare che il segnale neurale
e quello del matrigel nel dominio temporale presentano sostanziali differenze e sono in
buona sostanza scorrelati l’un l’altro.
Passiamo ora ad analizzare il dominio delle frequenze.
Figura 113: Trasformate di Fourier di entrambi i segnali
164
5. Risultati ottenuti
In figura 113 sono rappresentate le trasformate di Fourier dei due segnali considerati. E’,
anche in questo caso, subito palese la diversità tra i due segnali. Infatti, dalla frequenza di
500 Hz, il segnale del matrigel (parte destra del grafico) non presenta alcun picco di
interesse. Questo è in accordo col fatto che il segnale sia esattamente uguale ad un
segnale di registrazione a vuoto, quindi sostanzialmente deve essere “piatto”. Nella
porzione sinistra di figura 113 è invece presente, ancora una volta, il classico picco
intorno a frequenze di 1000 Hz. Questo fatto fornisce un’ulteriore dimostrazione che
nonostante doppia schermatura e nonostante stimolazione di una vaschetta contenente
matrigel il segnale dei neuroni è caratterizzato da caratteristiche consistenti con quelle dei
segnali neurali analizzati precedentemente e stimolati mediante fasci fotonici.
Analizziamo ora le ultime due funzioni legate al dominio delle frequenze: il
periodogramma e la coerenza (figura 114).
Figura 114: sx) Periodogramma dx) Coerenza dei due segnali analizzati
Sia il periodogramma che la coerenza non offrono risultati interessanti, tuttavia questo
comportamento era prevedibile a priori, in quanto i segnali in esame sono molto differenti
fra loro. Iniziamo tuttavia a considerare il periodogramma, nella rappresentazione grafica
di figura 114 (parte sinistra) è visibile come il segnale matrigel sia molto differente sia
come intensità sia come andamento dal segnale proveniente dalla vaschetta dei neuroni.
La coerenza invece presenta un andamento schiacciato verso valori molto bassi
prevalentemente attorno allo 0,3 e picchi massimi al più lambenti valori di 0,5.
Queste analisi ci permettono di affermare con un certo grado di confidenza che i
segnali neurali risentano, seppure schermati doppiamente, degli stimoli fotonici anche a
165
5. Risultati ottenuti
grandi distanze. Inoltre i test statistici condotti fino a questo punto dimostrano una grande
consistenza e correlazione sia temporale che frequenziale fra due segnali neurali registrati
contemporaneamente da piastre differenti, cosa che invece non avviene tra un segnale
neurale e uno di controllo.
Effettuiamo infine l’analisi di due canali registrati dalla medesima piastra MEA
con adese cellule neurali sottoposte a doppia schermatura.
Consideriamo ancora una volta il solito sotto-intervallo di tempo, caratterizzato
dalla finestra temporale compresa tra 5,95 e 6,05 s.
Figura 115: Segnale sotto-intervallo compreso tra 5,95 e 6,05 s
Guardando il grafico di figura 115 è possibile osservare, con grande dettaglio, gli spike
che insorgono in seguito a stimolazione laser, sebbene come già ribadito la piastra sia
doppiamente schermata.
Figura 116: Localizzazione degli spike individuati
166
5. Risultati ottenuti
Nella figura 116, sono stati nuovamente individuati e localizzati correttamente,
come sopra descritto (figura 109), i potenziali d’azione dei due segnali neurali studiati in
questa fase.
Cerchiamo di estrapolare allora ancora una volta delle interessanti considerazioni
sui segnali che stiamo considerando dapprima in relazione alla loro evoluzione
temporale. La funzione di autocorrelazione di entrambi i segnali è riportata in figura 117.
Figura 117: Funzioni di autocorrelazione dei due segnali
Concentriamoci come al solito prima sulla porzione destra di tale figura: è evidente come
i segnali siano fortemente autocorrelati nella maggioranza degli intervalli. Infatti, i valori
d’autocorrelazione calcolati per i 20 lag considerati per il segnale del primo canale
iniziano con valori massimi per poi diminuire gradatamente stabilizzandosi attorno a
valori di 0,8; anche il segnale del secondo canale ha il medesimo andamento partendo da
valori molto alti e scendendo gradualmente intorno a valori di 0,6. Invece, osservando la
porzione sinistra è palese osservare come la struttura dell’autocorrelazione, via via
decrescente, sia in buona sostanza la medesima per entrambi i segnali. Quindi è possibile
affermare che entrambi i segnali neurali rappresentati condividono lo stesso meccanismo
167
5. Risultati ottenuti
di generazione non-lineare, nonostante esista una leggera differenza di andamento
generale testimoniata dai discordanti valori di statistica descrittiva (media, mediana,
deviazione standard, massimi, minimi…).
La struttura del meccanismo, evidenziata già mediante l’autocorrelazione, può
essere ancora una volta indagata in modo migliore considerando anche la funzione di
autocorrelazione parziale dove viene considerata come sappiamo solamente la
correlazione dei residui (figura 118).
Figura 118: Funzioni di autocorrelazione parziale dei due segnali
Anche in questo caso, al di là di qualche modesta differenza, ad esempio le correlazioni
parziali dei lag 7 e 16 significative per il primo canale ma non per il secondo, la struttura
complessiva appare esser assai simile tra i due segnali registrati.
Come ultima analisi nel dominio temporale, è stata derivata la cross-correlazione
(figura 119) fra i due segnali neurali già sopra analizzati mediante autocorrelazione. In
realtà, bisogna fare un discorso più generale in quest’ultimo caso. Infatti, nonostante
entrambi i metodi implementati forniscano risultati piuttosto convincenti, strutturati e
relazionati gli uni agli altri, è bene sottolineare anche il seguente aspetto. Siccome, come
168
5. Risultati ottenuti
precedentemente mostrato, ogni segnale è fortemente autocorrelato, la cross-correlazione
osservata potrebbe essere anche “spuria” in quanto indotta dalla struttura altamente
ripetuta dei due singoli canali considerati, soprattutto ora che stiamo considerando segnali
registrati dalla stessa piastra. Questa considerazione, scaturisce in particolar modo
osservando la porzione destra di figura 119. Infatti, l’indice di cross-correlazione pur
assumendo valori significativi, non supera mai per nessun lag quota – 0.25 abbattendosi,
fra l’altro, improvvisamente in prossimità del lag 0 attorno a valori di non significatività.
Figura 119: Funzione di cross-correlazione tra i due segnali
Considerato l’andamento reciproco dei segnali rispetto alla dimensione temporale,
interessante è estrapolare anche delle considerazioni relative al dominio delle frequenze
riguardo a questi segnali, al fine di cercare ulteriori andamenti e caratteristiche
significative.
Tramite la trasformata di Fourier, si sono derivate anche in questo caso le
frequenze fondamentali caratterizzanti la coppia di segnali considerati (figura 120).
Nuovamente è riscontrabile un andamento assai simile in entrambi questi segnali. Non
considerando come già spiegato le frequenze al di sotto dei 500 Hz, in quanto considerate
non significative nelle registrazioni MEA, le uniche frequenze di rilievo rimangono
quelle localizzate attorno a 1050 - 1100 Hz per entrambe le registrazioni dai canali
neurali. Ciò starebbe quindi ad indicare che i due segnali siano caratterizzati da un’unica
armonica fondamentale oltre che da un discreto rumore di fondo di bassa frequenza.
Questo, come detto, risulta avere un certo riscontro biologico rifacendoci alla capacità di
particolari neuroni di oscillare attorno a frequenze di riferimento di 1000 Hz.
169
5. Risultati ottenuti
Figura 120: Trasformata di Fourier dei due segnali
Di sicura utilità potrebbe essere in futuro l’implementazione di particolari filtri aggiuntivi
in grado di abbassare significativamente il livello di rumore delle nostre registrazioni, in
modo tale d’avere una visione più chiara del segnale e delle caratteristiche d’interesse.
170
5. Risultati ottenuti
Analizziamo ora il periodogramma (figura 121). Questo evidenzia un andamento
ciclico e regolare comune per entrambi i segnali, dando ancora una volta conferma del
fatto che ci siano dei forti meccanismi e delle relazioni comuni consistenti nelle coppie di
segnali neurali registrati dalla piastra MEA di neuroni.
Figura 121: Periodogramma dei due segnali
Ultima analisi che ci interessa valutare nel dominio delle frequenze è la coerenza
tra i due segnali in modo di stabilire la correlazione esistente fra di essi (figura 122).
Figura 122: Coerenza fra i due segnali
171
5. Risultati ottenuti
Come è facilmente intuibile dal grafico di figura 122 i due segnali neurali mostrano ora
una fortissima coerenza considerando il fatto che essi sono schermati doppiamente.
Inoltre, seppure in tutto il dominio delle frequenze il coefficiente di correlazione
difficilmente scenda a livelli di non significatività, il range più correlato risulta essere
quello compreso tra 0.1 e 0.25 Hz. Questo intervallo di frequenze relative coincide anche
con la regione dello spettro delle frequenze di Fourier, in cui sono stati precedentemente
individuati i picchi di frequenze significativi nella caratterizzazione di entrambi i segnali.
Quindi, alla luce di tutto questo, possiamo senz’altro affermare che i segnali registrati dai
due canali della piastra MEA con cellule neurali umane, seppure schermate, siano
sicuramente consistenti e non dovuti a rumore né al caso.
Al fine di testare ancora una volta possibili effetti aggiuntivi del segnale registrato
dal primo canale della piastra di neuroni sulla struttura d’autoregressione del secondo
canale, e per verificare anche la comprensione e la validità delle considerazioni fatte sul
modello viene costruito, in base alle analisi temporali fatte, un modello ARIMA crosscorrelato caratterizzato da 4 termini autoregressivi, 5 termini a media mobile e un singolo
ordine di differenza. I risultati di questo modello sono rappresentati in tabella 5.
Tabella 5: Modello ARIMA (4,1,5)
In questo caso, possiamo affermare che le due serie analizzate sono discretamente
correlate l’un l’altra implicando che i valori di una serie possono avere un buon impatto
sulla predizione dei valori dell’altra. Quindi il meccanismo alla base è il medesimo,
questo ormai non ci sorprende più, in quanto risulta evidente che i neuroni risentano
sempre e contemporaneamente dello stesso impulso laser. In seguito alla valutazione del
172
5. Risultati ottenuti
modello ARIMA (4, 1, 5) impiegato (figura 123) è possibile affermare che il modello
definito potrebbe essere impiegato anche per effettuare delle predizioni di entrambe le
serie temporali.
Figura 123: Test di valutazione modello ARIMA (4, 1, 5)
Come si vede chiaramente dalla figura 123 il primo grafico rappresenta
l’ampiezza dei residui standardizzati che è pressoché piatta (ad eccezione del valore 475
di spike); il secondo visualizza i valori dei residui dell’autocorrelazione, anch’essi tutti
compresi nel limite di confidenza come dovrebbe essere per un buon modello; e infine il
p-test di Ljung-Box che risulta essere anch’esso molto buono in quanto tutti i p-value
sono al di là del bound indicato.
Certamente, a seguito di questi test, possiamo ritenere di essere in possesso di un
buon modello descrittivo delle serie temporali analizzate. Inoltre, alla luce di tutte le
analisi compiute possiamo affermare che il fenomeno osservato sia molto particolare, non
descrivibile quindi in termini classici, ed evidenziante numerose caratteristiche anomale.
Inoltre, queste caratteristiche sono state riscontrate, con qualche piccola differenza, anche
nel resto dei file analizzati ciascuno dei quali contenente alcune decine di impulsi laser.
Quindi allorquando il laser è attivato i neuroni, non importa se schermati o meno,
173
5. Risultati ottenuti
riescono sempre a captare qualche fotone e quindi generare eventi di spike. Gli
innumerevoli test statistici compiuti testimoniano che l’attività di spike è reale e non
causata da eventi stocastici casuali. Tutta la rassegna di file raccolta e analizzata negli
esperimenti IX e X potrebbe indicare quindi la grande capacità dei neuroni di reagire
attivamente a stimoli fotonici anche a distanze considerevoli, il che potrebbe anche
rappresentare il presupposto per la descrizione e la risoluzione, in futuro, del problema
del binding sensoriale.
Tuttavia, per motivi di spazio non è stato possibile inserire la grandissima quantità di dati
analizzati.
5.7 Stimolazione piastra liquido coltura, piastre neuroni e matrigel schermate
otticamente
In questa fase il laser viene puntato sulla piastra con il liquido di coltura. Le altre
due piastre sono schermate otticamente dallo strato di cartone. Sulla piastra dei neuroni
viene mantenuta la seconda schermatura elettromagnetica. Tutto il sistema è inserito
all’interno della solita gabbia di Faraday in ottone.
In figura 124 è rappresentata la porzione di segnale compresa tra 3,5 e 3,7
secondi. Anche in questo caso alla generazione dell’impulso laser la vaschetta delle
cellule nervose risponde generando differenti potenziali d’azione (qui rappresentato
solamente uno in dettaglio). Né la vaschetta del matrigel, stimolata, né quella del liquido
di coltura evidenziano alcuna risposta significativa.
5.8 Stimolazione piastra neuroni, piastra matrigel e liquido libere da schermatura
ottica
A partire da questa fase, e per le tre successive fasi, lo spesso involucro di cartone
viene tolto. Il laser viene a questo punto indirizzato nuovamente sulle cellule nervose
neurali, il matrigel è coperto dalla seconda gabbia di Faraday, e, tutto il sistema è a sua
volta schermato dalla gabbia in ottone. Chiaramente, come ci si aspetta, la vaschetta con
174
5. Risultati ottenuti
neuroni risponde con attività di spike allorquando stimolata mentre le altre due piastre
MEA non mostrano, nemmeno in questo caso, alcuna attività di spike (figura 125).
Figura 124: Stimolazione piastra liquido di coltura
175
5. Risultati ottenuti
Figura 125: Stimolazione piastra cellule nervose senza schermatura ottica
176
5. Risultati ottenuti
5.9 Stimolazione piastra matrigel, piastre neuroni e liquido libere da schermatura
ottica
In questa fase il laser colpisce la vaschetta contenete il matrigel, i neuroni sono
coperti dalla seconda gabbia di Faraday, e la gabbia di ottone scherma tutto il sistema.
Ancora una volta la piastra di neuroni interagisce agli stimoli (figura 126).
Figura 126: Stimolazione piastra Matrigel senza schermatura ottica
177
5. Risultati ottenuti
5.10 Stimolazione piastra liquido coltura, piastre neuroni e matrigel libere da
schermatura ottica
Il laser colpisce la piastra col liquido di coltura, i neuroni sono schermati dalla
seconda gabbia di Faraday e, al solito, tutto il sistema è contenuto nella gabbia d’ottone
(fig. 127).
Figura 127: Stimolazione piastra liquido coltura senza schermatura ottica
178
5. Risultati ottenuti
E’ palese che, anche in questo caso, i neuroni risentano delle particelle fotoniche
innescando di conseguenza una reazione elettrica registrabile mediante MEA.
5.11 Laser schermato da una pellicola a doppio strato di alluminio, cosicché nessuna
emissione possa propagarsi, attivato sopra i neuroni
In questa fase il laser è ricoperto da un doppio strato di alluminio che funge da
protezione da qualsiasi emissione fotonica, anche in questo caso una volta attivato il laser
si evidenziano dei potenziali d’azione (figura 128). Il diodo in questo esempio è
comunque attivato al di sopra della piastra MEA contenente i neuroni.
Figura 128: Stimolazione piastra neuroni laser coperto
179
5. Risultati ottenuti
5.12 Laser posto a 1 metro di distanza, nascosto alla piastra di neuroni, attivato e
diretto in direzione opposta
Infine, per quanto riguarda le stimolazioni mediante laser, è stata registrata
l’attività delle cellule neurali portando la nostra sorgente laser alla distanza di un metro
dalle piastre precedentemente stimolate. Questa distanza è molto elevata, e, considerando
che il fascio fotonico veniva puntato in direzione opposta, la risposta delle cellule ancora
una volta proprio all’attivazione del diodo appare essere assolutamente anomala (figura
129).
Figura 129: Registrazione piastre MEA con laser a distanza orientato in direzione opposta
180
5. Risultati ottenuti
5.13 Stimolazione mediante luce LED
Nell’esperimento IX in seguito agli anomali risultati osservati attraverso la
stimolazione con luce laser s’è voluto determinare se un analogo comportamento venisse
registrato anche mediante stimolazione con luce LED.
Come visualizzato in figura 130, l’andamento del segnale registrato da piastre
MEA con adesi neuroni umani, non presenta alcun possibile spike in seguito a
stimolazioni LED. Questa prova è stata fatta su un doppio controllo, utilizzando due
piastre MEA con neuroni. Un occhio allenato alla analisi dei tracciati di array di
microelettrodi potrebbe affermare infatti che le oscillazioni, rappresentate in figura 130,
sono dovute in parte ad un problema di visualizzazione grafica dovuta alla eccessiva
compressione dei 400000 valori derivati (essendo la frequenza di campionamento pari a
10000 campioni al secondo), e in parte al rumore intrinseco ad ogni registrazione di
questo tipo.
Figura 130: Stimolazione mediante diodo LED di due piastre MEA con neuroni
181
5. Risultati ottenuti
Un’ulteriore conferma di quanto detto ci viene fornita analizzando un piccolo sottointervallo compreso tra 20,8 e 21.6 secondi (figura 131) in prossimità di uno stimolo
LED. E’ evidente che non vi sia una sostanziale differenza nel tracciato in prossimità del
punto di stimolazione (21.237 s), piuttosto è evidente come il tracciato rimanga identico a
se stesso, sempre con le solite oscillazioni non significative. Se confrontassimo questi
grafici (figura 131), anche senza effettuare una statistica descrittiva, con quelli di figura
92 balzerebbe subito all’occhio che la stimolazione mediante LED risulti essere del tutto
inefficace nel far insorgere possibili spike, in quanto il segnale risulta simile ad una
registrazione a vuoto.
Figura 131: Zoom+ stimolazione mediante diodo LED delle pistre con neuroni
182
5. Risultati ottenuti
Figura 132: Cross-correlazione (dx) e Coerenza (sx) segnali stimolati tramite diodo LED
In figura 132 s’osserva il basso livello di cross-correlazione (picco massimo -0,3)
e coerenza (picco massimo 0,46) tra i due segnali in prossimità della stimolazione
mediante diodo LED, il che conferma solamente il fatto dell’esistenza di un alto rumore
ma nella maniera più assoluta non di un segnale di spike in seguito a stimolazione.
5.14 Considerazioni
Possiamo riassumere tutti i dati raccolti attraverso i seguenti punti:
Solamente la piastra MEA con i neuroni reagisce allo stimolo laser.
La reazione osservata non può essere causata da qualche tipo di interferenza, in
quanto:
1. La reazione non è presente simultaneamente in tutti i canali.
2. Le caratteristiche del circuito laser non possono generare alcuna
interferenza elettromagnetica (EMI interference): Il modulatore laser è
dotato di una propria batteria, mentre il circuito laser è completamente
separato dal controllo hardware e dal PC. Inoltre il circuito laser è posto ad
un metro di distanza e schermato da un contenitore d’alluminio pesante, e
anche la “cable power” è rivestita in modo isolante.
3. La reazione neuronale è visibile solo quando il laser viene attivato.
La schermatura di fotoni (quando l’emissione laser viene coperta) non inibisce il
fenomeno osservato.
La schermatura elettromagnetica non inibisce il fenomeno.
183
5. Risultati ottenuti
La distanza del laser (fino a 1 metro) non inibisce il fenomeno.
Il matrigel non reagisce agli stimoli laser.
Il liquido di coltura non reagisce al laser.
L’interpretazione che possiamo dare al fenomeno non è semplice ma potremmo
dire che i numerosi test statistici eseguiti su tutti i file di registrazione dimostrano che i
neuroni sono in grado di rispondere in maniera organizzata a stimoli fotonici dando
parziale fondamento anche ai Quantum Brain Models visti in precedenza. Risulta inoltre
interessante che i neuroni possano comportarsi come degli straordinari ricevitori sensibili
ai movimenti fotonici, nonostante la presenza delle robuste schermature sia ottiche che
elettromagnetiche impiegate in questi esperimenti.
184
Conclusioni
Conclusioni
185
Conclusioni
In questo lavoro sono stati descritti i risultati e i dati raccolti dalle sperimentazioni
su cellule neurali derivate da NSC umane in seguito a stimolazioni laser, al fine di
ricercare eventuali processi non classici all’interno di neuroni.
Nell’esperimento IX il sistema di studio analizzato era caratterizzato da due
vaschette differenti, entrambe adibite alla crescita di neuroni, integrate ad array planari di
microelettrodi. Una delle due veniva sottoposta a stimolazioni laser; l’altra era posta sotto
schermatura elettromagnetica.
Nell’esperimento X il sistema di studio era invece caratterizzato da una sola vaschetta di
neuroni e da due vaschette di controllo riempite rispettivamente con matrigel e con del
liquido di coltura. Le tre piastre, a turno, erano poste sotto l’impulso laser o sotto
schermatura ottica e ed elettromagnetica (fase 1). In seguito, mantenendo le precedenti
schermature, l’emissione laser veniva coperta da un doppio foglio di alluminio (fase 2).
Infine, il laser era allontanato dalle vaschette ad una distanza pari ad un metro, mentre
l’emissione fotonica era diretta in direzione opposta rispetto alle piastre (fase 3).
Alla luce dei file registrati ed analizzati in ciascuna delle situazioni sperimentali
sopra descritte, l’impulso laser ha sempre innescato un potenziale d’azione nei neuroni;
potenziale che, invece, non è stato mai riscontrato nei canali delle vaschette di controllo.
Molto interessante è notare che nella seconda e terza fase dell’esperimento X i picchi di
spike, nonostante l’impiego di schermature multiple e l’attivazione del diodo a grandi
distanze, sono ancora presenti e ben visibili.
A seguito dei numerosi test di controllo eseguiti è stato possibile affermare che gli
spike rilevati dalla vaschetta neurale non siano imputabili in alcun modo ad effetti di
cross-talk tra i canali, ad accoppiamenti parassiti tra i circuiti di rilevazione, ad
interferenze elettromagnetiche (EMI).
Per meglio indagare la natura del fenomeno osservato s’è cercato di stabilire quale
fosse la qualità delle schermature impiegate sfruttando una telecamera ad alta sensibilità
in grado di apprezzare anche piccole variazioni di luce (3*10-4 lux). S’è proceduto quindi
nella caratterizzazione qualitativa dell’innalzamento della luminescenza allorquando il
laser fosse attivato sotto schermatura: doppio foglio di alluminio attorno al diodo laser,
strato di cartone (3,5 mm) ulteriore strato di alluminio attorno al cilindro cavo di plastica
nera, e quindi seconda gabbia di Faraday. Sorprendentemente, nonostante le multiple
186
Conclusioni
misure di schermatura adottate, è stato stimato che un piccolo numero di fotoni (poche
unità per cm3) era comunque in grado di valicare le “barriere” impostate, in quanto la
telecamera registrava un aumento di luminescenza all’attivazione del diodo laser.
I risultati dell’esperimento hanno quindi evidenziato un’altissima sensibilità dei
neuroni alle radiazioni luminose, sensibilità che dipende sia dalla polarizzazione che dalla
tipologia di radiazione luminosa impiegata: infatti, in precedenti esperimenti in cui si
erano confrontati gli effetti di luce laser (lunghezza d’onda 633 nm, potenza 2mW) e luce
LED (lunghezza d’onda 466 nm, non polarizzata e non coerente) i neuroni non
presentavano significative reazioni alla stimolazione tramite diodo LED.
Inoltre, l’ingente mole di dati raccolta e analizzata per mezzo del software DSPsystem, sviluppato appositamente nel linguaggio Matlab ed R per poter compiere
specifiche indagini statistico-spettrali di natura lineare e non-lineare, hanno evidenziato
comportamenti interessanti ed anomali:
-
Un’alta e decisiva autocorrelazione dei segnali di risposta neurale a
stimolazioni laser.
-
Un decisivo incremento della cross-correlazione tra due segnali neurali,
allorquando veniva attivato il diodo laser.
-
Presenza di segnali con caratteristiche frequenze attorno a 1000 Hz.
-
Un’alta similarità nel tracciato del periodogramma per i segnali neurali
stimolati e schermati.
-
Un alto grado di coerenza soprattutto per il range di frequenze comprese tra
0,08 e 0,20 rispetto alla frequenza di campionamento (800 – 2000 Hz).
Sebbene il significato biologico di questi risultati debba essere ancora chiarito nel suo
complesso, è chiaro comunque che si manifesti una risposta non casuale e non prevista
(né prevedibile) classicamente.
Questa super-reattività dei neuroni a debolissimi impulsi fotonici potrebbe
verosimilmente essere dovuta alla attività dei microtubuli in grado, come teorizzato da
Stuart Hameroff, di rispondere coerentemente ed avere un ruolo comunicativo importante
all’interno delle reti biologiche neurali. Prendendo in prestito un termine caro al mondo
delle telecomunicazioni si potrebbe paragonare, nel caso specifico delle cellule nervose, i
microtubuli a delle vere e proprie “antenne” in grado di captare specifiche frequenze
187
Conclusioni
(frequenze di Fröhlich). L’amplificazione del segnale ricavato da queste “antenne
biologiche”,
rifacendoci
sempre
al
modello
di
Penrose-Hameroff,
potrebbe
verosimilmente avvenire per superradianza. Chiaramente, altri importanti studi e ricerche
dovranno essere compiuti per meglio comprendere e spiegare questa innovativa via
comunicativa.
Alla luce di queste considerazioni si sta definendo ora un modello biofisicomatematico attendibile e coerente rispetto ai dati raccolti. In base ai modelli quantici già
presentati in letteratura anche questo dovrà tener in considerazione i microtubuli come
probabili orchestratori del fenomeno descritto.
Il modello che si sta delineando pone infatti grande attenzione sul fatto che i
microtubuli siano, da un punto di vista strutturale, assai simili ai nanotubi di carbonio
(particolari strutture cilindriche ottenute da un singolo foglio di grafite arrotolato su se
stesso). Ambedue le strutture sono caratterizzate da una forma cilindrica cava, il diametro
di un microtubulo è di 25 nm e può raggiungere lunghezze fino a qualche micron, le
dimensioni dei nanotubi possono essere invece uguali, o addirittura inferiori, a quelle dei
microtubuli [Gao&Al98]. Attualmente dei nanotubi di carbonio si conoscono interessanti
proprietà ottiche, elettriche e quantistiche: in particolare è noto che i nanotubi di carbonio
si comportano come antenne in grado di captare le altissime frequenze della radiazione
luminosa visibile [Wan&Al04]. Inoltre i microtubuli, così come i nanotubi, si possono
comportare come oscillatori, questo potrebbe renderli quindi dei veri e propri ricevitori
superreattivi in grado di amplificare il segnale [Mar&Man94, Sep&Al99]. Se questa
analogia strutturale e funzionale venisse dimostrata anche dal rigoroso formalismo
matematico si potrebbe allora delineare una ipotesi consistente e convincente del
meccanismo osservato.
In definitiva i dati presentati in questo lavoro rappresentano un’evidenza
sperimentale della reattività dei neuroni ad impulsi fotonici di debolissima intensità ma di
alta frequenza.
Nonostante le considerazioni fatte possano apparire inusuali se riportate alle
conoscenze classiche circa il funzionamento neurale, l’importanza di percorrere nuove
strade per l’interpretazione dei processi biofisici neurali potrà essere di grande aiuto nella
comprensione del cervello e delle dinamiche che lo caratterizzano.
188
Conclusioni
L’applicazione della fisica quantistica nella caratterizzazione della mente umana
costituisce oggi sicuramente un aspetto rivoluzionario. Questa strada però potrebbe
costituire un valido strumento per la comprensione delle funzioni cognitive soprattutto di
alto livello che, ad oggi, non mostrano un solido e rigoroso fondamento scientifico.
L’approccio quantistico, infatti, né altera né smentisce le convinzioni maturate dagli studi
elettrofisiologici classici condotti nel corso dei secoli, bensì può essere in grado di
ampliare e definire nuove importanti caratteristiche proprie del funzionamento della
mente e del cervello umano.
189
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