PL - GIORNO 4

Genomica strutturale e funzionale
L.M. BT Industriali 2011/2012
Utilizzo della real time-PCR per determinare l’espressione genica di
specifici geni target
Lunedì 23/01/12
ANALISI INFORMATICHE DEFINIZIONI
Calibratore : campione di riferimento verso il quale viene fatta la quantizzazione.
Campione: gene per il quale vogliamo testare l’abbondanza di un particolare trascritto (target).
Controllo endogeno (reference) :gene con livelli di espressione costanti nei campioni in esame e
nel calibratore, che consente di normalizzare il rapporto di espressione.
Livello di espressione: rapporto di espressione tra campione e calibratore.
Dati normalizzati: livello di espressione normalizzato per i valori del gene reference.
CALCOLARE LA DIFFERENZA DI ESPRESSIONE TRA MIOBLASTI E MIOTUBI
Per ogni tempo analizzato (giorno 0, 1, 2, 3, 4) inserire il CT sperimentale nell’equazione della
curva standard per il gene studiato. Da questo valore (Y), possiamo risalire alla concentrazione di
cDNA stampo presente in ogni campione.
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Calcolare il valore medio di concentrazione del campione in ogni tempo
Calcolare il rapporto di espressione (Δconc) tra campione e calibratore:
N.B. fare la differenza tra valori logaritmici
Per conoscere il livello di espressione del gene in studio rispetto al calibratore, inserire il valore
Δconc nell’equazione esponenziale:
livello espressione = efficienza Δconc
Se si ottiene un valore >1 il campione ha espressione maggiore del calibratore; viceversa per valori
<1 il campione è meno espresso del calibratore.
DATI NORMALIZZATI
Ripetere lo stesso calcolo descritto sopra per il gene reference (B2m). Si ricava così il livello di
espressione normalizzato, che ci permette di confrontare l’intera serie di dati.
Genomica strutturale e funzionale
L.M. BT Industriali 2011/2012
DISEGNO DEI PRIMER
Per il disegno dei primer di real time-PCR si utilizzano software specifici come ad esempio Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/ ). Per prima cosa, dobbiamo recuperare la sequenza del mRNA,
interrogando il database dei geni o delle sequenze nucleotidiche con l’identificativo del gene in
esame. Controllare se esistono isoforme e nel caso decidere se si vuole disegnare una coppia di
primers che discrimini una o più isoforme in particolare, oppure che non ne discrimini nessuna.
E’ buona norma disegnare i primers:
A) su due esoni differenti (FOR2/REV2 della figura sottostante),
B) a cavallo della regione di giunzione esone-esone (FOR/REV della figura sottostante).
Infatti uno dei problemi fondamentali nelle reazioni di PCR è rappresentato dalle contaminazioni di
DNA genomico. Così facendo il prodotto di amplificazione derivante da DNA genomico avrà una
dimensione maggiore di quella attesa (A) oppure non verrà amplificato genomico (B).
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Prima di disegnare i primers, studiare l’organizzazione genomica del gene in studio utilizzando
il browser UCSC (http://genome.ucsc.edu )
Selezionare la regione che si desidera utilizzare per il disegno dei primers, copiarla ed incollarla
in Primer 3
Selezionare le caratteristiche dei primers ( vedi opzioni del software stesso)
Effettuare anche più tentativi, fino ad ottenere primers con le caratteristiche richieste:
Amplicone: sequenza unica nel genoma.
Primers : evitare la formazione di omo-dimeri ed etero-dimeri.
Nel primo caso, si lancia la sequenza dell’amplicone contro il genoma di topo (blastn o blat).
Nel secondo caso, ci vengono in aiuto programmi informatici che valutano l’energia di
accoppiamento delle basi in funzione della loro natura (pirimidinica o purinica) e della temperatura
(http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ).
Vedi anche: http://www.bmr-genomics.it/bmr_it/programmi.html
ATTENZIONE! Nonostante queste analisi preliminari che permettono di scartare primers che
potrebbero dare problemi è assolutamente necessaria una valutazione sperimentale (Esperimento 3)!