Parametri NMR
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Parametri NMR Accoppiamento Scalare Mario Piccioli Magnetic Resonance Center CERM Department of Chemistry University of Florence, Italy Ringraziamenti Stefano Mammi Stefano Chimichi Alessandro Bagno Daniel Cicero Paola Turano M.Levitt Spin Dynamics J. Keeler Understanding NMR Spectroscopy H.Gunther NMR Spectroscopy Termini dell’Hamiltoniano di spin Meccanismi di accoppiamento La partecipazione degli elettroni cambia il modo in cui l’interazione tra spin é dipendente dalla loro riorientazione Pertanto, quando in un liquido isotropico le interazioni sono mediate per effetto del moto, rimane un termine isotropico. Esso fornisce una diretta evidenza spettrale dei legami chimici e pertanto é un prezioso strumento per la determinazione strutturale Gli effetti di accoppiameno dipolare indiretto sono SOLO INTRAMOLECOLARI L’effetto é misurabile sono per un limitato numero di legami chimici Significato fisico della J Significato fisico della J Accoppiamento scalare 13C 1H 13C 1H Accoppiamento scalare 13C 1H 13C 1H Accoppiamento scalare β β α 1H S α 13C I Accoppiamento scalare Accoppiamento scalare Due spin isolati E= -1/2 γ ħB0= - miνi mi = - ½ , ½ +1/2 νA +1/2 νX νX E νA νA +1/2 νA -1/2 νX -1/2 νA +1/2 νX νX -1/2 νA -1/2 νX E= -∑i miνi Due spin accoppiati E= -1/2 γ ħB0= - miνi Accoppiamento debole mi = - ½ , ½ J<<∆ν +1/2 νA +1/2 νX +1/4 JAX +1/2 νA +1/2 νX νX E νA νA νX+ ½ JAX +1/2 νA -1/2 νX νA- ½ JAX νA+ ½ JAX -1/2 νA +1/2 νX νX -1/2 νA -1/2 νX νX- ½ JAX +1/2 νA -1/2 νX -1/4 JAX -1/2 νA +1/2 νX -1/4 JAX -1/2 νA -1/2 νX +1/4 JAX E= -∑i miνi +∑ij Jijmimj Accoppiamento scalare CH3-CH2-OH Accoppiamento scalare 2J 3J 2JH H β β’ 3JH H α β 3JH H Ν α 3J Accoppiamento scalare 1J HC 1J 1J HN CC Molteplicità dell’accoppiamento n.Spin X Spin A osservato Freq. A osservate 0 νA 1 νA± ½ JAX 2 3 νA± ½ JAX ± ½ JAX νA± ½ JAX ± ½ JAX ± ½ JAX Molteplicità dell’accoppiamento Accoppiamento scalare Accoppiamento scalare Il segno della costante α β α β A X A X β α β α A X L’effetto del campo magnetico Sistemi del 1°ordine Accoppiamento debole J<<∆ν Separazione in frequenza almeno pari a 10*J Se aumento il campo magnetico, ∆ν aumenta e J rimane costante Aumentare il campo magnetico semplifica l’analisi dei sistemi di spin Torneremo dopo sul concetto di accoppiamento forte e accoppiamento debole Ma intanto ricorda che… Esperimenti in rotating frame (TOCSY, ROESY, DIPSI, sono sempre in accoppiamento forte) Gli esperimenti heteronucleari HSQC, HMQC, INEPT di ogni tipo…) sono sempre in accoppiamento debole Sistema AX Sistemi di spin A2X3 Combinando insieme accoppiamenti diversi Sistema AMX Sistema AMX Spettri del 2°ordine Accoppiamento forte significa che l’accoppiamento è forte rispetto alla differenze di energia dei livelli energetici del sistema, che determinano poi le frequenze di transizione In effetti un accoppiamento tra due spin non cambia di valore, è il resto del sistema che cambia nel passaggio da accoppiamento forte ad accoppiamento debole Spettri del 2°ordine ν1,2=ν νA ±J/2 ν3,4=ν νB ±J/2 ν1,2,3,4=(ν νA+ν νB)/2 ±D/2 ±J/2 Sistema AB J=5Hz Sistema AB Misure dirette JAB 2C (2C)2= (νΑ–νΒ)2 +J2 I2/I1=∆ν1,4/∆ν2,3 Sistema AB Sistema AB From AX2 to AB2 500 MHz From AX2 to AB2 200 MHz From AX2 to AB2 Sistema AB2 Sistema AB2 Sistema AB2 Sistema ABX Sistema ABX Accoppiamento forte e accoppiamento debole 2 spin Accoppiamento forte e accoppiamento debole Accoppiamento debole Accoppiamento debole Accoppiamento forte Accoppiamento forte Spin Magneticamente Equivalenti Singlet-triplet basis Multipletti e larghezza di riga La larghezza di riga di un segnale NMR dipende dalle proprietà di rilassamento T2. In prima approssimazione, il T2 dipende a sua volta dalle dimensione della molecola studiata. Piu’ la molecola è grande, piu’ il T2 è corto e piu’ i segnali sono larghi 3-10 Hz 15 Hz MW ca. 5000 In una proteina, la larghezza di riga di un Hn o di un Ha è tipicamente maggiore di 10 Hz, ovvero della separazione del doppietto. In queste condizioni, l’accoppiamento scalare non da luogo a doppietti osservabili 20-35 Hz MW. 10-20000 Importante N 3J dipendono dall’angolo diedro INFORMAZIONE STRUTTURALE IMPORTANTE 3J HNHα= Acos2φ + B cosφ φ +C Ogni costante di accoppiamento 3J sottende un angolo diedro 3J 1Hb-15N DeMarco, Llinas, Wutrich, Biopolymers, 1978 3J 1Ha-1Hb Angolo diedro χ1 Karimi Nejad, Schmidt, Ruterjans, Schwalbe, Grieseinger, Biochemistry, 1994 Per ogni curva di Karplus i coefficenti sono calcolati in base al confronto tra valori sperimentali e parametri strutturali e validati con vari strumenti Schmidt, Blumel, Lohr, Ruterjans, J. Biomol. NMR 1999 13C Direct Detected COCO-TOCSY N 3J C’C’ a. diedro φ Accoppiamento e Magnetizzazione Accoppiamento scalare rende possibile un trasferimento di magnetizzazione tra i spin accoppiati Questa proprietà é del tutto indipendente dal fatto che un accoppiamento sia “visibile” o “invisibile” in un esperimento NMR come Nella maggior parte dei casi gli accoppiamenti scalari sono invisibili, ma misurabili anche in modo quantitativo attraverso NMR multidimensionale Heteronuclear cases The scheme of 1J scalar couplings The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment 2D HETCOR Expriment 2D HETCOR Expriment Prima dimensione 2D HETCOR Expriment Prima dimensione 2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione 2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione Esempio HETCOR 2 3 4 1 5 1J couplings for backbone resonances The role of metal cofactor in protein unfolding Metal triggered protein folding Apo Cb @ 3.3 M GdmCl Ca2Cb @ 3.3 M GdmCl Ca2+ Loss of secondary structure elements: unfolded protein Refolding Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ion 15N 95 77 59 35 26 96 3 28 81 85 75 HNε 32 94 65 88 23 36 46 64 83 41 89 48 62 14 99 84 21 24 17 43 25 30 29 86 74 79 47 51 16 58 42 4 1110 76 98 39 22 53 91 69 97 56 93 101 4067 57 19 71 38 52 54 55 68 66 82 5 80 87 78 6 7 90 72 13 37 100 HNδ 28 15 45 8 12 20 60 33 34 27 HNε1 83 102 15H Ma il legame a idrogeno é una interazione elettrostatica? 3J NiC’j C O 3J N ! Eteronuclei 270-290Hz o C o 205Tl o 2J 205Tl-13C in Transferrina Fe3+ Aramini et al. Biochemistry 1994 Eteronuclei 199Hg Utschig, Bryson, O’Halloran, Science 1995
