dipartimento di tossicologia

DIPARTIMENTO DI TOSSICOLOGIA
SEZIONE DI ONCOLOGIA E PATOLOGIA MOLECOLARE
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI CAGLIARI
VIA G.T. PORCELL, 4 - 09124 CAGLIARI (ITALY)
Tel.070/6758346 – fax 070/666062
P.I. 00443370929
Ragione Sociale DIPARTIMENTO DI TOSSICOLOGIA, SEZIONE DI ONCOLOGIA E PATOLOGIA
MOLECOLARE
Indirizzo: VIA OSPEDALE 72
Telefono: 070-6758620 / 0706758345 Fax: 070 6758612 / 070 666062 E-mail: [email protected]
Rappresentante Legale: Giovanna Maria Ledda
Referente per il Programma: Giovanna Maria Ledda
Tipologia
XX
Università
Breve Presentazione del Soggetto Proponente Operante in Sardegna
La sezione di Oncologia e Patologia Molecolare del Dipartimento di Tossicologia, è il soggetto proponente.
La sezione consta di 2 prof.ordinari, 3 prof. associati, 4 ricercatori e 3 tecnici. Dispone di una superficie di
circa 600 m2 ed è equipaggiata di tutta la strumentazione occorrente per il programma proposto. Negli ultimi
3 anni, i docenti della Sezione sono stati e sono titolari di 3 diversi finanziamenti PRIN, 1 grant del National
Institutes of Health (USA), 2 grants da parte dell’Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, 2 finanziamenti
Regionali e diversi finanziamenti del Ministero della Ricerca ex-60% oltreché della Fondazione del Banco di
Sardegna. I docenti della Sezione di Oncologia e Patologia Molecolare fanno parte del Dottorato di Patologia
e Tossicologia Ambientale, sede di Cagliari, Dottorato di Ricerca in Patologia Molecolare e Cellulare, sede
di Perugia e Dottorato di Ricerca in Patologia Sperimentale, sede di Torino. L’attività di ricerca del
Dipartimento è documentata dall’elevato numero di lavori scientifici pubblicati sulle riviste più qualificate
dei relativi settori di appartenenza, caratterizzate da un elevato “Impact Factor” ed elevato numero di
citazioni.
Programma di Inserimento Lavorativo
Titolo: Analisi delle modificazioni dell’espressione genica durante la proliferazione cellulare.
Stato dell’arte: Il carcinoma epatocellulare occupa il 5° posto nella graduatoria dei tumori più frequenti, con
circa mezzo milione di morti all’anno. Mentre l’HCC è il primo cancro come incidenza in aree dell’Asia sudorientale e dell’Africa sub-Sahariana, l’incidenza in Europa è molto minore. Tuttavia, la sua incidenza negli
USA è raddoppiata negli ultimi 25 anni un ulteriore aumento è atteso nei prossimi decenni. Sebbene gli
agenti che causano la maggior parte degli HCC nell’uomo siano conosciuti (infezioni virali da HBV e HCV,
alcool, esposizione all’aflatossina, steatoepatiti non alcoliche), le alterazioni molecolari alla base dello
sviluppo del HCC sono poco conosciute. Recentemente, è stata dimostrata l’esistenza di sottoclassi di HCC
con pattern omogenei di espressione genica che correlano con aumentata sopravvivenza. Una simile
correlazione tra specifici patterns di espressione genica e miglior prognosi è stata riscontrata anche in studi
sperimentali sull’animale, indicando come, attraverso l’uso di appropriati modelli murini di tumori umani e
mediante genomica funzionale comparativa, si possa accelerare la scoperta di target rilevanti per lo screening
di potenziali agenti terapeutici.
Le scoperte sopra descritte sono state rese possibili dall’utilizzo della tecnologia dei microarray, che
consente l’analisi contemporanea fino a 36.000 geni. La tecnologia dei microarray è una tecnologia molto
promettente ed innovativa che consente, infatti, numerose applicazioni in diversi campi, da quello
propriamente di ricerca a quello della diagnostica. Lo studio delle differenti risposte individuali, infatti, è
ritenuto un fattore importante nel determinare il comportamento individuale verso composti tossici e/o
farmaci. Lo studio dei profili di espressione genica tra tessuti tumorali e tessuti normali é, inoltre,
estremamente promettente nella possibile identificazione dei geni responsabili della trasformazione
neoplastica. Uno degli aspetti più importanti in questo contesto, è rappresentato dalla conoscenza dei
meccanismi molecolari che sottendono l’entrata in ciclo di cellule normalmente quiescenti; questo, non solo
per una migliore comprensione del ciclo cellulare in cellule normali, ma anche per capire quali geni siano
disregolati nelle cellule preneoplastiche e/o neoplastiche.
Obiettivi: Allo scopo di determinare i geni up o down-regolati in seguito all’applicazione di stimoli
proliferativi di diversa natura: la rigenerazione compensatoria successiva a resezione parziale chirurgica
(PH) e l’iperplasia diretta indotta dalla somministrazione di un mitogeno diretto, e cioè il ligando del
recettore nucleare CAR (Costitutive Androstane Receptor), abbiamo utilizzato la tecnologia dei microarray,
in modelli sperimentali di proliferazione, Questo studio che ha impiegato un chip contenente sequenze in
grado di identificare circa 9.000 geni diversi, ha permesso di identificare un set di geni trascrizionalmente
regolati 1 e 3 ore dopo l’applicazione degli stimoli proliferativi. Tra i geni modificati, abbiamo identificato
un set di geni regolati in maniera simile in entrambi i modelli proliferativi, tale da far pensare che questo set
di geni rappresenti quello veramente critico per l’entrata in ciclo. Più recentemente, questi studi sono stati
ripetuti con un chip contenente sequenze in grado di identificare circa 32.000 geni (Long Oligo microarrays
32K) cioè, quasi l’intero genoma. Il numero di geni rivelati è stato di circa 20.000-25.000, mentre quello di
geni up-regolati con un ratio >2 era di circa 150 a 1 ora, 400 a 3 ore e quasi 800 alle 6 ore. Il numero di geni
down-regolati era invece di 40, 150 e 160 a 1, 3 e 6 ore. L’obiettivo principale di questo progetto è ora,
quello di procedere alla elaborazione dei dati ed alla collocazione in clusters dei geni modificati, affinché si
possano determinare pathways proliferative, non necessariamente già identificate. Questo punto riveste una
importanza cruciale nell’individuazione di possibili alterazioni del processo che sono correlate allo sviluppo
di numerose patologie ( es. tumori). Inoltre, il materiale biologico già acquisito, più futuri esperimenti
indirizzati a seguire le modificazioni geniche a tempi successivi, dovrebbero consentire di individuare
specifici profili di attivazione e/o inattivazione genica.
Attività previste e piano di lavoro: L’esame delle modificazioni dell’espressione genica verrà effettuato
utilizzando chips forniti da almeno due diverse compagnie. Ogni preparato biologico, verrà ibridizzato con
un array, dando in tal modo un risultato che proviene dall’esame di 3-5 campioni singoli e non una media di
risposte. Questo approccio permette anche di discriminare fra risposte omogenee (e quindi di importante
significato biologico) da quelle accidentali, di scarsa rilevanza, che in un esame che non preveda l’uso di
campioni singoli potrebbero generare problemi. Nel caso di risposte fluttuanti, il numero di
arrays analizzati verrà aumentato fino alla individuazione di una specifica risposta. I dati provenienti
dall’analisi dei microarrays verranno validati mediante utilizzo delle tecniche di northern blot o PCR.
Inoltre, allo scopo di caratterizzare ulteriormente le pathways di trasduzione del segnale associate alla
proliferazione epatocitaria in topi normali, il ruolo di specifici geni e la modificazione del pattern di
espressione di geni normalmente associati alla risposta proliferativa verranno analizzati, sempre mediante la
tecnologia dei microarray in modelli di topi knockout.
Un altro aspetto del programma che dovrà essere di cui il beneficiario del voucher dovrà occuparsi, riguarda
lo studio degli eventi molecolari e genetici responsabili del fenotipo di cellule epatiche preneoplastiche e
neoplastiche sia nell’animale sperimentale che nell’uomo. Poiché gli eventi molecolari responsabili dello
sviluppo di carcinomi epatici sono ancora sconosciuti, e, a causa dell’inefficacia degli attuali approcci
terapeutici, a tutt’oggi solo due strategie appaiono promettenti nel limitare l’incidenza di carcinoma
epatocellulare (HCC); 1) il miglioramento delle conoscenze della storia naturale del tumore, attraverso una
diagnosi precoce, e 2) lo sviluppo di strategie preventive basate sull’uso di sostanze capaci di inibire, o
almeno rallentare la crescita di lesioni preneoplastiche. Recentemente, presso il nostro Dipartimento, è stato
osservato che una breve esposizione all’ormone tiroideo (T3), induce la regressione del 70% delle lesioni
preneoplastiche epatiche ed esercita un effetto inibitorio sullo sviluppo di HCC nei ratti. Il fatto che la
regressione delle lesioni preneoplastiche avvenga nonostante l’ormone tiroideo sia capace di stimolare la
proliferazione degli epatociti può essere spiegata come conseguenza del fatto che lo stimolo proliferativo
causato dal trattamento con l’ormone tiroideo è associato a segnali che conducono al differenziamento degli
epatociti preneoplastici e, quindi, ad un loro ritorno allo stadio di cellule fenotipicamente normali.
E’, dunque, determinante stabilire il pattern di espressione genica successiva al trattamento con T3, allo
scopo di identificare i geni responsabili della rapida regressione dei noduli preneoplastici e la successiva
riduzione dell’incidenza di HCC. Il progetto di cui si occuperà il beneficiario del voucher è per l’appunto
mirato a identificare i geni responsabili della regressione di lesioni preneoplastiche osservata dopo
trattamento con ormone tiroideo, allo scopo di verificare se, anche nell’uomo sia possibile modificare il
destino di cellule geneticamente alterate e, dunque, potenzialmente in grado di evolvere a neoplasia maligna,
nel senso di una re-differenziazione verso un fenotipo normale.
Risultati attesi: In conclusione, risultati di questo progetto potrebbero portare all’identificazione di geni le
cui funzioni non siano state precedentemente correlate a processi proliferativi e/o di differenziamento, e di
conseguenza, anche all’acquisizione di conoscenze di base indispensabili per lo sviluppo di farmaci mirati a
specifici target nell’intervento terapeutico antineoplastico.
Numero di borse per piano:1
Obiettivi Formativi e Professionali:
Il candidato alla fine del periodo previsto acquisirà competenze specifiche nell’analisi bioinformatica dei dati
ottenuti con l’impiego dei microarray, nonché nel loro utilizzo a scopo diagnostico per varie patologie
incluse quelle tumorali. Tali competenze potrebbero consentirgli un inserimento lavorativo all’interno della
stessa struttura proponente o in altre strutture di ricerca interessate all’utilizzo di questa nuova tecnologia.
Piano analitico delle attività formative
Il nostro programma di inserimento lavorativo richiede l’attivazione di una borsa di rientro per 24 mesi. Il
candidato si occuperà della preparazione dei campioni previsti nel programma di lavoro, l’estrazione del
materiale da analizzare e la successiva ibridizzazione con i Microarray, nonché della successiva analisi dei
risultati ottenuti tramite utilizzo di programmi informatici necessari per l’elaborazione dei dati e
l’organizzazione dei geni modificati in clusters. Il candidato dovrà, inoltre, utilizzare altre tecniche di
biologia molecolare, quali Northern Blot e la Real-Time PCR, allo scopo di validare i risultati dei
microarray. Per l’utilizzo delle diverse tecniche il candidato sarà affiancato da personale esperto già presente
nel nostro laboratorio e tali collaborazioni porteranno alla costituzione di un gruppo specializzato nello
studio dei profili genici geni associati al ciclo cellulare e ai processi di differenziamento cellulare
Requisiti professionali di entrata obbligatori a cui non viene attribuita nessuna valutazione: Il
candidato dovrà possedere esperienze lavorative in un laboratorio di biologia molecolare per un periodo
minimo di sei mesi.
Elementi valutabili dall’Organismo Proponente sotto forma di griglia:
Laurea in Chimica e tecnologie farmaceutiche
Laurea in Farmacia
Laurea in Medicina
Altre Lauree
Ottima conoscenza della metodica del Microarray
Punteggio
10
5
5
0
7
Conoscenza del software GenePix
8
Conoscenza della lingua inglese
5
Colloquio
10
Piano di Valorizzazione Personale del Beneficiario: Come precedentemente illustrato lo scopo del nostro
progetto è di creare le basi per studi futuri di tipo funzionale comparativo con vari modelli proliferativi, allo
scopo di individuare i geni direttamente implicati nella proliferazione epatocitaria, nonché quelli coinvolti
nella regressione di lesioni preneoplastiche, e, presumibilmente, nei processi di differenziazione. Questo
piano di lavoro rappresenta, quindi, solo una piccola parte di un più ampio progetto di cui non è possibile
stabilire la durata.
Durata del Piano di Inserimento Lavorativo (mesi): 24