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Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998
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ATTUALITÀ E PROSPETTIVE NELLA DIAGNOSI
DELLE MALATTIE INFETTIVE AVIARIE
GIAMPAOLO ASDRUBALI, MARIA PIA FRANCIOSINI
Università degli Studi di Perugia
Istituto di Igiene Veterinaria e Patologia Aviare, Facoltà di Medicina Veterinaria
Viene descritto l’impiego delle sonde molecolari e delle loro applicazioni quali la Southern e la Northern blotting, la dot blot
e il DNA fingerprinting. Inoltre particolare attenzione viene posta alla PCR (polymerase chain reaction), che ha permesso di
abbreviare i tempi di diagnosi di alcune malattie importanti anche ai fini della salute pubblica, come ad esempio la clamidiosi.
A paragone con le tradizionali metodiche virologiche e sierologiche le procedure a carattere biotecnologico mostrano un alto
grado di sensibilità e specificità e vaste possibilità di applicazione. Possono, inoltre, costituire un importante strumento nella
comprensione dei meccanismi patogenetici di alcune malattie. Si auspica, pertanto, un loro sempre più esteso impiego nella
diagnostica di campo delle principali patologie dei volatili.
Summary
The diagnostic use of the nucleic acid probe and their applications such as Southern and Northern and dot blotting, and
DNA fingerprinting were reviewed. Particularly the PCR was taken into consideration, since it has permitted to shorten the diagnosis time of several avian diseases, such as chlamidiosis, important for the public health too. Compared with conventional
virological and serological techniques, the molecular genetic techniques are exquisitely sensitive, extremely specific, and very
versatile. They are important tools in understanding the pathogenesis of avian diseases, and they will be used increasingly to
adress avian disease problems.
Il settore avicolo è quello che più di altri ha subito negli
ultimi tempi enormi progressi. Ciò è dimostrato dal fatto
che di anno in anno migliorano in modo significativo le
performances sia nel settore carne che in quello delle
uova, come risultato delle conoscenze sempre più
approfondite nel campo della genetica, della alimentazione, delle tecnologie di allevamento e delle patologie.
Nel nostro Paese l’avicoltura è ormai fortemente integrata, comportando impegni gestionali sempre maggiori,
anche perché con l’allevamento intensivo sorgono notevoli
problemi sia dal punto di vista commerciale che sanitario,
visto l’alto numero di capi prodotti. Come medici veterinari siamo ovviamente più interessati al secondo aspetto,
che spesso si presenta complesso per la comparsa di patologie non sempre facilmente individuabili, perché polifattoriali. L’esperienza professionale, come è intuibile, talvolta è sufficiente da sola a risolvere il problema, ma sono più
frequenti i casi in cui si deve far ricorso al laboratorio dal
quale ci si aspetta una diagnosi rapida e precisa.
I notevoli progressi ottenuti in tanti settori della scienza
hanno comportato anche nel campo della diagnostica successi significativi.
Con l’avvento delle biotecnologie sono state messe a
punto procedure moderne e sofisticate ad alta specificità e
sensibilità, che si stanno affiancando a quelle tradizionali e
che troveranno sempre più largo impiego in un prossimo
futuro.
A proposito di ciò va citato l’uso delle sonde molecolari
con le sue più conosciute applicazioni, quali la Southern e
Northern blotting, la dot blot e il DNA fingerprinting,
nonché l’uso sempre più crescente della PCR (polymerase
chain reaction), la quale ultima, in particolare, ha consentito di accelerare nella maggior parte dei casi i tempi di
diagnosi.
Queste tecniche hanno già trovato impiego in campo
avicolo da oltre 10 anni; nel 1989, infatti, si è svolto presso
l’Università dello Stato del Mississipi un interessante
workshop al fine di indirizzare la diagnostica delle patologie dei volatili verso alcune tecniche innovative nell’ambito della biologia molecolare. In quella sede Nagaraya rife-
SPECIE MINORI
Riassunto
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Attualità e prospettive nella diagnosi delle malattie infettive aviarie
riva circa la possibilità di differenziare tramite l’uso del
DNA fingerprinting i ceppi di campo di Pasteurella multocida da quelli vaccinali, quando questi non potevano essere distinti da un punto di vista biochimico-morfologico o
tramite l’antigene capsulare. Inoltre sempre lo stesso
Autore faceva ricorso alla stessa metodica per la tipizzazione di Salmonella enteritidis.
Sempre nel corso di tale meeting Schat riferiva circa
l’applicazione della dot blot per il riconoscimento anche
di un esiguo numero di cellule infettate con il virus della
malattia di Marek ed inoltre per la distinzione dei ceppi
vaccinali di Mycoplasma gallisepticum da quelli patogeni.
Da allora numerosi sono stati gli impieghi di questa
metodica per la diagnosi delle malattie dei volatili. Merita
di essere menzionato un recente lavoro condotto da
Fatumby et al.4 in cui viene descritto l’uso di una dot blot
per la diagnosi di un’infezione mista di laringotracheite
infettiva (LTI) associata a diftero vaiolo, riscontrata in galline ovaiole. Va sottolineato che il ricorso a tale metodica
viene giustificato nei casi di LTI atipica o in quelli in cui
l’isolamento del virus in questione appare difficoltoso.
Inoltre va segnalato il fatto che i corpi inclusi da virus
erpetico scompaiono dopo i primi giorni, in relazione alle
lesioni provocate dall’agente eziologico, rendendo problematica la diagnosi quando si fa ricorso alla tecnica istopatologica.
L’uso della tecnica dot blot è stato, inoltre, riportato da
Nagano et al.10 per la differenziazione dei vari stipiti virali
di campo della bronchite infettiva da quelli vaccinali.
In questo ambito va infine ricordata l’ibridazione in situ
degli acidi nucleici; in tale procedura il genoma virale
viene direttamente evidenziato su cellule e tessuti prelevati
dall’animale infetto, utilizzando sonde molecolari a DNA
o a RNA, marcate con sostanze radioattive o non (biotina,
digossigenina, sostanze chemioluminescenti e fluorocromi). Questa metodica può essere applicata a sezioni di tessuto fissato e incluso in paraffina. In tale maniera è possibile effettuare queste reazioni sul materiale bioptico o
citologico di routine e compiere studi anche di tipo retrospettivo.
Il suo impiego è stato valutato per diverse malattie infettive, tra cui la malattia di Gumboro, in quanto costituisce
un ottimo metodo per lo screening di numerosi campioni
tissutali di campo5. Inoltre Nielsen et al.12 lo riportano per
l’evidenziazione del virus dell’anemia infettiva (CAV) in
sezioni di timo di soggetti con la malattia dell’ala blu o con
l’atrofia a carico dello stesso organo. L’ibridazione è visualizzata con un coniugato contenente fosfatasi alcalina,
legato al complesso streptavidina-biotina. Theil et al. 16
descrivono l’applicazione di questa tecnica alla diagnosi di
Chlamydia psittaci paragonandola per sensibilità e specificità al test di immunoperossidasi.
Come accennato precedentemente la PCR ha spesso
affiancato e in alcuni casi sostituito le sopracitate procedure per la sua specificità e sensibilità, dal momento che
l’amplificazione di un tratto di DNA bersaglio permette di
rilevare anche modeste quantità di DNA presenti in un
campione (Fig. 1).
Innumerevoli ed interessanti sono i lavori che illustrano
le applicazioni della PCR in campo avicolo.
Purchase, sempre nel 1989, riportava l’impiego della
PCR per l’identificazione della sequenza dell’antigene
DNA da amplificare
(ad es. un esone polimorfico di un gene MHC)
Il DNA viene denaturato in singoli filamenti
Oligonucleotidi specifici che funzionano da
primer si riassociano alle due estremità
del DNA bersaglio
La DNA polimerasi allunga i primer e riforma
un DNA a doppio filamento
Il DNA viene denaturato in singoli filamenti
Oligonucleotidi specifici che funzionano da
primer si riassociano alle due estremità
del DNA bersaglio
La DNA polimerasi allunga i primer e riforma
un DNA a doppio filamento
Cicli multipli di denaturazione, riassociazione
ed allungamento producono copie multiple
del DNA bersaglio
FIGURA 1 - Reazione a catena della polimerasi per l’amplificazione di specifiche sequenze di DNA. (Da Janeway & Travers, Piccin Editrice, 1996).
emoagglutinante del virus influenzale, spesso indicativo
della virulenza dello stipite in causa, in associazione alla
Southern blotting.
Davidson et al.2 riportano l’uso della PCR nella diagnosi
differenziale tra la malattia di Marek (MDV) e la reticoloendoteliosi (REV), Come è noto, le lesioni anatomopatologiche sono spesso indistinguibili ed usualmente la diagnosi si basa sull’isolamento del virus e la sua successiva
identificazione tramite l’uso di anticorpi fluorescenti.
L’intera procedura, pur essendo sensibile, richiede parecchio tempo; nel tentativo, quindi, di accelerare i tempi di
diagnosi è stata applicata simultaneamente la PCR sia per
l’identificazione del DNA di MDV che del provirus del
REV. Ciò non va sottovalutato dal momento che, nell’eventualità di un’infezione mista, che talvolta può verificarsi nel pollo13, le sequenze geniche di REV possono integrarsi con il genoma di MDV, come osservato in vitro7 e
influenzare la crescita e il grado di oncogenicità di MDV.
Un recente lavoro di Cavanagh et al.1 riporta l’impiego
della PCR nella diagnostica di malattie aviarie, causate da
virus a RNA, le quali richiedono l’uso di una trascrittasi
inversa (RT), per la produzione di un DNA complementare. L’applicazione di RT-PCR risulta utile per l’identificazione degli stipiti virali della bronchite infettiva (IBV) e di
quelli della malattia di Newcastle (NDV). In questo ultimo
caso va sottolineato che tale metodica, rispetto alla valutazione del test di patogenicità intracerebrale potrebbe evidenziare in tempi molto più brevi la presenza di stipiti
altamente virulenti. Molteplici sono, inoltre, i lavori che
riferiscono della applicazione della PCR alla diagnosi delle
micoplasmosi nelle varie specie aviarie11,8, con l’uso sempre più esteso di appositi kit commerciali. Kleven et al.
(1997) auspicano anche l’utilizzo di una nuova e sensibile
PCR, chiamata DNA-RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) o AP-PCR (arbitrarily primed PCR), per
una rapida tipizzazione nel caso di microrganismi strettamente correlati tra di loro, in quanto questa consente di
individuare anche le minime variazioni del genoma. Fan et
al.3 riportano l’uso contemporaneo di tre primer per rivelare le differenze genomiche tra 25 stipiti di Mycoplasma
gallisepticum.
La PCR risulta, inoltre, di valido aiuto nel riconoscimento di alcune infezioni che rivestono importanza anche
FIGURA 2 - Test d’immunoperossidasi per la Malattia di Gumboro.
Evidenziazione dell’antigene nella borsa di Fabrizio.
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per la sanità pubblica, come ad esempio le Clamidiosi.
Hewinson et al. (1997) riportano l’uso della PCR per l’identificazione di Chlamydia psittaci presente nelle feci di
persone viventi a stretto contatto con uccelli da voliera.
Gli autori ne sottolineano i vantaggi rispetto all’isolamento
in colture cellulari che, pur rappresentando un sicuro
mezzo diagnostico, richiede tempi assai lunghi. Va ricordato anche l’uso di questa tecnica per la determinazione di
Campylobacter spp. dai tamponi cloacali di pollo.15
Tali esempi mostrano solo in parte le possibili applicazioni della PCR, in quanto ormai è senz’altro più semplice
affermare che questa procedura si è ormai estesa a tutta la
diagnostica delle più importanti malattie infettive.
Dopo aver spaziato nell’affascinante mondo della biologia molecolare, per concludere questo breve excursus sui
più recenti strumenti di diagnosi impiegati in campo avicolo, va ribadito il ruolo che hanno avuto e che continuano ad avere alcune metodiche tradizionali; in particolare,
la microscopia elettronica, l’immunofluorescenza, il test di
immunoperossidasi (Fig. 2) ed in ultimo, non in ordine
d’importanza, quello ELISA, alle quali l’applicazione degli
anticorpi monoclonali ha contribuito a conferire un maggiore grado di specificità e sensibilità.
Anche in tal caso sono numerosi i dati bibliografici
relativi ai possibili impieghi di queste procedure in ambito diagnostico. Per i risvolti pratici che può rivestire è da
citare un recente lavoro di Ignjatovich e Ashton 6, che
riporta l’utilizzazione di un ELISA sandwich con anticorpi monoclonali per la rapida identificazione e differenziazione di vari stipiti di IBV a partire da episodi di campo.
Oltre alla PCR quindi anche questa tecnica può sostituire
vantaggiosamente il test di sieroneutralizzazione nella
caratterizzazione antigenica del virus della bronchite
infettiva. Kodihalli et al. 9 hanno impiegato una DAS
ELISA (ELISA sandwich a doppio strato anticorpi) per
l’identificazione della nucleoproteina tipo specifica del
virus influenzale presente nella secrezione nasale di tacchini infettati sperimentalmente. Questo test potrebbe
essere considerato una vantaggiosa via alternativa all’isolamento del virus per la sua possibile applicazione su
larga scala.
Un cenno, infine, spetta alla diagnosi sierologica, sebbene, talvolta, la ricerca di anticorpi a questo scopo possa
presentare degli inconvenienti; la necessità, ad esempio, di
ricorrere a due prelievi distanziati nel tempo per evidenziare l’esistenza di una sieroconversione significativa, che
può contrastare con la necessità di effettuare una rapida
diagnosi.
Inoltre l’applicazione di programmi vaccinali su larga
scala comporta l’insorgenza di un’immunità attiva, la quale
maschera spesso la presenza di eventuali stati d’infezione,
creando difficoltà sul piano diagnostico. Con ciò, comunque, non si vuole negare alla diagnosi sierologica un certo
valore soprattutto se ci si riferisce all’insostituibile contributo che fornisce alla ricerca epidemiologica.
Per concludere, le biotecnologie innovative di cui si è
parlato applicate allo studio delle malattie dei volatili stanno ormai superando lo stadio sperimentale per diventare
uno strumento diagnostico vero e proprio.
È auspicabile, pertanto, che nel nostro Paese possano
sorgere un numero significativo di laboratori diagnostici
specializzati in biologia molecolare attrezzati per ricerche
SPECIE MINORI
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Attualità e prospettive nella diagnosi delle malattie infettive aviarie
che riguardino la individuazione degli agenti eziologici
delle malattie delle diverse specie animali.
A tutt’oggi, infatti, una diagnostica precisa delle malattie dei volatili è difficile da realizzarsi in numerose parti
d’Italia. In ogni caso non dovrà mai essere dimenticata,
almeno per gli anni prossimi, la diagnostica tradizionale
che rimane assieme all’esperienza professionale del veterinario strumento di supporto indispensabile.
3.
Ringraziamenti
7.
Si ringrazia il Dott. Leonardo Leonardi dell’Istituto di
Patologia Generale e Anatomia Patologica Veterinaria di
Perugia per la collaborazione prestata.
8.
4.
5.
6.
9.
Parole chiave
10.
Biotecnologia, sonde molecolari, PCR.
11.
Key words
Biotechnology, acid nucleic probes, PCR.
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13.
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