allegato

Large Animals Review, Anno 10, n. 6, Dicembre 2004
27
ABDELWAHID SAEED ALI1, MOHD-AZMI MOHD LILA2,
ARIANNA NEGRIN3, MASSIMO CASTAGNARO3
1
Dipartimento di Medicina Preventiva, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Khartoum, Khartoum North, P.O. Box 32, Sudan
2
Facoltà di Medicina Veterinaria, Università Putra Malaysia, 43400UPM, Serdang - Selangor DE, Malaysia
3
Dipartimento di Sanità Pubblica, Patologia Comparata ed Igiene Veterinaria - Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Padova AGRIPOLIS - 35020 Legnaro, Padova
Riassunto
Lo scopo di questo lavoro è quello di determinare l’effetto della via di inoculazione e della preparazione dell’antigene sull’immunogenicità di un clone a placca-purificato del virus responsabile della Pseudorabbia (PrV), precedentemente confermato come non patogeno, mAlp. Virus vivi e spenti sono stati inoculati per via intranasale (i.n.) e intramuscolare (i.m). Sono stati considerati i seguenti fattori: le risposte dell’anticorpo neutralizzante (N-Ab) al virus, la distribuzione del virus e la protezione che
segue all’insulto virulento. Generalmente, i porcellini stimolano livelli di N-Ab più alti quando il PrV-mAlp viene inoculato come
vivo piuttosto che come spento e attraverso la via intramuscolare piuttosto che la via intranasale. Differenze non significative
(p<0.05) nei titoli del N-Ab sono state osservate in tutti i gruppi di animali, ma sono significative (p<0.05) rispetto al gruppo dei
porcellini di controllo (non immunizzati). Successivamente all’insulto dei porcellini immunizzati con il virus virulento, sono stati
correlati sia la durata della distribuzione del virus sia i livelli di protezione ottenuti alle risposte anticorpali (N-Ab).
Una protezione totale è stata osservata in tutti gli animali immunizzati con virus vivo inoculato per via intramuscolare. Un titolo medio di anticorpi di 4.760 è richiesto per ottenere una protezione totale contro i virus virulenti. Come conclusione e raccomandazione, è consigliato di immunizzare i porcellini contro l’infezione da PrV con 1x106 unità formante placca (p.f.u.) ad animale, con PrV-mA1p inoculato per via intramuscolare.
Summary
The effect of route of inoculation and antigen preparation on the immunogenicity of a previously confirmed non-pathogenic,
plaque-purified clone of pseudorabies virus (PrV), termed mA1p, was determined in the present study. Live and killed virus were given via intranasal (i.n.) and intramuscular routes. The neutralizing antibody (N-Ab) responses to the virus, shedding of the
virus and protection following virulent challenge were considered. Generally, piglets stimulated higher N-Ab levels to PrV-mA1p
when inoculated as live virus as compared to killed and via i.m. compared to i.n. route of inoculation. Non-significant (p<0.05)
differences in the N-Abs titres were observed among all groups of animals but significant (p<0.05) in comparison to the control (non-immunized) group of piglets. Following challenge of immunized piglets with the virulent virus, both duration of virus
shedding and protection levels obtained were correlated with the N-Ab responses elicited. Total protection was observed
among animals immunized with the live virus via i.m. route. An average of 4.760 as N-Ab titre is required to obtain total protection against virulent virus hit. As a conclusion and recommendation, it is advised to immunize piglets against PrV infection with
1x 106 plaque forming unit (p.f.u.) per piglet of live PrV-mA1p via i.m. route.
INTRODUZIONE
Il virus della Pseudorabbia (PrV), anche noto come virus della Sindrome di Aujeszky (ADV), classificato come
alphaherpesvirus11, è causa dell’infezione neurotropica fatale nei porcellini23. Il virus è anche responsabile di una
sindrome respiratoria e del ritardo nella crescita e dei problemi riproduttivi nei porcellini da riproduzione14. Programmi di vaccinazioni adeguati10, 16, 26, associati a necessarie misure di sicurezza22, sono stati testati durante l’inizio
dell’infezione, mezzi essenziali per controllare ed eradicare
la malattia in molte parti del mondo. Sono stati introdotti
SUINI
EFFETTO DELLA VIA DI INOCULAZIONE E
DELLA PREPARAZIONE DELL’ANTIGENE
SULL’IMMUNOGENICITÀ DEL CLONE VIRALE
APATOGENO DELLA PSEUDORABBIA
28
Effetto della via di inoculazione e della praparazione dell’antigene sull’immunogenicità del clone virale apatogeno della pseudorabbia
sia vaccini vivi8, 27 sia attenuati15,28. È stato testato il grado
di protezione offerto da questi vaccini in modo da correlarlo ai livelli di anticorpi neutralizzanti6, 17. Sebbene alcuni
di questi vaccini abbiamo offerto alti livelli di protezione,
si sono dimostrati inefficaci per prevenire la replicazione e
la distribuzione del virus virulento24,30. Il clone a placcapurificato del PrV (mAlp) è stato precedentemente confermato come non patogeno ed immunogeno contro l’insulto virulento nel topo e nel maiale1,3. Lo scopo di tale
studio è quello di determinare l’effetto della via di inoculazione e della preparazione dell’antigene sul potere immunogeno di questo clone virale nel maiale.
MATERIALI E METODI
Virus: nel nostro studio sono stati utilizzati il virus a placca-purificato di PrV, chiamato mAlp, ed il virus virulento,
chiamato CD. Il primo è stato creato e fornito gentilmente
dal Prof. Mohd Azmi (UPM, Malaysia) ed utilizzato per immunizzare i porcellini. Il secondo, invece, è un virus americano ad elevata virulenza1, gentilmente fornito dal Prof.
Anthony Castro dell’Università della California-Davis
(USA) ed utilizzato per l’insulto negli animali immunizzati.
Porcellini: un gruppo di quaranta porcellini di età compresa tra 3 e 4 settimane, nati da madri non vaccinate per
il PrV. Questi animali furono divisi in cinque gruppi e tenuti in ambienti separati (ciascun gruppo in stanze diverse), presso la Facoltà di Medicina Veterinaria, Università
di Putra, Malaysia (UPM).
Preparazione e purificazione del virus: i virus utilizzati
nello studio sono stati fatti replicare in culture cellulari Vero
cresciute nel mezzo di Libovitz (L-15), integrate con 5% di
siero fetale bovino (FBS), 1% di antibiotico-antimicotico ed
1% dell’agente anti-PPLO. Successivamente i virus sono stati purificati utilizzando la microcentrifugazione a gradiente
di saccarosio come descritto da Ben-Porat et al. (1974).
Inattivazione del virus: il virus è stato inattivato esponendo la sospensione alla luce UV per almeno 30 minuti.
L’infettività del virus è stata confermata dall’inoculazione
della sospensione nelle culture di cellule Vero.
Test di neutralizzazione del siero (SNT): sono state allestite ventiquattro piastre a pozzetto di colture cellulari
contenenti monostrati confluenti di cellule Vero. I sieri da
testare sono stati inattivati a 56°C per 30 minuti. Le diluizioni seriali in doppio sono state effettuate nel mezzo L-15
(supplementare con 2% di FCS inattivato con il calore e
contenente 1% di soluzione antibiotica-antimicotica e l’agente anti-PPLO). Le aliquote di ciascun singolo siero sono state mescolate con un pari volume di sospensione contenente il PrV-mAlp vivo (contenente 100 p.f.u./100 ml).
Sieri pre-immuni sono stati aggiunti al test come controlli.
Per la neutralizzazione del virus, le miscele sono state incubate a 37°C per 45 minuti, tenendole continuamente
mescolate. Aliquote da 100 ml furono aggiunte a ciascuna
delle ventiquattro piastre a pozzetto contenenti il monostato cellulare confluente di cellule Vero in quadruplicato.
Quattro pozzetti di una colonna sono stati inoculati sola-
mente con il virus (controllo positivo), altre quattro sono
state inoculate con il virus mescolato con il siero di controllo (controllo negativo). Successivamente, le piastre sono state incubate a 37°C a 5% di CO2 per 45 minuti, in
modo da permettere l’adsorbimento del virus. Sono stati
aggiunti, poi, 500 ml del mezzo L-15 contenente 1,2% di
carbossi-metil-cellulosa (CMC) e 2% di FCS. Le piastre
sono state incubate per 2-3 giorni fino alla formazione delle placche. Le piastre sono state fissate in metanolo, colorate con la soluzione cristal-violetto e successivamente si è
passati alla determinazione del numero di placche formatasi per ciascuna diluizione. Il titolo anticorpale neutralizzante è stato determinato diagrammando la diluizione del
siero con il numero di placche e, in accordo con Bisch
(1978), da tale grafico è stata, successivamente, calcolata la
diluizione di siero (log2) necessaria per una riduzione del
50% delle placche dei pozzetti di controllo.
Rilevazione del virus nelle narici dei porcellini: ad un
intervallo di due giorni, sono stati raccolti tamponi nasali
successivamente all’insulto dei porcellini immunizzati in 1
ml di mezzo L-15 ghiacciato, contenente 8% di soluzione
antibiotica-antimicotica e 2% di agente anti-PPLO in una
fiala da 10 ml. Questi tamponi sono stati immersi completamente nel mezzo e le soluzioni sono state, successivamente, trasferite in una provetta eppendorf e centrifugate
a 3000 rpm per 10 minuti a 4 °C in una centrifuga refrigerata, in modo da rimuovere i detriti associati al campione.
I surnatanti sono stati poi prelevati e posti alla temperatura di -70°C prima di venir testati per il virus attraverso l’analisi delle placche. L’analisi delle placche per la rilevazione del virus è stata condotta come descritto da Ali1.
Esperimento: quaranta porcellini di 3-4 settimane di vita sono stati suddivisi in 4 gruppi (8 animali per gruppo).
Il primo, il secondo, il terzo ed il quarto gruppo di porcellini sono stati inoculati con il PrV- mAlp come segue: vivo
(i.m), vivo (i.n.), spento (i.m), spento (i.n.) considerando
che i porcellini del quinto gruppo sono stati inoculati con
il mezzo L-15 come controllo. La dose inoculata è stata 1x
106 unità formanti placca (p.f.u.). Si è prelevato il sangue
per poter valutare gli anticorpi neutralizzanti. Dopo 17
giorni dalla prima inoculazione, i porcellini di ciascun
gruppo sono stati posti a contatto con una quantità di 108
per animale di PrV-CD i.n. Successivamente si sono raccolti campioni di sangue e tamponi nasali in modo da poter osservare il livello di protezione. I tassi di protezione
sono stati calcolati in accordo con la percentuale di sopravvissuti sul totale dei porcellini testati.
Analisi statistica: l’importanza delle differenze riscontrate nei livelli di anticorpi neutralizzanti derivanti dai due
gruppi di animali è stata valutata utilizzando il t-test indipendente.
RISULTATI
Le risposte degli anticorpi neutralizzanti (N-Ab) contro
il virus RpV-mAlp rilevate utilizzando diverse vie di somministrazione e la preparazione dell’antigene sono mostrate in Tabella 1.
Large Animals Review, Anno 10, n. 6, Dicembre 2004
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Tabella 1
Risposte anticorpali neutralizzanti in seguito ad immunizzazione di porcellini con differenti vie di somministrazione
e preparazione dell’antigene del PrV-mA1p
Preparazione dell’antigene e via di immunizzazione
Vivo (i.n.)
Vivo (i.m.)
Spento (i.n.)
Spento (i.m.)
Controllo
0
7
17
1.489±0.078*
4.044±0.088
4.427±0.129
1.641±0.083
4.375±0.105
4.760±0.089
0.544±0.068
2.925±0.114
3.224±0.112
1.592±0.134
3.917±0.166
4.375±0.105
1.658±0.087
1.211±0.116
0.856±0.097
20
25
31
4.247±0.131
4.923±0.094
5.200±0.061
4.362±0.116
5.208±0.066
5.454±0.132
2.218±0.105
4.454±0.132
3.670±0.095
4.206±0.114
5.034±0.068
5.261±0.074
1.686±0.092
3.643±0.094
3.955±0.126
* log2 (diluizione sierica necessaria per la riduzione del 50% delle placche) ±s.d.
Porcellini sono stati immunizzati con 1x 106 p.f.u. per animale di PrV-mA1p e poi messi a contatto con 5x 106 p.f.u. ad animale di PrV-CD, p.i. = post-immunizzazione.
Tabella 2
Rilevazione del virus in seguito all’insulto di porcellini immunizzati con il virus virulento (PrV-CD)
Giorni p.c.
0
2
4
6
8
10
12
14
Preparazione dell’antigene e via di immunizzazione
Vivo (i.n.)
Vivo (i.m.)
Spento (i.n.)
Spento (i.m.)
Controllo
–
+
+
–
–
–
–
–
–
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
–
–
–
–
–
+
+
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
–
–
–
+ il virus è stato rilevato nelle narici dei porcellini, - il virus non è stato rilevato nelle nerici dei porcellini.
p.c. =post-insulto
Sono state osservate risposte significativamente più alte
(p<0.05) in tutti i gruppi di porcellini confrontandoli con il
gruppo di controllo. Comunque, la risposta A-Ab più alta è
stata osservata nei porcellini immunizzati con virus vivo inoculato per via intramuscolare, seguiti poi da quelli immunizzati con virus vivo inoculato per via intranasale, virus spento
per via intramuscolare e la minor risposta in quelli immunizzati con virus spento inoculato per via intranasale. Nessuna variazione significativa nei livelli di N-Ab è stata rilevata all’interno di ciascun gruppo (p<0.05). La distribuzione
del virus dalle narici dei porcellini in seguito all’insulto con
il virus virulento è mostrato in Tabella 2. Il virus è stato rilevato fino al giorno 2,4,4,6 e 8 post-insulto per i porcellini
immunizzati con, rispettivamente, il virus vivo (i.m), vivo
(i.n.), spento (i.m.), spento (i.n.) ed il gruppo di controllo. I
livelli di protezione ottenuti sono stati stimati essere 100%,
90%, 90%, 80% e 50%, per i porcellini rispettivamente
immunizzati con il virus vivo (i.m), vivo (i.n.), spento (i.m.),
spento (i.n.) ed il gruppo di controllo.
DISCUSSIONE
Il presente lavoro è stato condotto per determinare l’influenza della via di somministrazione e della preparazione
dell’antigene sull’immunizzazione di un clone non patogeno a placca-purificato del virus della Pseudorabbia (PrVmAlp). La patogenicità ed il potere immunogeno di questo clone nel topo e nel porcellino sono stati precedentemente documentati1,2,3. I risultati ottenuti rivelano che il
virus è in grado di stimolare alti livelli di anticorpi neutralizzanti (N-Abs) quando somministrato nei porcellini utilizzando sia la via intramuscolare (i.m.) o intranasale (i.n.)
che le preparazioni degli antigeni virali. Questo supporta
altri studi precedenti che dimostrano come il PrV sia altamente immunogeno nei maiali17,18, 19. Inoltre, i risultati mostrano anche i porcellini immunizzati con virus PrV-mAlp
vivi stimolano una miglior risposta anticorpale neutralizzante rispetto ai soggetti immunizzati con virus inattivato.
Ciò convalida i risultati precedentemente pubblicati dai ricercatori che studiarono altre catene virali vaccinali4,9, 31.
Essi affermavano, infatti, che i virus spenti stimolavano
una risposta anticorpale più bassa rispetto alla protezione
clinica e virologica indotte da questi vaccini quando i porcellini venivano a contatto con un virus virulento. Questo
potrebbe essere attribuito al fatto che il virus vivo replica
nei tessuti animali senza causarne un danno strutturale e
quindi permette la crescita antigenica del virus, cosa non
possibile, invece, per il virus spento. Questo, conferma,
pertanto, che i fattori genetici essenziali per la replicazione
virale sono differenti da quelli responsabili della patogenicità13, 21. I risultati del nostro studio, inoltre, mostrano che
i porcellini inoculati con virus attraverso la via intramuscolare stimolano una risposta anticorpale (N-Abs) maggiore
rispetto a quelli inoculati con virus attraverso la via intranasale. Ciò è in accordo con Kimman et al.12, i quali confermavano che porcellini inoculati con PrV attraverso la
via intramuscolare stimolavano livelli anticorpali sierici più
alti mentre quelli inoculati per via intranasale inducevano
migliori risposte immunitarie mucosali.
SUINI
Giorni p.i.
30
Effetto della via di inoculazione e della praparazione dell’antigene sull’immunogenicità del clone virale apatogeno della pseudorabbia
È stato osservato che la distribuzione e protezione del
virus in seguito all’insulto di porcellini immunizzati sono
correlate con i livelli della risposta anticorpale per ciascuna via di somministrazione. Simili osservazioni furono riportate da Mengeling et al.20 e sono concordanti con i risulati ottenuti da Vannier et al.29. È stato anche dimostrato
che la distribuzione del virus nei porcellini immunizzati
con il vaccino costituito da virus vivo commerciale per un
minimo di 3 giorni ad un massimo di 9 giorni in seguito all’insulto dipende dalla catena virale del vaccino e della sua
preparazione24, 29. Inoltre, è quasi paragonabile ai nostri risultati la durata della distribuzione e presenza del virus in
un range compreso tra 2 e 6 giorni post-insulto. In un altro articolo avevamo confermato, inoltre, la patogenicità
di questo clone virale (mAlp) nei porcellini anche con una
dose inoculata di 108 p.f.u., ma ancora immunogena1. In
questo studio il vaccino dimostra un’azione protettiva e offre una protezione clinica del 100% contro l’insulto con la
dose letale di PrV-CD. Comunque, è stato dimostrato che
la perdita della virulenza è accompagnata da una perdita
grave di immunogenicità nella maggior parte dei casi25.
In conclusione, il virus PrV-mAlp è in grado di stimolare alti livelli sierici di anticorpi neutralizzanti specialmente
quando applicato come virus vivo attraverso l’inoculazione
via intramuscolare. In base al fatto che questo clone virale
è apatogeno, altamente immunogeno e protettivo contro
l’insulto virulento, può essere considerato un candidato
ideale all’uso vaccinale.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Parole chiave
Virus della pseudorabbia, vivo, spento, via di somministrazione, anticorpo neutralizzante, protezione.
21.
22.
Key words
Pseudorabies virus, live, killed, route, neutralizing antibody, protection.
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