DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE
• Il doppio strand della molecola di DNA
può denaturarsi dando due singoli strand
ad alte temperature (>90° C).
• Due strand di DNA complementari
possono “accoppiarsi” dando una
molecola a doppio strand quando la
temperatura viene abbassato lentamente.
EVOLUZIONE DELLA MOLECOLA DI DNA
Mutazioni strutturali (mutazioni di segmentazione)
•
•
•
•
delezioni
inserzioni
inversioni
ricombinazione
Mutazioni puntiformi (mutazioni di sostituzioni)
• transizioni A→G C→T G→A T→C
• trasversioni A→C C→A T→A C→G
G→C A→T G→T T→G
MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE
MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU:
RESTRIZIONE
- RFLP
- PCR-RFLP
PCR
SEQUENZIAMENTO
- RAPD
Sequenze di:
- ISSR
- nDNA
- SSR (microsatelliti) - cpDNA
- RAMP
- AFLP
- mtDNA
- SNP
I DATI SI ANALIZZANO PER OMOLOGIA
• Sito di mappa
• Dimensione di frammenti
• Allineamento di sequenze nucleotidiche
TECNICHE DI BASE
• Strategie di campionamento e conservazione del
materiale
• Estrazione di DNA genomico, purificazione, valutazione
della qualità e quantità
• Elettroforesi su gel
• Restrizione enzimatica
• PCR
• Clonaggio
• Sequenziamento
PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) - Replicazione
in vitro del DNA.
Mullis per questa invenzione ha vinto il premio
Nobel nel 1993.
La PCR è in assoluto la tecnica fondamentale per
gli studi molecolari.
PCR
• La reazione di amplificazione necessita di:
– DNA (template)
– Primer (inneschi)
– Miscela di nucleotidi (dNTP: dATP, dCTP, dTTP
e dGTP)
– Taq-Polimerasi (DNA polimerasi)
– MgCl2
– Buffer
• La reazione avviene all’interno di un
thermocycler che permette lo svolgersi di cicli
termici con temperature e tempi appropriati alle
varie fasi della reazione.
PCR
Paffetti, Emiliani
PCR
• Il DNA viene denaturato (95 °C)
• I primer (forward e reverse) si legano
(annealing) ai due strand (50 - 60 °C)
• La polimerasi, usando i nucleotidi in soluzione,
sintetizza
la
sequenza
complementare
(estensione 72 °C)
• Le fasi sopra esposte vengono ripetute per
decine di volte
PCR
Regione d’interesse
DNA
Denaturazione
...………...AACCATCGGG……………………………….. TTTGAAACCTGGG………...
.………….TTGGTAGCCC…………………………………AAACTTTGGACCC………...
PCR
Annealing dei primer
5’
3’
...………...AACCATCGGG……………………………….. TTTGAAACCTGGG………...
3’ AAACTTTG 5’
5’ ATCGGG 3’
.………….TTGGTAGCCC…………………………………AAACTTTGGACCC………...
3’
5’
PCR
Estensione
...………...AACCATCGGG……………………………….. TTTGAAACCTGGG………...
CTTTTAAAGGG AAACTTTG
TAGCCC
A
T
5’
Taqpolimerasi
T
G
C
3’
3’
G
TTTGAAAC
ATCGGG TTTTCCCAGG
.………….TTGGTAGCCC…………………………………AAACTTTGGACCC………...
5’
PCR
2a denaturazione
5’
...………...AACCATCGGG……………………………….. TTTGAAACCTGGG………...
TAGCCC
CTTTTAAAGGG AAACTTTG
ATCGGG TTTTCCCAGG
3’
3’
TTTGAAAC
.………….TTGGTAGCCC…………………………………AAACTTTGGACCC………...
5’
PCR
2° annealing e 2a estensione
TAGCCC
ATCGGG
CTTTTAAAGGG AAACTTTG
ATCGGG TTTTCCCAGG
AAACTTTG
TTTGAAAC
PCR
PCR
Ottimizzazione
Temperatura di denaturazione e tempo : 1 min a 94° C
Temperatura di annealing (dipendente dal primer) e
tempo: Ta=1/2 (Tm1+Tm2)-5° C 30 sec
Temperatura di estensione e tempo (dipendente dalla
polimerasi: 70-72° C da 0.5 a 3 min (100bp/sec)
Da 25 a 35 cicli
PCR
Ottimizzazione
Qualità e quantità del template
Concentrazione del Mg++: 1.5 mM o più di
MgCl2
Concentrazione di primer: da 0.2 a 1 µM di
ognuno dei primer
dNTP: da 50 a 100 µM di ognuno dei dNTP
PCR
Disegno dei primer
Lunghezza dei primer: 18-26 basi
I primer hanno una loro precisa Tm può essere calcolata in modo
approssimativo:
Tm=4° C (G+C) + 2° C (A+T)
in modo più preciso:
Tm=63.9+0.41 (%G+C)-650/lunghezza
Contenuto in GC: 50-60%
Le basi iniziali al 5’ è più conveniente che sia AT, al contrario quelle
terminali al 3’ CG
Sono da evitare hairpin
Porre particolare attenzione che non ci sia complementarietà interna o
al 3’ del primer per evitare la formazione di dimeri
PCR
Touchdown
Al fine di aumentare la specificità si possono
utilizzare alte temperature di annealing nei
primi cicli (60° C) ed abbassare gradualmente
la temperatura (ca 1-5° C) ad ogni ciclo fino
alla temperatura ottimale di annealing
QUALE MARCATORE PER QUALE SCOPO
• Quali sono le condizioni che abbiamo o cosa
vogliamo avere (in tutto questo va incluso anche
il budget a disposizione)?
• Quali sono
rispondere?
le
domande
a
cui
vogliamo
• Qual è il livello di variabilità che ci aspettiamo?
COME DEVE ESSERE UN BUON MARCATORE
• Sufficientemente polimorfico ed informativo
• Preferibilmente co-dominante
• Presentare una frequenza ed una distribuzione
nel genoma alta
• Selettivamente neutrale
• Facile e veloce da ottenere
• Altamente riproducibile e facilmente analizzabile
Paffetti, Emiliani
MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE
MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU:
RESTRIZIONE
- RFLP
- PCR-RFLP
PCR
SEQUENZIAMENTO
- RAPD
Sequenze di:
- ISSR
- nDNA
- SSR (microsatelliti) - cpDNA
- RAMP
- AFLP
- mtDNA
- SNP
RFLP
• Ragionevole alto polimorfismo
• Relativamente facile da un punto di vista
operativo, ma con tempi lunghi
• Marcatore co-dominante
• Le caratteristiche della sonda non sono sempre
disponibili
• Comparazione diretta dei pattern non sempre
facilmente interpretabili
Mutazioni che possono e non possono essere
evidenziate con gli RFLP
• Mutazioni puntiformi
nel sito di restrizione
• Inversione
quando
incorporata nei siti di
restrizione
• Inserzione/delezione
dentro e/o fra i siti di
restrizione
• Mutazioni puntiformi
fuori dai siti di
restrizione
• Inversioni dentro due
siti di restrizione
Una variazione da TA e AT porta alla
perdita o all’acquisto di un sito di
restrizione
5’ …GAATTC…3’
3’ …CTTAAG…5’
EcoRI 5’ …G
3’ …CTTAA
Perdita di un
sito di
restrizione
5’ …GAATAC…3’
3’ …CTTATG…5’
AATTC…3’
G…5’
Guadagno di
un sito di
restrizione
EcoRI
L’inserzione causa una variazione nei
frammenti di restrizione
Delezione/inserzione causa variazione
nei frammenti di restrizione
PCR-RFLP
(CAPS-Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)
• Preparare il frammento di DNA target via PCR
• Digerire il frammento di PCR con un enzima di
restrizione
• Separazione
elettroforesi
dei
frammenti
digeriti
tramite
• Valutazione della dimensione dei frammenti di
digestione o mappa di restrizione
PCR-RFLP
• Accurato e preciso
• Necessario conoscere il frammento
• Basso polimorfismo e informazioni limitate
MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE
MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU:
RESTRIZIONE
- RFLP
- PCR-RFLP
PCR
SEQUENZIAMENTO
- RAPD
Sequenze di:
- ISSR
- nDNA
- SSR (microsatelliti) - cpDNA
- RAMP
- AFLP
- mtDNA
- SNP
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA
Una semplice PCR con un solo primer
(normalmente di 10 basi) di sequenza
casuale
RAPD
500 bp
200 bp
1250 bp
300 bp
450 bp
RAPD
• I primer sono decameri
• E’ importante regolare il contenuto in GC
• I cicli di amplificazione sono diversi da quelli di una
specifica, temperatura di annealing più bassa
• L’analisi dei dati può essere difficoltosa
• Tra i marcatori molecolari è quello che offre il
campionamento più vasto del genoma
1 2
3 4 5
6 7 8
9 10 11
Tipico profilo di amplificazione primer 1247
1
2
3 4
5
6 7
8
9 10 11
Tipico profilo di amplificazione primer 1253
1 2
3 4 5
6 7 8
9 10 11
Tipico profilo di amplificazione primer RF2
RAPD
• E’ una metodica facile e veloce
• Alto polimorfismo
• Occorrono solo piccole quantità di DNA
• Sono sensibili alle condizioni
• Sono marcatori dominanti
• Comigrazione di frammenti
RAPD
Sono dei buoni marcatori nel caso in cui
• Valutare e stimare la diversità velocemente tra i
campioni (in particolare nel caso di valutazione
della variabilità intraspecifica)
• Quando altri metodi non riescono a mettere in
evidenza un buon livello di polimorfismo
• Individuare
e
caratterizzare
tramite
il
sequenziamento utili marcatori a partire dal
prodotto RAPD (bande)
RAPD
Migliorare la riproducibilità
Ottimizzare e stabilizzare le condizioni di PCR
Thermo Cycler
Ottimizzazione del ciclo (Ta=36° C)
La velocità di ramping non deve essere troppo veloce (ca 0.5° C
per sec)
Mg++ (3 mM)
Concentrazione del templato
MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE
MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU:
RESTRIZIONE
- RFLP
- PCR-RFLP
PCR
SEQUENZIAMENTO
- RAPD
Sequenze di:
- ISSR
- nDNA
- SSR (microsatelliti) - cpDNA
- RAMP
- AFLP
- mtDNA
- SNP
SSR
Simple Sequence repeat od anche
comunemente detti microsatelliti o Simple
Tandem Repeat (STR)
Ripetizioni in tandem (1-6 bp) di corte sequenze per es.
AAAAAAAA
ATATATATAT
GAGGAGGAGGAGGAGGAG
CAGACAGACAGACAGACAGA
X-satellite
Lunghezza di unità ripetute
> 100 bp
10-60 bp
1-6 bp
mixed
Termine specifico
satellite
minisatellite
microsatellite
medisatellite
VNTR
Variable Number Tandem Repeat
Microsatellite (SSR) + minisatellite
SSR
Polimorfismo determinato dal diverso
numero di basi ripetute
Vantaggi degli SSR
• Non sono tradotti e non sono sottoposti a selezione
quindi accumulano mutazioni costantemente nel
tempo
• Queste
mutazioni
avvengono
estesamente
e
casualmente intutto il genoma
• Altamente polimorfici e veramente comuni (105-106 per
genoma)
• Presentano un eredità codominante
• Quando i primer sono conosciuti possono essere
prodotti a partire da piccole quantità di DNA via PCR
• Possono essere diffusi da un laboratorio ad un altro con
facilità
Svantaggi degli SSR
• Sono necessarie informazioni sulla sequenza per poter
disegnare i primer nelle zone fiancheggianti ed i
procedimenti per ottenerle sono molto dispendiose e
lunghe
• Di solito è necessario testare librerie genomiche per
individuare e caratterizzare i loci microsatellite per
quelle specie oggetto di studio
SSR
Quando i primer fiancheggianti l’SSR
sono noti, il polimorfismo dell’SSR
può essere facilmente valutato via PCR
MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE
MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU:
RESTRIZIONE
- RFLP
- PCR-RFLP
PCR
SEQUENZIAMENTO
- RAPD
Sequenze di:
- ISSR
- nDNA
- SSR (microsatelliti) - cpDNA
- RAMP
- AFLP
- mtDNA
- SNP
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
Questa tecnica è una combinazione tra
RFLP e RAPD
Sono marcatori
intraspecifici
potenti
per
studi
AFLP
Sito MseI
Sito EcoRI
DNA genomico
+T
C+
• Il DNA genomico viene digerito
con due enzimi di restrizione spesso
MseI ed EcoRI, per formare
frammenti
con
le
estremità
desiderate
• Adattatori (2 corte sequenze a
doppio strand con le estremità
complementari
ad
uno
dei
frammenti digeriti) sono ligati ai
frammenti per formare siti di
binding per i primer nelle
successive amplificazioni
• PCR 1 e PCR 2 usando come
templato il ligato e primer che
possono accoppiarsi con gli
adattatori
DNA digerito
Adattatori complementari
Frammenti ligati
A
+ TX
A
G
G
XC+
AFLP-vantaggi e svantaggi
• Sono marcatori altamente polimorfici
• Sono riproducibili
• E’ una tecnica facile ed i primer sono standard
• La procedura è lunga
• Spesso i risultati sono difficili da analizzare
• E’ una tecnica costosa
MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE
MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU:
RESTRIZIONE
- RFLP
- PCR-RFLP
PCR
SEQUENZIAMENTO
- RAPD
Sequenze di:
- ISSR
- nDNA
- SSR (microsatelliti) - cpDNA
- RAMP
- AFLP
- mtDNA
- SNP
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
Uno SNP è una differenza in una singola coppia
di basi in un sito di DNA
Generalmente si possono mettere in evidenza
tramite elettroforesi di acrilammide, tramite
sequenziamento o spettrofotometria di massa
Le loro applicazioni comprendono test ed analisi
di linkage, sistemi di screening, ecc.
SEQUENZIAMENTO
• Tecnica precisa ed esplicita
• Si possono distinguere
strutturali e puntiformi
mutazioni
• L’omologia può essere facilmente
valutata attraverso allineamenti di
sequenza
SEQUENZIAMENTO
Quale frammento?
• Sequenze codificanti hanno basso polimorfismo
• Gli introni presentano un polimorfismo medio
• Gli spaziatori sono altamente polimorfici
Quale marcatore per quale proposta
Una correlazione fra la scelta del marcatore ed il
livello di diversità
RFLP
RAPD
• Ricerca veloce e stima dei livelli di
diversità (RAPD o ISSR)
PCR-RFLP
ISSR
• Diversità abbastanza alta (RFLP, PCRRFLP, Sequenziamento)
SSR
• SSR se i primer per l’organismo o per
individui tassonomicamente vicini sono
disponibili
AFLP
Sequenziamento
individuo
popolazione
specie
genere
famiglia
• Se siamo disposti a lavorare duramente
ed
abbiamo
abbastanza
fortuna
possiamo identificare da soli gli SSR
• Gli AFLP sono una buona scelta se non sono un problema i soldi e
l’automazione
• Il sequenziamento è veramente un metodo preciso ed una buona soluzione
se esiste un polimorfismo sufficiente
