PCR-RFLP
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DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE • Il doppio strand della molecola di DNA può denaturarsi dando due singoli strand ad alte temperature (>90° C). • Due strand di DNA complementari possono “accoppiarsi” dando una molecola a doppio strand quando la temperatura viene abbassato lentamente. EVOLUZIONE DELLA MOLECOLA DI DNA Mutazioni strutturali (mutazioni di segmentazione) • • • • delezioni inserzioni inversioni ricombinazione Mutazioni puntiformi (mutazioni di sostituzioni) • transizioni A→G C→T G→A T→C • trasversioni A→C C→A T→A C→G G→C A→T G→T T→G MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU: RESTRIZIONE - RFLP - PCR-RFLP PCR SEQUENZIAMENTO - RAPD Sequenze di: - ISSR - nDNA - SSR (microsatelliti) - cpDNA - RAMP - AFLP - mtDNA - SNP I DATI SI ANALIZZANO PER OMOLOGIA • Sito di mappa • Dimensione di frammenti • Allineamento di sequenze nucleotidiche TECNICHE DI BASE • Strategie di campionamento e conservazione del materiale • Estrazione di DNA genomico, purificazione, valutazione della qualità e quantità • Elettroforesi su gel • Restrizione enzimatica • PCR • Clonaggio • Sequenziamento PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) - Replicazione in vitro del DNA. Mullis per questa invenzione ha vinto il premio Nobel nel 1993. La PCR è in assoluto la tecnica fondamentale per gli studi molecolari. PCR • La reazione di amplificazione necessita di: – DNA (template) – Primer (inneschi) – Miscela di nucleotidi (dNTP: dATP, dCTP, dTTP e dGTP) – Taq-Polimerasi (DNA polimerasi) – MgCl2 – Buffer • La reazione avviene all’interno di un thermocycler che permette lo svolgersi di cicli termici con temperature e tempi appropriati alle varie fasi della reazione. PCR Paffetti, Emiliani PCR • Il DNA viene denaturato (95 °C) • I primer (forward e reverse) si legano (annealing) ai due strand (50 - 60 °C) • La polimerasi, usando i nucleotidi in soluzione, sintetizza la sequenza complementare (estensione 72 °C) • Le fasi sopra esposte vengono ripetute per decine di volte PCR Regione d’interesse DNA Denaturazione ...………...AACCATCGGG……………………………….. TTTGAAACCTGGG………... .………….TTGGTAGCCC…………………………………AAACTTTGGACCC………... PCR Annealing dei primer 5’ 3’ ...………...AACCATCGGG……………………………….. TTTGAAACCTGGG………... 3’ AAACTTTG 5’ 5’ ATCGGG 3’ .………….TTGGTAGCCC…………………………………AAACTTTGGACCC………... 3’ 5’ PCR Estensione ...………...AACCATCGGG……………………………….. TTTGAAACCTGGG………... CTTTTAAAGGG AAACTTTG TAGCCC A T 5’ Taqpolimerasi T G C 3’ 3’ G TTTGAAAC ATCGGG TTTTCCCAGG .………….TTGGTAGCCC…………………………………AAACTTTGGACCC………... 5’ PCR 2a denaturazione 5’ ...………...AACCATCGGG……………………………….. TTTGAAACCTGGG………... TAGCCC CTTTTAAAGGG AAACTTTG ATCGGG TTTTCCCAGG 3’ 3’ TTTGAAAC .………….TTGGTAGCCC…………………………………AAACTTTGGACCC………... 5’ PCR 2° annealing e 2a estensione TAGCCC ATCGGG CTTTTAAAGGG AAACTTTG ATCGGG TTTTCCCAGG AAACTTTG TTTGAAAC PCR PCR Ottimizzazione Temperatura di denaturazione e tempo : 1 min a 94° C Temperatura di annealing (dipendente dal primer) e tempo: Ta=1/2 (Tm1+Tm2)-5° C 30 sec Temperatura di estensione e tempo (dipendente dalla polimerasi: 70-72° C da 0.5 a 3 min (100bp/sec) Da 25 a 35 cicli PCR Ottimizzazione Qualità e quantità del template Concentrazione del Mg++: 1.5 mM o più di MgCl2 Concentrazione di primer: da 0.2 a 1 µM di ognuno dei primer dNTP: da 50 a 100 µM di ognuno dei dNTP PCR Disegno dei primer Lunghezza dei primer: 18-26 basi I primer hanno una loro precisa Tm può essere calcolata in modo approssimativo: Tm=4° C (G+C) + 2° C (A+T) in modo più preciso: Tm=63.9+0.41 (%G+C)-650/lunghezza Contenuto in GC: 50-60% Le basi iniziali al 5’ è più conveniente che sia AT, al contrario quelle terminali al 3’ CG Sono da evitare hairpin Porre particolare attenzione che non ci sia complementarietà interna o al 3’ del primer per evitare la formazione di dimeri PCR Touchdown Al fine di aumentare la specificità si possono utilizzare alte temperature di annealing nei primi cicli (60° C) ed abbassare gradualmente la temperatura (ca 1-5° C) ad ogni ciclo fino alla temperatura ottimale di annealing QUALE MARCATORE PER QUALE SCOPO • Quali sono le condizioni che abbiamo o cosa vogliamo avere (in tutto questo va incluso anche il budget a disposizione)? • Quali sono rispondere? le domande a cui vogliamo • Qual è il livello di variabilità che ci aspettiamo? COME DEVE ESSERE UN BUON MARCATORE • Sufficientemente polimorfico ed informativo • Preferibilmente co-dominante • Presentare una frequenza ed una distribuzione nel genoma alta • Selettivamente neutrale • Facile e veloce da ottenere • Altamente riproducibile e facilmente analizzabile Paffetti, Emiliani MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU: RESTRIZIONE - RFLP - PCR-RFLP PCR SEQUENZIAMENTO - RAPD Sequenze di: - ISSR - nDNA - SSR (microsatelliti) - cpDNA - RAMP - AFLP - mtDNA - SNP RFLP • Ragionevole alto polimorfismo • Relativamente facile da un punto di vista operativo, ma con tempi lunghi • Marcatore co-dominante • Le caratteristiche della sonda non sono sempre disponibili • Comparazione diretta dei pattern non sempre facilmente interpretabili Mutazioni che possono e non possono essere evidenziate con gli RFLP • Mutazioni puntiformi nel sito di restrizione • Inversione quando incorporata nei siti di restrizione • Inserzione/delezione dentro e/o fra i siti di restrizione • Mutazioni puntiformi fuori dai siti di restrizione • Inversioni dentro due siti di restrizione Una variazione da TA e AT porta alla perdita o all’acquisto di un sito di restrizione 5’ …GAATTC…3’ 3’ …CTTAAG…5’ EcoRI 5’ …G 3’ …CTTAA Perdita di un sito di restrizione 5’ …GAATAC…3’ 3’ …CTTATG…5’ AATTC…3’ G…5’ Guadagno di un sito di restrizione EcoRI L’inserzione causa una variazione nei frammenti di restrizione Delezione/inserzione causa variazione nei frammenti di restrizione PCR-RFLP (CAPS-Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) • Preparare il frammento di DNA target via PCR • Digerire il frammento di PCR con un enzima di restrizione • Separazione elettroforesi dei frammenti digeriti tramite • Valutazione della dimensione dei frammenti di digestione o mappa di restrizione PCR-RFLP • Accurato e preciso • Necessario conoscere il frammento • Basso polimorfismo e informazioni limitate MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU: RESTRIZIONE - RFLP - PCR-RFLP PCR SEQUENZIAMENTO - RAPD Sequenze di: - ISSR - nDNA - SSR (microsatelliti) - cpDNA - RAMP - AFLP - mtDNA - SNP RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Una semplice PCR con un solo primer (normalmente di 10 basi) di sequenza casuale RAPD 500 bp 200 bp 1250 bp 300 bp 450 bp RAPD • I primer sono decameri • E’ importante regolare il contenuto in GC • I cicli di amplificazione sono diversi da quelli di una specifica, temperatura di annealing più bassa • L’analisi dei dati può essere difficoltosa • Tra i marcatori molecolari è quello che offre il campionamento più vasto del genoma 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tipico profilo di amplificazione primer 1247 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tipico profilo di amplificazione primer 1253 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tipico profilo di amplificazione primer RF2 RAPD • E’ una metodica facile e veloce • Alto polimorfismo • Occorrono solo piccole quantità di DNA • Sono sensibili alle condizioni • Sono marcatori dominanti • Comigrazione di frammenti RAPD Sono dei buoni marcatori nel caso in cui • Valutare e stimare la diversità velocemente tra i campioni (in particolare nel caso di valutazione della variabilità intraspecifica) • Quando altri metodi non riescono a mettere in evidenza un buon livello di polimorfismo • Individuare e caratterizzare tramite il sequenziamento utili marcatori a partire dal prodotto RAPD (bande) RAPD Migliorare la riproducibilità Ottimizzare e stabilizzare le condizioni di PCR Thermo Cycler Ottimizzazione del ciclo (Ta=36° C) La velocità di ramping non deve essere troppo veloce (ca 0.5° C per sec) Mg++ (3 mM) Concentrazione del templato MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU: RESTRIZIONE - RFLP - PCR-RFLP PCR SEQUENZIAMENTO - RAPD Sequenze di: - ISSR - nDNA - SSR (microsatelliti) - cpDNA - RAMP - AFLP - mtDNA - SNP SSR Simple Sequence repeat od anche comunemente detti microsatelliti o Simple Tandem Repeat (STR) Ripetizioni in tandem (1-6 bp) di corte sequenze per es. AAAAAAAA ATATATATAT GAGGAGGAGGAGGAGGAG CAGACAGACAGACAGACAGA X-satellite Lunghezza di unità ripetute > 100 bp 10-60 bp 1-6 bp mixed Termine specifico satellite minisatellite microsatellite medisatellite VNTR Variable Number Tandem Repeat Microsatellite (SSR) + minisatellite SSR Polimorfismo determinato dal diverso numero di basi ripetute Vantaggi degli SSR • Non sono tradotti e non sono sottoposti a selezione quindi accumulano mutazioni costantemente nel tempo • Queste mutazioni avvengono estesamente e casualmente intutto il genoma • Altamente polimorfici e veramente comuni (105-106 per genoma) • Presentano un eredità codominante • Quando i primer sono conosciuti possono essere prodotti a partire da piccole quantità di DNA via PCR • Possono essere diffusi da un laboratorio ad un altro con facilità Svantaggi degli SSR • Sono necessarie informazioni sulla sequenza per poter disegnare i primer nelle zone fiancheggianti ed i procedimenti per ottenerle sono molto dispendiose e lunghe • Di solito è necessario testare librerie genomiche per individuare e caratterizzare i loci microsatellite per quelle specie oggetto di studio SSR Quando i primer fiancheggianti l’SSR sono noti, il polimorfismo dell’SSR può essere facilmente valutato via PCR MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU: RESTRIZIONE - RFLP - PCR-RFLP PCR SEQUENZIAMENTO - RAPD Sequenze di: - ISSR - nDNA - SSR (microsatelliti) - cpDNA - RAMP - AFLP - mtDNA - SNP AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Questa tecnica è una combinazione tra RFLP e RAPD Sono marcatori intraspecifici potenti per studi AFLP Sito MseI Sito EcoRI DNA genomico +T C+ • Il DNA genomico viene digerito con due enzimi di restrizione spesso MseI ed EcoRI, per formare frammenti con le estremità desiderate • Adattatori (2 corte sequenze a doppio strand con le estremità complementari ad uno dei frammenti digeriti) sono ligati ai frammenti per formare siti di binding per i primer nelle successive amplificazioni • PCR 1 e PCR 2 usando come templato il ligato e primer che possono accoppiarsi con gli adattatori DNA digerito Adattatori complementari Frammenti ligati A + TX A G G XC+ AFLP-vantaggi e svantaggi • Sono marcatori altamente polimorfici • Sono riproducibili • E’ una tecnica facile ed i primer sono standard • La procedura è lunga • Spesso i risultati sono difficili da analizzare • E’ una tecnica costosa MARCATORI MOLECOLARI DI USO CORRENTE MARCATORI MOLECOLARI CHE SI BASANO SU: RESTRIZIONE - RFLP - PCR-RFLP PCR SEQUENZIAMENTO - RAPD Sequenze di: - ISSR - nDNA - SSR (microsatelliti) - cpDNA - RAMP - AFLP - mtDNA - SNP SNP Single Nucleotide Polymorphism Uno SNP è una differenza in una singola coppia di basi in un sito di DNA Generalmente si possono mettere in evidenza tramite elettroforesi di acrilammide, tramite sequenziamento o spettrofotometria di massa Le loro applicazioni comprendono test ed analisi di linkage, sistemi di screening, ecc. SEQUENZIAMENTO • Tecnica precisa ed esplicita • Si possono distinguere strutturali e puntiformi mutazioni • L’omologia può essere facilmente valutata attraverso allineamenti di sequenza SEQUENZIAMENTO Quale frammento? • Sequenze codificanti hanno basso polimorfismo • Gli introni presentano un polimorfismo medio • Gli spaziatori sono altamente polimorfici Quale marcatore per quale proposta Una correlazione fra la scelta del marcatore ed il livello di diversità RFLP RAPD • Ricerca veloce e stima dei livelli di diversità (RAPD o ISSR) PCR-RFLP ISSR • Diversità abbastanza alta (RFLP, PCRRFLP, Sequenziamento) SSR • SSR se i primer per l’organismo o per individui tassonomicamente vicini sono disponibili AFLP Sequenziamento individuo popolazione specie genere famiglia • Se siamo disposti a lavorare duramente ed abbiamo abbastanza fortuna possiamo identificare da soli gli SSR • Gli AFLP sono una buona scelta se non sono un problema i soldi e l’automazione • Il sequenziamento è veramente un metodo preciso ed una buona soluzione se esiste un polimorfismo sufficiente
