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Anatomia Lesioni preneoplastiche portio Giunzione squamo-colonnare Colposcopia La Giunzione SquamoColonnare • nella donna in età fertile è sull’ esocervice • nella donna in menopausa è endocervicale Bethesda Sistems • Lesioni squamose atipiche di significato non determinabile (ASCUS) • Lesione ghiandolare atipiche di significato non determinabile (AGUS) • Lesione Intraepiteliale Squamosa (SIL) SIL di basso grado = lesione squamosa di basso grado comprende - la displasia lieve (CIN1) - la lesione da HPV SIL di alto grado = lesione squamosa di alto grado comprende - la displasia moderata (CIN2) - la displasia grave (CIN3) Infezione da HPV Molto diffusa : 75% Alta prevalenza tra i giovani E’ Transitoria : 80% delle donne è negativa dopo 18mesi dall’infezione Solo una piccola parte progredisce verso carcinoma, ed è dovuto al HRHPV • La maggior parte dell’infezione è transitoria. • Il rischio è aumentato solo nelle pazienti con infezione persistente. • la Persistenza è tipica dei ceppi ad alto rischio ALTO E BASSO RISCHIO 11* 6* 57 2* 10* 3* 7* 13* 44* 40* 42* 32* 43* HPV cutanei (*basso rischio) HPV mucosali (†alto rischio) 34 16† † 58† 52† 45† 68† † 33 39† 18† 35† 31 51† 53 66† 26 30 56† Adapted from Wieland U and Pfister H. In: Gross, Barrasso Eds. Ullstein Mosby; 1997. Lui J et al (Eds): IDEAL 2003. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2003. HPV CONDILOMI GENITALI 90% dei casi 6 e 11 10% di e nel corso della vita LESIONI CERVICALI CIN 1 (4 - 25%) PAPILLOMATOSI RICORRENTE DELLE ALTE VIE RESPIRATORIE (JORRP) 0.1-2.1/100.000 nati 1/400 parti in pz. con condilomatosi florida HPV , ,31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 66 % attribuibile a HPV Carcinoma cervicale Carcinoma vagina Carcinoma vulva Carcinoma ano 100% 64-91% 40% 88-94% Carcinoma faringe 25% Carcinoma cavità orale 10% Carcinoma pene 40% Raffigurazione del meccanismo oncogeno di HPV Lesioni virali da HPV Primo presidio diagnostico: Pap test coilocitosi Atipia Coilocitotica • • • Il coilocita è definito come una cellula squamosa superficiale o intermedia caratterizzata da: Ampio alone paranucleare a margini netti,otticamente vuoto Nucleo ingrandito 18 Pap test: sensibilità 15-30% Coilociti e discheratociti non sono presenti in tutte le infezioni produttive Poche cellule alterate con caratteristiche non sempre evidenti Tali modificazioni cellulari non sono evidenti nelle infezioni latenti e quando il virus è integrato nel genoma della cellula ospite. 19 Pap test: sensibilità La sensibilita del pap test nella diagnosi delle lesioni virali della cervice è abbastanza bassa. Ciò è dovuto non tanto al test ma alla natura della infezione stessa. Infatti gli ECV non sempre sono presenti in quanto si verificano solo nelle infezioni produttive, mentre quando il virus si integra con il DNA della cellula ospite, quindi possibile oncogenesi, il pap test potrebbe anche essere negativo. • • • • • • • La cellula infettata da HPV è detta COILOCITA (= cellula col buco): è una cellula squamosa, epiteliale, con un nucleo ipercromico (scuro) e un alone nucleare intorno (chiaro). Si parla di "coilocitosi". L'HPV promuove, nelle cellule squamose, una marcata IPERPROLIFERAZIONE, per cui troviamo anche alterazioni di tipo strutturale, tissutale, di tipo papillomatoso. Il coilocita ha aspetto fusato. Normalmente il nucleo di una cellula squamosa è centrale vescicoloso, ricco di nucleoli. Una volta infettata, questa cellula presenta un nucleo allungato, a volte bitorzoluto, con l'acido nucleico concentrato. Attorno si crea un alone chiaro (che poi sarebbe il buco) costituito dai virioni in replicazione. Il corrispettivo istologico di questa lesione è dovuto alla iperproliferazione: si formano delle lesioni in cui l'epitelio (come se non trovasse più spazio sul piano) inizia ad ispessirsi e a formare le PAPILLE, che si portano dietro il loro asse fibrovascolare, per assicurarsi il nutrimento. Il tessuto è caratterizzato da: PAPILLOMATOSI IPERCHERATOSI =aumento della produzione di cheratina. PARACHERATOSI =cheratinizzazione di epiteli normalmente non cheratinizzati. DISCHERATOSI =cheratinizzazione parziale. Alterazioni cellulari acantosi discheratosi Acantosi: aumento delle cellule che compongono lo strato spinoso Evidenza di ECV da HPV può essere presenti nelle CIN 1 e 2 meno frequentemente nelle CIN3 in questi casi la lesione viene classificata come CIN con evidenza di infezione da HPV( Richart, 1999) Di regola la evidenza di ECV da HPV è inversamente proporzionale al grado di CIN e può non essere evidente nelle lesioni di alto grado/CIS L’assenza di antigeni strutturali virali e quindi di ECV è relativamente frequente nel CIS ed è la regola nel ca invasivo Quindi con la trasformazione maligna, che in genere correla con la integrazione del DNA virale nel DNA dell’ospite, vengono persi i marcatori morfologici ed ogni informazione sulla presenza del virus è legata all’analisi molecolare Pap test + colposcopia accuratezza diagnostica Lesioni preneoplastiche della portio diagnosi Pap Test Colposcopia L’associazione pap test colposcopia porta a risultati corretti nel 9097%. Accuratezza diagnostica : colposcopia 90 % Dipartimento di Scienze Ginecologiche-Università di Catania- ambulatorio di colposcopia prof. M.T.Bruno colposcopia • • • • Individuare le lesioni definirne i limiti topografici Esprimere un grading Indicare la sede o le sedi della biopsia Colposcopia l’epitelio cilindrico con l’acido acetico assume un aspetto a “ chicco d’uva”. E la zona di gsc è ben individuabile, se la donna è giovane. Epitelio acidopositivo • Le aree di epitelio atipico assumono invece un colorito bianco in quanto il citoplasma delle cellule atipiche è ricco di proteine che a contatto con acido acetico si coagulano danno nell’ insieme l’aspetto biancastro tipico. Colposcopia • Spesso all’ area acidopositiva si associa un aspetto: a”mosaico” dato dai capillari che assumono un andamento parallelo all’epitelio per cui danno un aspetto quadrettato; a “puntato” dato da papille connettivali con il contenuto vascolare. Se l’atipia interessa le ghiandole da’ origine allo “sfondato ghiandolare ispessito”. Mosaico Colposcopia • Il test diSchiller viene utilizzato solo ai fini didattici e si basa sul fatto che l’epitelio maturo è ricco di glicogeno per cui lo iodio lo colora uniformemente color mogano. L’epitelio atipico non contiene glicogeno per cui non si colora. E’ poco specifico. Colposcopia La colposcopia mette in evidenza eventuali • - lesioni atipiche della portio, • - studia la sua estenzione • - permette di eseguire la biopsia mirata • - indica il tipo di terapia, infatti se la lesione è tutta esocervicale ed è una SIL di basso grado PERSISTENTE basta fare una laserterapia , se la lesione è endocervicale per avere la certezza diagnostica bisogna eseguire un prelievo del canale cervicale o addirittura una conizzazione Biopsia portio • Individuata la zona sospetta si esegue la biopsia mirata della portio. Consiste nel prelevare un frammento di tessuto sotto visione colposcopica, quando la lesione è interamente visibile. • Si esegue con una apposita pinza, ambulatoriamente e senza anestesia Biopsia portio Scarsa accuratezza diagnostica della biopsia target Biopsia target= prelievo escissionale accuratezza 43-51% 107 b i o p s i a CIN1 conizzazione CIN 2-3 65% Zuchna C. 2010 Incrementare il numero di biopsie target a due/tre Accuratezza diagnostica Sensibilità Specificità Conizzazione Se la lesione non è interamente visibile, ma si estende nel canale cervicale allora è consigliabile la conizzazione diagnostica. Conizzazione Consiste nell’asportare un cono di tessuto cervicale il cui apice coincide con il canale cervicale e la base con l’esocollo. Se la lesione è SOPRATTUTTO esterna l’altezza del cono è minima, se la lesione si estende SOPRATTUTTO dentro il canale cervicale l’ altezza del cono è massima. Conizzazione E’ indicata, quando • - l ’ intera area non è visibile al colposcopio, ma risale dentro il canale cervicale; • - l’esame istologico ha messo in evidenza un CIN3-Carcinoma in situ; • - la biopsia ha dato esito negativo in una paziente con paptest ripetutamente positivo Conizzazione Si esegue in anestesia generale. Si delimita la zona atipica con la soluzione di Lugol. Si danno due punti di sutura a ore 3-9 per bloccare le cervicali e diminuire l’emorragia. Si comincia ad incidere e ad asportare il cono la cui profondità è legata alla localizzazione della lesione. Nella donna fertile il tratto di cono asportato non deve superare i 2.5 cm di canale cervicale lasciando intatta la parte superiore del canale cervicale e l’orifizio uterino interno. Conizzazione Nella donna in postmenopausa invece, nella quale la gsc si trova dentro il canale cervicale, è bene asportare un cono il cui apice raggiunga anche l’orificio cervicale interno. Asportato il cono, veniva coperta la perdita di sostanza con la mucosa cervicale residua mediante due punti alla Sturmdorf. Attualmente ciò non si fa in quanto è più facile controllare eventuali focolai di neoplasia residua con il pap test e la colposcopia. Il cono asportato dopo averlo orientato con una sutura a ore 12, viene inviato al patologo. Quanto più elevato è il numero delle sezioni tanto più non sfuggiranno piccole aree di neoplasia. Trattamento CIN1 Lesione CIN1 follow-up SICPCV linee guida Il trattamento è indicato se la lesione di basso grado persiste per più di due anni ZTN completa ATZ2 GSC non visibile CIN3 Pap Test LSIL Conizzazione ATZ1 gsc Parzialmente visibile cheratosi Vantaggi della colposcopia • Scarsa invasività • accuratezza diagnostica: colposcopia+ pap test= 100 • Sensibilità colposcopia+ biopsia target Limiti della colposcopia •Impossibilità di identificare lesioni endocervicali •Bassa sensibilità qualora non sia seguito da biopsia •Esame operatore dipendente Limiti della colposcopia , la lesione esocervicale si continua nel canale cervicale. - - la gsc non è visibile 59 ambulatorio di ColposcopiaProf. M.T. Bruno- Università di Catania Lesioni virali da HPV diagnosi: Pap test Colposcopia • HPV test HPV test Vanno mandate a colposcopia tutti i casi di pap test anomalo Bethesda Sistem National Cancer Institute Workshop on Cytopathology (1988,1991) Cellule squamose • S.I.L. Lesione Intraepiteliale Squamosa •A.S.C.U.S.Cellule Squamose Atipiche LSIL (di basso grado) HSIL (di alto grado) di significato indeterminato Cellule ghiandolari CIN 1 (displasia lieve) CIN 1 + HPV CIN 2 (displasia moderata) CIN 3 (displasia grave e Ca in situ) • A.G.U.S Cellule Ghiandolari Atipiche di significato indeterminato Dipartimento di Scienze Ginecologiche-Università di Catania- ambulatorio di colposcopia prof. M.T.Bruno Il motivo più frequente di invio a colposcopia è un referto citologico ASCUS ASCUS Obbiettivo principale l’identificazione di lesioni CIN2, lesioni usualmente trattate. ASCUS 3 8 % CIN2 Quindi non bisogna sottovalutare un referto citologico ASCUS La gestione della citologia ASC-US (SICPCV) 1. Colposcopia immediata 2. Ripetere pap test dopo sei mesi 3. HPV test Protocollo ASCUS ASCUS HPV test screening colposcopia HPV test nello screening • La logica è quella di rovesciare l’attuale algoritmo • Pap Test• Test HPV• Colposcopia • eseguendo prima il test più sensibile (test HPV) e successivamente il test più specifico (Pap Test). Protocollo di screening Test di primo livello HPV Pap test Rip a 3 aa Negativa HPV a 1 anno >Ascus colposcopia L’HPV test nello screening primario Pap test+ HPV test donne> 30 anni ogni 3 anni HPV test nel follow-up della terapia escissionale per CIN2-3 Perché la sorveglianza dopo trattamento per CIN2-3 Le pazienti hanno un rischio aumentato di sviluppare una neoplasia cervicale La maggior parte delle recidive si osserva nei primi due anni dal trattamento Definizione di m.Residua/ recidiva: CIN2-3 confermato con istologia Follow- up dopo trattamento per CIN2-3 • Problemi Adesione al follow-up Visita ogni 6 mesi per 2 o piu aa Quali test usare Pap test HPV test 6 mesi negati vi 12 mesi Aderenza al followup e meno costi Follow- up dopo trattamento per CIN2-3 HPV test con tipizzazione la Persistenza /Recidiva di CIN Associati alla Persistenza di HPV 16/18 HPV test La tipizzazione permette una accurata identificazione delle infezioni persistenti Se HPV test negativo si puo allungare l’intervallo di follow-up fino a 5 anni HPV test Molto sensibile Poco specifico VPP basso VPN alto Sensibilità HPV test capace di diagnosticare tutti i casi in cui l’HPV infetta la cellula ma è bassa la specificità HPV test positivo Allarme nella paziente Risvolti psicologici nella donna e nella coppia Aumento indiscriminato di indagini di secondo livello: colposcopia, biopsia, laser ecc Con danno alla sanità pubblica Come aumentare la specificità dell’HPV test? Test di Rischio oncogeno HPV test genotipizzazione mRNA E6 E7 Proteina p16 Fish test HPV test genotipizzazione La genotipizzazione è eseguita con il metodo della PCR, che ha una sensibilità per l’infezione molto elevata. Secondo studi prospettici il rischio di persistenza e progressione delle lesioni HPV correlate è notevolmente diverso secondo del genotipo virale Quindi la tipizzazione fornisce informazioni aggiuntive sul rischio individuale di sviluppare lesioni preneoplastche Distribuzione percentuale dei carcinomi del collodell’utero,pertipodiHPVinEuropa HPV type prevalence in Cervical carcinomas* in Europe (% of all HPV+ cases treated) 1616 58,1 1818 3333 3131 4545 3535 5858 5656 5252 7373 66 6868 1111 5151 3939 6666 5959 7070 8282 15,7 4,4 4,0 2,9 1,6 1,2 1,0 0,6 58.1% 73.8% 78.2% 82.2% 85.1% 86.7% 87.9% 88.9% 0,6 0,3 0,3 0,3 0,2 8 tipi di HPV sono responsabili del0,290% deicancridelcollodell’utero0,2 0,1 0,0 0,0 0 20 40 60 80 * Casi di carcinoma della cervice attribuiti ai genotipi di HPV (%) 100 Smith JS, Lindsay L, Hoots B et al. Int J Cancer 2007;121:621-32 HPV ad alto rischio: diversa capacità oncogena • Numerosi studi hanno rilevato che le donne con citologia ASCUS/LSIL positive per HPV 16-18 hanno un rischio aumentato rispetto a quelle con positività per altri tipi oncogeni di HPV ( studio ALTS). • Il rischio di CIN3 è risultato 5 volte più alto nelle donne HPV 16 positive rispetto alle donne positive per gli altri sottotipi virali ad alto rischio. • Quindi la tipizzazione di HPV 16-18 consente di identificare le donne con rischio più elevato di sviluppare un CIN2 Genotipizzazione: HPV 16 HPV ad alto rischio: HPV 16 • Studi sugli HPV 16 hanno scoperto che le proteine E6/E7 del genotipo 16 ha una maggiore adesivita alla proteina p53 e alla proteina del gene dei retino blastoma- Per cui esplica una maggiore attività oncogena. I tipi a basso rischio invece producono proteine E6 e E7 con bassa affinità di legame per p53 e pRb e non ne attivano la degradazione; HPV ad alto rischio: HPV 16 • inoltre Indagini recenti hanno dimostrato, utilizzando tecniche capaci di determinare la carica virale (Hibryd Capture), che il genotipo 16 ha una carica virale circa 60 volte maggiore nelle HSIL rispetto alle LSIL e agli altri HRHPV 31, 33, 18, 45. HPV ad alto rischio: HPV 16 • Questi studi hanno identificato l’HPV 16 come il più aggressivo. • Sembra che sia utile riconoscere le pazienti con ASCUS o LSIL con infezione da HPV16 da quelle con altri HPV ad alto rischio, in quanto hanno un rischio maggiore a due anni di CIN3 o più. mRNA E6-E7 • L’iperespressione di E6/E7 di HPV ad alto rischio è associata al cervicocarcinoma e alle sue lesioni precancerose. L’analisi dell’espressione dei trascritti E6/E7 di HPV 16, 18, 31, 33, 45 con il test commerciale Pr tect HPV Proofer ha dimostrato una buona specificità nell’identificare le lesioni CIN2+. mRNA E6-E7 • Pazienti con CIN1 istologico e HPV test positivo per uno degli HPV test ad alto rischio vengono inviate a trattamento se mRNA positivo. • Donne positive all’HPV 16-18 e positive al mRNA sono ad altissimo rischio di sviluppare un cervicocarcinoma. • Donne con pap test negativo, ma positive all’HPV test 16-18 persistente sono a rischio di sviluppare una CIN3 la ricerca del mRNA di E6-E7. la positività di questo test sottolinea la avvenuta integrazione del virus . Ne consegue che la transcriptasi di E6 ed E7 può essere utilizzato come markers di progressione della lesione mRNA E6-E7 la ricerca dell’RNA messaggero è limitata solo ai principali tipi oncogeni 16, 18, 31, 33, 45, espressione di una fase virale attiva. Il test è molto sensibile ed è quindi in grado di rilevare le infezioni allo stadio iniziale, molto prima che le alterazioni cellulari siano visibili in un normale campione di cellule studiato al microscopio. Proteina p16 La proteina p16 è un regolatore del ciclo cellulare che interrompe il segnale di transizione della cellula dalla fase G1 verso la fase S, fasi durante le quali la cellula prima sintetizza le proteina e poi replica il DNA. La p16 inibendo le Kinasi ciclino dipendenti responsabili della fosforilazione del pRB (retinoblastoma) e quindi della conseguente trascrizione del fattore E2F che regola la produzione delle proteina specifiche della fase S. La sintesi di p16 è regolata da un meccanismo feed back negativo con lo stesso E2F. Proteina p 16 L’oncogene E7 del HPV interagisce con pRB cellulare inducendo l’espressione del fattore E2F, a prescindere dall’azione delle Kinasi ciclino dipendenti con conseguente aumento della p16. L’iperespreeione della p16 evidenzia una alterazione del ciclo cellulare e quindi una maggiore probabilità di trasformazione neoplastica. In particolare lìiperespressione della proteina p16 nelle cellule displastiche indica una attiva espressione dell’oncogene virale E7 La p16 non è espressa nelle cellule epiteliali normali e nelle cellule infiammatorie e metaplastiche delle cervice Proteina p16 Proteina p16 FISH TEST ( Fluorescent in Situ Hybridization) un HPV ad alto rischio persistente può integrarsi nelle cellule cervicali e causarne la trasformazione neoplastica attraverso due diversi meccanismi: Fish Test meccanismo oncogeno di HPV HPV Fish test Amplificazione del gene delle telomerasi, situato nel locus 26 del braccio lungo del cromosoma 3 (3q26). Iperproduzione di telomerasi Immortalizzazione della cellula infettata cromosoma La telomerasi La telomerasi ha il compito di riparare le estremità dei cromosomi (telomeri) che normalmente con l’invecchiamento cellulare tendono ad accorciarsi. • Questo meccanismo per la sua semplicità, è molto più diretto del primo, fallisce meno facilmente e giustifica la velocità di progressione ( anche meno di un anno) che qualvolta si osserva clinicamente. • Mediante la tecnica FISH è possibile contare le copie del gene3q26 nelle cellule cervicali prelevati FISH test L’amplificazione del gene della telomerasi è stata riscontrata nel LSIL 22% HSIL 52%-80% Carcinoma 100% Se FISH positiva predisporre controlli ravvicinati ( pap testcolposcopia) Se FISH negativa, la probabilità che una LSIL regredisca spontaneamente è pressochè assoluta In quest’ultimo caso la paziente non necessita di ulteriori controllo e può rientrare nei normali protocolli di screening
