Infiammazione cronica immune

MODELLI ANIMALI PER LO STUDIO DELL’INFIAMMAZIONE CRONICA IMMUNE
Esistono diversi modelli animali di infiammazione cronica immune che per certi aspetti assomigliano ad
analoghe patologie umane come ad esempio l’artrite reumatoide.
L'artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune molto comune caratterizzata dalla progressiva e
simmetrica erosione e distruzione delle articolazioni periferiche. Gravità e suscettibilità all’RA sono
influenzate da svariati fattori genetici, riproduttivi, ambientali e dall'età. Numerosi modelli sperimentali di
artrite erosiva nel ratto e nel topo sono attualmente utilizzati per lo studio dei meccanismi etiopatogenetici
dell’RA. Gli stessi modelli sono anche ampiamente utilizzati per valutare l’attività di nuovi agenti
terapeutici.
I modelli di artrite erosiva nel ratto possono essere classificati in tre gruppi principali. Nel primo gruppo
l’artrite è indotta tramite iperimmunizazione di ceppi di ratti geneticamente suscettibili con antigeni tipo il
collagene di tipo II (artrite indotta da collagene) o la proteina oligomerica della matrice cartilaginea
(artrite indotta da COMP) in adiuvante incompleto di Freund (IFA). Nel secondo gruppo l’artrite è indotta
attraverso la somministrazione intradermica di diversi adiuvanti su base oleosa, tra i quali il
Mycobacterium tuberculosis inattivato con il calore emulsionato in IFA è il più ampiamente utilizzato.
Artrite cronica erosiva può essere indotta attraverso l’utilizzo di altri adiuvanti, tra i quali CP-20961,
“pristane” (artrite indotta da “pristane”) e IFA da solo. Nel terzo gruppo di modelli nel ratto l’artrite è
indotta da peptidoglicani-polisaccaridi componenti della parete cellulare di batteri. L’artrite indotta dalla
parete cellulare di streptococco (SCW) è il modello maggiormente utilizzato di questo gruppo. Nei topi i
modelli principali sono, l’artrite indotta da collagene (CIA), l’artrite indotta da pistrano (PIA) e l’artrite
indotta da proteoglicani. I topi sono relativamente resistenti all’artrite classica indotta da Mtb-adiuvante e
all’artrite SCW. Ognuno dei modelli di ratto e di topo ha caratteristiche cliniche che richiamano la RA
nell’uomo. Le caratteristiche istologiche di tutti i modelli includono iperplasia della sinovia con
infiltrazione massiccia di cellule infiammatorie, analogamente a ciò che si verifica in pazienti affetti da
RA.
I vari modelli differiscono tra loro in riferimento a: l'inizio della malattia, la gravità dell’infiammazione
articolare, il tipo di articolazioni coinvolte e diverse manifestazioni cliniche e sistemiche.
Artrite indotta da collagene (CIA)
Questo modello si basa sull’uso del collagene eterologo di tipo II emulsionato in adiuvante incompleto di
Freund. Il collagene di tipo II è dissolto ad una concentrazione di 2.0 mg/ml in acido acetico 0.1 M a 4°C.
Questa soluzione è aggiunta a goccia a goccia ad un volume uguale di adiuvante di Freund incompleto.
Ratti (10 per gruppo) con un peso iniziale di circa 120 g sono utilizzati nella procedura sperimentale. Nel
giorno 1, ogni ratto riceve un totale di 0.5 mg di collagene in 0.5 ml, ugualmente divisi, in 5 siti. Tutte le
iniezioni sono intradermiche, una alla base di ogni appendice e una alla base del collo. Un’iniezione
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supplementare è praticata 7 giorni dopo la prima immunizzazione. Gli animali di controllo ricevono solo
l'adiuvante di Freund incompleto diluito in acido acetico 0.1 M. Le zampe di tutti i ratti sono esaminate
quotidianamente per registrare eventuali cambiamenti ed uno “score” artritico è valutato secondo il
seguente schema: presenza di rossore 1, presenza di gonfiore e rossore 2, presenza di gonfiore, rossore e
mancanza di reazione prensile 3. L’aumento del volume delle zampe è misurato tre volte in una settimana.
Un metodo corrente per determinare l’aumento di volume delle zampe è basato sull’uso del
pletismometro. L’aumento di volume viene valutato misurando il volume della zampa, per immersione, in
base allo spostamento del livello di un liquido contenuto in un cilindro. Oggi sono disponibili
pletismometri elettronici in grado di fornire contemporaneamente il volume delle zampe degli animali e
tutti i parametri statistici. L'incremento del volume delle zampe è confrontato con il valore basale delle
zampe stesse o paragonando i valori medi dei vari gruppi con quelli del gruppo di controllo. Il collagene
eterologo di tipo II è estremamente artritogenico nei ceppi di ratti DA (dark agouti), BB-DR (resistenti al
diabete) e Lewis, ma non nei BN o F344 (Fisher). Il collagene omologo di tipo II è anche artritogenico nei
ratti DA ma non in altri ceppi. La comparsa di una poliartrite erosiva si verifica 12-13 giorni dopo la
somministrazione ed il picco massimo si ha tra il 21° e il 28° giorno dalla sensibilizzazione da collagene e
resta costante o gradualmente diminuisce tra il 28° ed il 50° giorno.
Al fine di minimizzare la possibilità di includere animali con patologia transitoria o non particolarmente
pronunciata, solo animali con un evidente “score” artritico sono considerati responsivi al modello e
utilizzati per successive valutazioni. A diversi intervalli di tempo, in questo come in altri modelli, gli
animali sono sacrificati e le zampe processate per l’analisi istologica. La patologia è caratterizzata da
infiammazione della sinovia, infiltrazione di polimorfonucleati e di monociti, formazione di panno,
erosione di osso e cartilagine e fibrosi.
Le cellule T autoreattive cosi come le cellule B, che producono anticorpi contro il collagene di tipo II,
svolgono un ruolo critico nella progressione della patologia. Diversi protocolli sperimentali prevedono
l’isolamento di queste cellule dai linfonodi di animali artritici allo scopo di valutare ex vivo diversi
parametri come la proliferazione o la produzione di citochine. Cosi come nell’RA nell’uomo, le femmine
tendono a essere più suscettibili dei maschi, e i ratti artritici producono anche il fattore reumatoide ed
anticorpi contro la proteina dello shock termico hsp65, tuttavia in molti casi di RA non è presente una
risposta anti-collagene. A causa della somiglianza tra l’RA e CIA nel ratto il test è considerato molto utile
per la valutazione di potenziali farmaci anti-infiammatori e immunosoppessori.
CIA può essere indotta anche in ceppi di topi suscettibili da immunizzazione con collagene nativo
eterologo di tipo II emulsionato in adiuvante completo di Freund (CFA). I topi, a differenza dei ratti,
richiedono CFA piuttosto che IFA, come adiuvante. Negli stadi iniziali di CIA, si verifica deposizione di
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fibrina e gli anticorpi anti-collagene si legano alla cartilagine dell’articolazione e attivano il complemento.
La malattia cronica è dipendente da cellule T autoreattive. Le zampe di tutti i topi sono esaminate
quotidianamente per registrare eventuali cambiamenti. Gonfiore e rossore, come primi sintomi di artrite e
lo spessore (diametro) del ginocchio, della caviglia (diametro intermalleolare) e della zampa sono misurati
tre volte in una settimana utilizzando un calibro. Il parametro più oggettivo è quello intermalleolare. I dati
vengono analizzati attraverso un analisi statistica non parametrica. A diversi intervalli di tempo i topi
possono essere sacrificati e le zampe sottoposte ad analisi istologica.
In topi suscettibili come DBA/1 e B10.RIII, a differenza dell’RA negli esseri umani, i maschi mostrano
un'incidenza più alta di CIA e una patologia più severa delle femmine. Come nell’RA, CIA murina va
incontro a remissione durante la gravidanza per poi riesplodere nel periodo postpartum. La patologia non
è responsiva ai FANS.
Artrite indotta dalla proteina oligomerica della matrice cartilaginea (COMP)
L'immunizzazione con COMP di ratto nativa o denaturata emulsionata in IFA produce un artrite grave in
ceppi di ratto suscettibili, come DA e Lewis. Come il collagene di tipo II, COMP è un prodotto dei
condrociti, ma rappresenta una componente minore della matrice extracellulare della cartilagine. Benché
l'artrite a livello delle articolazioni periferiche somigli clinicamente all’RA (iperplasia e ipertrofia della
sinovia, formazione di panno ed erosione dell’osso), tuttavia, non porta alla distruzione permanente delle
articolazioni.
Artrite indotta da adiuvante (AIA)
La base per il modello dell’artrite adiuvante nel ratto è l’iniezione intradermica alla base della coda di 0.1
ml di Mycobacterium tubercolosis (6 mg/ml) ucciso a caldo e sospeso in paraffina liquida od olio
minerale (IFA), che causa un artrite distruttiva. A seguito della iniezione di questo materiale si osserva un
rigonfiamento tra il 9° e il 12° giorno nelle zampe posteriori indotto da uno stimolo immunologico. Tra il
16° e il 30° giorno si verifica il massimo rigonfiamento con fusione delle superfici dell’articolazione.
Dopo 30-40 giorni l’infiammazione comincia a scomparire. Il volume delle zampe viene misurato
attraverso l’utilizzo di un pletismometro. Altre sostanze, come frammenti più piccoli di pareti cellulari di
micobatteri e muramildipeptide, possono causare lo stesso effetto se somministrati in emulsione con
adiuvante incompleto di Freund. Anche se l’artrite da adiuvante varia considerevolmente a seconda del
ceppo di ratto utilizzato, il ratto Lewis risulta il più adatto.
Un’aumentata sintesi del fattore di necrosi tumorale (TNF-α), di interleuchina 1 (IL-1) e IL-6 è
evidenziabile già 4 giorni dopo l’iniezione di adiuvante. La patologia progredisce rapidamente durante
alcune settimane ed è caratterizzata dalla formazione di edema, infiltrazione di monociti e
polimorfonucleati a livello dell’articolazione, formazione di panno sinoviale, periostite ed erosione della
cartilagine e dell’osso. Granulociti e linfociti T CD4+ svolgono un ruolo fondamentale nella patologia.
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Questo modello di ratto rappresenta un processo sistemico che coinvolge non solo le articolazioni ma
anche l’apparato gastrointestinale e genitourinario, la pelle e gli occhi. Si osservano anche alterazioni
morfologiche a carico delle zampe anteriori, della coda, delle cartilagini del naso e delle orecchie nonché
una significativa riduzione del peso degli animali e l’alterazione di parametri biochimici e funzionali
relativi al metabolismo epatico ed ai livelli di albumina e fibrinogeno. Al giorno 21° si valuta l’“arthritis
score” secondo il seguente schema:
orecchio: assenza di noduli e rossore 0
presenza di noduli e rossore 1
naso: nessun gonfiore del tessuto connettivo 0
gonfiore evidente del tessuto connettivo 1
coda: assenza di noduli 0
presenza di noduli 1
zampe anteriori: assenza di infiammazione 0
infiammazione in almeno 1 articolazione
zampe posteriori: assenza di infiammazione 0
leggera infiammazione 1
infiammazione moderata 2 infiammazione evidente 3
AIA clinicamente e istologicamente somiglia all’RA, pur non essendo presente fattore reumatoide nei ratti
interessati. Lo sviluppo di periostite, di anchilosi ossea e di diverse manifestazioni extra-articolari ricorda
la sindrome di Reiter o spondiloartropatie.
La somministrazione di agenti terapeutici da studiare si effettua giornalmente dal settimo al
diciassettesimo giorno dall’iniezione dell’adiuvante. La valutazione dell’attività delle sostanze viene
eseguita confrontando il volume delle zampe posteriori degli animali trattati con quello di un gruppo di
ratti artritici di controllo. Contemporaneamente può essere utile determinare la riduzione del peso
corporeo degli animali che, essendo correlata alla gravità della malattia, risulta generalmente
inversamente proporzionale all’attività dei farmaci somministrati.
Altre sostanze come il CP-20961 (N,N-dioctadecil-N’,N’-bis-(2-idrossietil)-proparediammina), un
adiuvante sintetico non immunogeno, se sospeso in olio di paraffina, iniettate alla base della coda può
produrre artrite cronica indistinguibile da quella indotta da altri adiuvanti in ratti DA e Lewis. Come
nell’RA, le femmine sviluppano una più severa patologia dei maschi.
Infine, va ricordato che l’utilizzo di animali geneticamente modificati o transgenici per lo studio dell’RA
ha generato nuovi modelli di artrite. Per esempio, un artrite erosiva spontanea è stata descritta in animali
che sovra-esprimono il TNF-α, dato che conferma il ruolo cruciale svolto dalla citochina in questa
patologia. Recentemente è stato descritto, utilizzando linfociti T che esprimono un recettore di membrana
transgenico specifico per l’ovalbumina (OVA), che topi iniettati con cellule Th1 e non Th2 sviluppavano
un'artrite transiente in seguito ad immunizzazione con OVA nella zampa, caratterizzata da iperplasia
sinoviale, infiltrazione cellulare ed erosione della cartilagine. I linfociti T OVA-specifici si accumulano
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nell’articolazione probabilmente esercitando il loro effetto pro-infiammatorio direttamente in loco. La
patologia è accompagnata da una produzione di anticorpi contro il collagene di tipo II. Tuttavia, a
differenza dell’RA questo modello provoca una patologia monoarticolare che interessa solo la zampa
iniettata.
Molti dei modelli animali di artrite erosiva descritti condividono diverse similitudini con RA, ma nessuno
di essi può essere considerato un modello perfetto della patologia umana. Tuttavia, questi modelli
forniscono un'importante opportunità per lo studio dei meccanismi alla base dell’ RA e per lo sviluppo di
nuove terapie.
Altri modelli oltre a quelli di artrite sono utilizzati per lo studio dell’infiammazione cronica immune tra i
quali la pleurite sperimentale cellulo mediata e la reazione di ipersensibilità mista nella sacca d’aria.
Pleurite sperimentale cellulo-mediata
Le reazioni infiammatorie cellulo-mediate possono essere prodotte nel ratto e nella cavia. Le cavie
possono essere sensibilizzate con l’adiuvante completo di Freund, quindi stimolate, da 2.5 a 4 settimane
più tardi, con una iniezione intrapleurica di proteina purificata proveniente dal bacillo della tubercolosi.
Per praticare un’iniezione intrapleurica, di solito viene tagliata la pelle sopra un lato del torace ed
attraverso una piccola incisione tra la 3 e 4 costola, creata con una lama di bisturi, vengono inettati nella
cavità pleurica, usando un ago smussato, 0.1 ml di irritante. L’uso di un ago smussato assicura un
essudato privo di sangue e qualora esso sia presente l’essudato deve essere scartato.
La reazione nella cavità è lenta, e raggiunge il suo massimo 18-24 ore dopo la stimolazione. Una reazione
tipica produce un essudato di 0.5 ml dopo 6 ore dalla stimolazione raggiungendo 5 ml dopo 18 ore e
ritornando quindi lentamente ai valori normali dopo 48-72 ore. L’essudato risulta ricco di cellule
prevalentemente mononucleate.
La reazione da tubercolina non porta ad un rilascio nella cavità pleurica di istamina, ma solo di modeste
quantità di 5-idrossitriptamina il contenuto di prostaglandine diventa massimale dopo 12 ore ed è
correlato al picco della risposta infiammatoria. La totale deplezione dei livelli dei componenti periferici
del complemento non altera lo sviluppo né della reazione cellulare né di quella vascolare.
Le risposte immunitarie cellulo-mediate possono essere prodotte anche nella cavità pleurica dei ratti con il
vaccino della Bordetella pertussis. I ratti sensibilizzati con il vaccino della pertosse, veicolato in
adiuvante incompleto di Freund, vengono successivamente stimolati a livello intrapleurico con il vaccino
della pertosse. Questo causa la formazione di un essudato che è massimale a 48 ore, con una
predominanza di cellule mononucleate. E’ interessante notare che questo è uno dei pochi modelli in cui
l’infiammazione può essere controllata da D-penicillamina, indometacina e lavamisolo. La
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somministrazione di questi tre agenti, prima della sensibilizzazione e per tutto il periodo dello sviluppo
dell’infiammazione, causa una soppressione della risposta da parte di ciascuno dei tre agenti. D’altra parte
una somministrazione singola fatta allo stesso tempo della somministrazione provoca un marcato aumento
della reazione da parte del levamisolo e della D/-penicillamina, mentre l’indometacina provoca ancora
inibizione.
Il vantaggio di questo modello sperimentale è che è facilmente quantificabile, poiché l’essudato si presta
sia ad un’analisi morfologica che biochimica delle cellule coinvolte.
Reazione di ipersensibilità mista nella sacca d’aria al sesto giorno
Le reazioni di ipersensibilità mista possono essere indotte nella sacca d’aria al sesto giorno con il vaccino
della Bordetella pertussis. I ratti vengono sensibilizzati con il vaccino della pertosse in adiuvante
incompleto di Freund e dopo sei giorni, viene creata una sacca d’aria sulla loro superficie dorsale. Per la
creazione di una sacca d’aria è necessario anestetizzare il ratto ed iniettargli 20 ml di aria nella superficie
dorsale, dopo 3 giorni vengono iniettati 10 ml supplementari di aria al fine di sostenere l’infiammazione.
Quando la sacca d’aria è al sesto giorno e gli animali sensibilizzati al dodicesimo, il vaccino della
pertosse viene iniettato nella cavità. La reazione è iniziata da un afflusso iniziale di cellule
polimorfonucleate, alle quali seguono le mononucleate; gli eicosanoidi PGE2 e LTB4 sono presenti
nell’essudato fino al tredicesimo giorno dalla iniezione dell’irritante. Anche qui gli inibitori delle
cicloossigenasi risultano attivi, mentre la D-pennicillamina ha effetti potenziati. Il desametasone inibisce
completamente la risposta.
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