Facoltà di Medicina e Psicologia
Tesi di Dottorato di Ricerca 25°ciclo
Metodologie di Ricerca Sperimentale e Clinica in Oncologia
Studio retrospettivo sulla valutazione della correlazione tra mutazioni
farmacogenomiche relative al metabolismo dei Taxani e tossicità in corso di
trattamento con tali farmaci in pazienti affetti da tumori solidi
Relatore
Chiar.mo Prof. Vincenzo Ziparo
Dottoranda
Valeria Durante
Anno Accademico 2012-2013
INDICE
INTRODUZIONE
3
Il Docetaxel
5
Il Paclitaxel
7
Polimorfismi genetici che influenzano la risposta ai farmaci
Citocromo P450(CYP450)
Citocromo P450 3A4
Citocromo P450 3A5
CYP1B1*3
8
Polimorfismi di CYP450 e metabolismo del Docetaxel
13
Trasportatori di efflusso abc-ABCB1(p-glicoproteina)
16
PARTE SPERIMENTALE
19
MATERIALI E METODI
Criteri di inclusione
Criteri di esclusione
Determinazione del genotipo
Valutazione della tossicità post-trattamento
20
ANALISI STATISTICA
Variabili utilizzate
Metodi statistici
24
RISULTATI
26
CONCLUSIONI
31
DISCUSSIONE
32
BIBLIOGRAFIA
35
2
INTRODUZIONE
I taxani
sono
farmaci
estesamente
rappresentati
nell’ambito
dei
regimi
chemioterapici per numerose neoplasie, sia in fase adiuvante all’interno di schedule
polichemioterapiche sia in fase metastatica per lo più in monoterapia.
I Taxani rappresentano una delle classi farmacologiche più attive nel trattamento
delle neoplasie solide (carcinoma mammario, polmonare, ovarico, prostatico,
gastrico).
Essi derivano dalla Taxus brevifolia, una pianta del nord-ovest del pacifico.
Della famiglia dei taxani fanno parte il Paclitaxel e il Docetaxel, ottenuti attualmente
per via semisintetica da un precursore facilmente disponibile, il 10-deacetil-baccatina
III derivato dagli aghi di Taxus Baccata una pianta europea.
L’attività antitumorale dei Taxani è il risultato del legame del farmaco alle
subunità β della tubulina, che provoca la stabilizzazione della polimerizzazione della
tubulina; questa stabilizzazione causa l’arresto del ciclo cellulare in fase G2/M
inibendo così la mitosi e provoca un ammasso di microtubuli senza formazione di un
fuso mitotico funzionale1.
Diverse osservazioni hanno evidenziato che la diminuzione della densità delle cellule
neoplastiche che segue l’apoptosi indotta dai taxani, si associa ad un aumento del
diametro dei vasi tumorali e ad una riduzione della pressione microvascolare e
interstiziale, il risultato è una maggior penetrazione e distribuzione del farmaco nei
tumori solidi. Vengono, altresì, alterati eventi mediati dal sistema di microtubuli
come: il trasporto intracellulare, la trasmissione di segnali e la motilità della cellula.
I microtubuli sono composti da eterodimeri di α–tubulina e β–tubulina; i taxani
bloccano la divisione cellulare legandosi alla β–tubulina, stabilizzando i microtubuli
e portando la cellula alla morte2. Considerando la farmacologia molecolare dei due
taxani, il docetaxel appare legarsi alla β-tubulina con maggiore affinità ed avere una
più ampia attività antitumorale diretta attraverso un effetto apoptotico mediato dalla
fosforilazione di bcl-2. Inoltre, il docetaxel presenta un tempo di ritenzione più lungo
del paclitaxel nelle cellule tumorali, ciò a causa del maggior assorbimento e del più
lento efflusso.
3
L’efficacia dei regimi di trattamento delle neoplasie solide comprendenti Docetaxel e
Paclitaxel è gravata, tuttavia, dallo sviluppo di importanti effetti collaterali legati al
farmaco fino a tossicità di entità tale da dover interrompere definitivamente l’utilizzo
di queste classi farmacologiche.
Risultano tra le più frequenti le tossicità:
1) Gastrointestinale: stomatite, diarrea, nausea, vomito, disgeusia, stipsi, dolore
addominale, dispepsia, xerostomia. Stomatite e mucosite di grado 2 o 3 si
riscontrano con una percentuale del 10-20%. Nausea e vomito sono
generalmente di lieve entità.
2) Ematologica: alla dose di 100 mg/m² in infusione di 1 ora ogni tre settimane
l’incidenza di neutropenia di grado 4 è pari al 70-80% mentre l’incidenza di
neutropenia febbrile è del 10-15% circa. Altre alterazioni del sangue e del
sistema linfatico riscontrabili sono: anemia, infezioni (comprese sepsi e
polmonite), trombocitopenia ed episodi emorragici, epistassi.
3) Neurologica: la neurotossicità sensitiva e motoria è inferiore al 10% per il
grado 2 o 3; altri segni neurosensoriali di grado da lieve e moderato sono
caratterizzati da disestesia, dolore e/o bruciore; gli eventi neuromotori sono
rappresentati principalmente da debolezza, vertigini e cefalea.
4) Reazioni d’ipersensibilità: la tossicità cutanea (10-12% di grado 3 o 4) si
manifesta principalmente come rash maculo-papulare eritematoso e
pruriginoso che generalmente si distribuisce a livello di avambracci, mani e
piedi, ma anche sotto forma di desquamazione di mani e piedi, di sindrome
mano-piede e di onicopatia.
5) Ritenzione di fluidi: tossicità di frequente riscontro è la ritenzione idrica
(edemi declivi bilaterali, versamento pleurico, pericardico, ascite, aumento di
peso) che può arrivare ad essere un fattore dose limitante. Tale reazione
potrebbe essere dovuta nel docetaxel al polisorbato 80 noto per avere il potere
di alterare la permeabilità delle membrane cellulari. La frequenza di tale
fenomeno, che incide notevolmente sulla qualità di vita del paziente, può
essere ridotta grazie alla premedicazione con corticosteroidi ed alla
prescrizione di diuretici risparmiatori di potassio.
6) Alterazioni del metabolismo e della nutrizione comprendono: anoressia,
4
riduzione dell’appetito, disidratazione, calo ponderale.
7) Soprattutto con la somministrazione settimanale possono manifestarsi:
congiuntivite lieve o moderata, aumento della lacrimazione, artromialgie,
malessere, insonnia ed astenia.
8) Le
alterazioni
dell’apparato
respiratorio
comprendono:
dispnea,
faringolaringodinia, tosse e rinorrea.
Il Docetaxel
Il Docetaxel è formulato in polisorbato 80. Questo analogo del Paclitaxel è di
elevatissima efficacia e presenta una formula che differisce dal paclitaxel per il
gruppo in C10 nell’anello baccatinico e quello in C5 della catena laterale (Fig.1).
Fig. 1 Docetaxel N-debenzil-N-tert-butossicarbanil-10-deacetil paclitaxel
Meccanismo di azione
Il Docetaxel è un farmaco citotossico che promuove la formazione di microtubuli dai
dimeri della tubulina e stabilizza i microtubuli prevenendo la depolimerizzazione.
Questa stabilità provoca l’inibizione della normale riorganizzazione dinamica della
rete dei microtubuli, che è essenziale per l'interfase vitale e per le funzioni mitotiche
cellulari. Inoltre il Docetaxel induce la formazione di anomale matrici di microtubuli
5
o gruppi di microtubuli attraverso il ciclo cellulare interferendo con la normale
funzione di crescita degli stessi. Mentre medicinali come la colchicina causano la
depolimerizzazione dei microtubuli in vivo, il Docetaxel arresta la loro funzione con
il meccanismo opposto stabilizzando la loro struttura. Ciò impedisce alla cellula di
utilizzare il proprio citoscheletro in modo efficiente. In particolare, il Docetaxel si
lega alle β-subunità della tubulina.
La tubulina è il “mattone costitutivo” dei microtubuli ed il legame con il Docetaxel
blocca tale mattone in posizione. Il complesso microtubulo/docetaxel risultante non
ha la possibilità di scomporsi. Ciò influenza negativamente il funzionamento della
cellula perché l’accorciamento ed allungamento dei microtubuli (instabilità
dinamica) è necessario per la sua funzione come via di trasporto per la cellula.
I cromosomi, ad esempio, si affidano a questa proprietà dei microtubuli durante la
mitosi. Ulteriori ricerche hanno indicato che il Docetaxel induce la morte cellulare
programmata (apoptosi) nelle cellule cancerogene legandosi ad una proteina che
arresta l’apoptosi, chiamata Bcl-2 (B-cell leukemia 2), bloccandone così la funzione.
Legame con le proteine
Circa il 94% legato alle proteine, principalmente con α1-glicoproteina acida,
albumina e lipoproteine.
Metabolismo ed eliminazione
Il metabolismo del Docetaxel è essenzialmente epatico. Gli studi in vitro hanno
mostrato che il Docetaxel è metabolizzato dall’isoenzima CYP3A4 (un metabolita
principale, tre minori).
Il Docetaxel è eliminato sia nelle urine che nelle feci, secondo il metabolismo
ossidativo del gruppo estere terz-butilico, ma l’escrezione fecale è la via di
eliminazione principale. Dopo sette giorni l’escrezione urinaria e quella fecale
eliminano rispettivamente il 6% ed il 75% della radioattività somministrata.
6
Il Paclitaxel
Il Paclitaxel è costituito da un anello taxanico o baccatinico a 15 atomi di C legato ad
un anello ossietanico in posizione C4 e C5. In posizione C13 è legato un estere
indispensabile per l’attività antitumorale.
Meccanismo di azione
Il Paclitaxel è un farmaco citotossico con farmacodinamica simile a quella del
Docetaxel; favorisce la polimerizzazione della tubulina legandosi, reversibilmente,
alla subunità β della forma polimerizzata, piuttosto che sui dimeri della tubulina, in
corrispondenza di siti diversi da quelli degli alcaloidi della Vinca. L’aumentata
formazione di microtubuli avviene anche in assenza di GPT, sostanza indispensabile
per la polimerizzazione della tubulina. Il farmaco favorisce, altresì, la stabilizzazione
dei microtubuli inibendone la polimerizzazione. I microtubuli formati sono
disorganizzati e allineati in fasci paralleli. L’effetto sulla cellula è il blocco della
mitosi. Numerosi altri effetti sono legati all’azione sul sistema microtubuli-tubuli in
fasi del ciclo diverse da quella mitotica con alterazione del trasporto intracellulare,
della trasmissione di segnali, della motilità della cellula.
Legame con le proteine
Il Paclitaxel è legato in gran parte alle proteine plasmatiche (>95%). Il legame con le
piastrine è diffuso e saturabile, quello con gli eritrociti è insignificante.
Metabolismo ed eliminazione
Il Paclitaxel è metabolizzato soprattutto attraverso l’idrossilazione epatica (CYP450).
Viene eliminato per via biliare. Il metabolita più importante nel sangue e nella bile è
il 6α-idrossi-paclitaxel. Meno del 10% della dose somministrata è eliminato intatto
nelle urine. La penetrazione nel sistema nervoso centrale è trascurabile mentre
diffonde facilmente nei versamenti.
7
Polimorfismi genetici che influenzano la risposta ai farmaci
Esiste una marcata variabilità, sia interindividuale che inter-etnica nella capacità di
metabolizzare i farmaci.
Tale variabilità rende parzialmente conto delle differenti risposte (il cui range può
variare dalla mancanza di effetti clinici alla comparsa di gravi effetti tossici) alla
stessa dose di farmaco, quotidianamente osservate nella pratica clinica.
Nell’ambito delle modificazioni di natura genetica del metabolismo dei farmaci, si
ritiene che la maggioranza dei geni contenga variazioni casuali della sequenza
nucleotidica tra i diversi individui, sviluppatesi nel corso dell’evoluzione; quando tali
variazioni avvengono nella sequenza codificante o regolatoria, possono portare
all’inserzione di un aminoacido diverso a livello di una specifica posizione nella
proteina e conseguentemente a modificazioni della sua funzione o possono
influenzare i meccanismi di trascrizione e traduzione, modulando quindi i livelli di
espressione dei prodotti genici (mRNA e proteine).
Le variazioni nella sequenza del DNA che sono presenti almeno nell’1% della
popolazione sono definite polimorfismi.
Tali polimorfismi genici danno luogo a enzimi con diversi livelli di attività
metabolica o a recettori con diversa affinità per il farmaco, modificando la risposta
farmacologica di un individuo.
Le variazioni genetiche riguardano più spesso un singolo nucleotide e sono pertanto
definite polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), ma possono interessare anche più
nucleotidi o anche ampi tratti di DNA: si tratta ad es. di sostituzioni, inserzioni,
delezioni, amplificazioni e traslocazioni.
Esse si riferiscono a tratti monogenici, cioè a polimorfismi di un singolo gene
codificante una proteina coinvolta nel metabolismo o nell’effetto di un farmaco, che
causano risposte individuali variabili ai farmaci. Noti esempi dell’importanza di
questi polimorfismi genetici per il trattamento del cancro (ossia variazioni genetiche
che si verificano in più dell’1% della popolazione) sono ad esempio: il gene della
diidropirimidina
deidrogenasi
(DPD)
per
il
5-FU;
il
gene
della
5,10-
metilentetraidrofolato reduttasi (MTHFR) per il metotrexato; il polimorfismo del
gene dell’UDP-glucoronosiltrasferasi1A1 (UGT1A1) rispetto al trattamento con
irinotecano, il gene della glutatione S-transferasi (GST) per il trattamento con
8
cisplatino ed etoposide oltre ad enzimi del citocromo P450 (CYP).
La documentazione sulla variabilità genetica degli enzimi del CYP450 è
notevolmente aumentata negli ultimi anni evidenziando come le capacità ereditate da
questo sistema detossificante possano essere importanti per predire l’esito del
trattamento farmacologico.3
Citocromo P450 (CYP450)
I citocromi P450 sono un gruppo di eme-tiolato monossigenasi: una serie di
isoenzimi localizzati sulle membrane microsomiali del reticolo endoplasmatico liscio
principalmente a livello epatico e/o in tessuti extraepatici, quali il tratto
gastrointestinale, i reni, i polmoni, la cute ed il sistema nervoso centrale, coinvolti
nel sistema di trasporto di elettroni NADPH-dipendente. Esso catalizza una varietà di
reazioni d’ossidazione di componenti non correlate strutturalmente (es. l’ossidazione
in posizione 8 della caffeina, la sulfonidazione dell’omeprazolo o l’idrossilazione in
posizione 1’ e 4’ del midazolam), includendo, inoltre, gli xenobiotici, gli steroidi e
gli acidi grassi.
Tutte le isoforme enzimatiche del citocromo P450 sono proteine contenenti un
gruppo eme, inizialmente identificate come pigmenti rossi (P) poichè producevano
una caratteristica banda di assorbimento spettrofotometrico a 450 nm.
Gli isoenzimi del citocromo P450 sono stati suddivisi in famiglie e sottofamiglie, in
base alla somiglianza strutturale nella sequenza aminoacidica ed indicati con il
prefisso CYP seguito da un primo numero indicante la famiglia, una lettera indicante
la sottofamiglia ed un secondo numero indicante il singolo isoenzima.
Negli ultimi anni sono stati identificati circa trenta CYP, sette dei quali svolgono un
ruolo determinante nel metabolismo dei farmaci.
Citocromo P450 3A4
Nell’uomo la sottofamiglia del CYP3A, posizionata nel cromosoma 7, è responsabile
del metabolismo di circa il 50% dei farmaci.
E’ la sottofamiglia più vasta degli enzimi espressi nel fegato e nell’intestino. Essa
comprende i geni CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43.
I CYP3A rappresentano circa il 30 % di tutti gli isoenzimi del CYP450 presenti a
9
livello epatico ed essendo caratterizzati da un’ampia specificità di substrato,
contribuiscono al metabolismo di circa il 50% dei farmaci utilizzati4,5, tra cui sono
identificati: antidepressivi triciclici, benzodiazepine, calcio-antagonisti, antibiotici
(eritromicina, claritromicina), antistaminici (terfenadina, astemizolo) e molti altri tra
cui i taxani, la ciclosporina, l’alfentanil e il lovastatin.
Il CYP3A4 è anche responsabile del metabolismo di alcuni ormoni endogeni come
ad esempio della 6β-idrossilazione di cortisolo, testosterone e desametasone.
Farmaci quali gli antifungini azolici (ketoconazolo, itraconazolo, fluconazolo),
antibiotici macrolidi (eritromicina, claritromicina, troleandromicina) e la cimetidina
sono potenti inibitori di questa isoforma, anche alcuni flavonoidi naturali presenti nel
succo di pompelmo (narigenina, quercitina) sono in grado di inibire il CYP3A4 e
possono quindi determinare significative interazioni.
Il CYP3A4 è anche soggetto all’effetto induttore di farmaci quali alcuni antiepilettici
(carbamazepina, fenitoina), barbiturici, rifampicina e glucocorticoidi (desametasone),
nonché di alcuni fitoterapici come l’Hypericum Perforatum (o Erba di San
Giovanni).
Riveste un certo interesse il fatto che l’attività del CYP3A4 sembra essere più
elevata nelle donne che negli uomini come dimostrato con il metilprednisolone.
Si deve infine ricordare che il CYP3A4 è l’enzima maggiormente rappresentato a
livello del tratto gastrointestinale, dove può essere responsabile del metabolismo di
molti farmaci (terfenadina, astemizolo, triazolam).
Polimorfismi del CYP3A4 (CYP3A4*1B)
Per il CYP3A4, il più importante membro della sottofamiglia del CYP3A, sono stati
descritti venti polimorfismi genetici basandosi sia sulla specificità del substrato che
sulla quantità di proteina nel fegato, ma tutti questi hanno bassa frequenza allelica
<1% secondo Van Schaik6 rendendoli improbabili target nello screening farmaco
genomico.
L’unica eccezione di questi potrebbe essere la variante allelica del promotore
CYP3A4*1B (392 A>G) originariamente definito CYP3A4-V7 il quale ha una
frequenza allelica del 2-9% nei Caucasici, 35-67% negli Afro-americani ed è raro
negli Asiatici.
Questo polimorfismo è associato ad un moderato incremento di 1,2-1,9 volte della
10
trascrizione e quindi dell’attività, sebbene quest’effetto non sia sempre stato
confermato in altri studi.
Poiché l’espressione del CYP3A è altamente suscettibile all’induzione e all’
inibizione della trascrizione, non è chiaro se la differenza di 1,2-1,9 volte
nell’induzione, dovuta all’allele CYP3A4*1B, contribuisca significativamente alla
variazione osservata di quaranta volte nell’attività in vivo del CYP3A4. L’utilizzo di
un costrutto più piccolo del promotore, usato nell’esperimento di Spurdle8, ha portato
gli autori a non tener conto dell’effetto dell’allele CYP3A4*1B.
Poiché le varianti alleliche del CYP3A4 che codificano significativamente per
un’attività alterata sono veramente rare, ci si deve aspettare solo un ruolo limitato nel
predire l’attività enzimatica del CYP3A4 tramite l’analisi farmacogenetica.
L’unica eccezione sembra essere, per l’appunto, l’allele CYP3A4*1B basato sulla
frequenza allelica e sulla sua associazione con la maggior attività di CYP3A sia
direttamente che dovuta al linkage genetico con l’allele CYP3A5*15.
Citocromo P450 3A5
Il CYP3A5 viene espresso soltanto nel 10-40% dei Caucasici, poiché l’omozigosi
dell’allele CYP3A5*3 provoca uno splicing aberrante e causa l’assenza della
proteina e quindi dell’attività del CYP3A5. La frequenza allelica dell’allele
CYP3A5*3 varia dall’89-94% nei Caucasici, 71-75% negli Est-Asiatici, 60-65%
negli Ispanici, fino al 29-35% nei neri. Attualmente sono stati descritti tredici
polimorfismi genetici, ma il CYP3A5*3 sembra essere la variante allelica maggiore.
L’importanza della genotipizzazione del CYP3A5 dipenderà dal contributo di
quest’enzima al metabolismo dello specifico farmaco mediato dal CYP3A.
Per molti farmaci questo contributo non è del tutto conosciuto, ma degli studi che
identificano differenze interindividuali nei livelli plasmatici del farmaco correlati al
genotipo del CYP3A5, come l’immunosoppressore tacrolimus, dimostrano che la
genotipizzazione del CYP3A5 può dare il suo contributo5.
CYP1B1*3
Alcuni studi sono stati condotti in merito all'associazione tra polimorfismi genetici e
la tossicità ai taxani. In un recente studio condotto da Rizzo et al.9 sono state valutate
11
retrospettivamente 95 pazienti affette da cancro al seno in terapia adiuvante,
metastatica o neoadiuvante con taxani. Si cercava di comprendere se le varianti
alleliche dei geni per CYP2C8 (416 G>A; 792 C>G; 805A>T; 1196 A>G), ABCB1
(1236 C>T; 2677 G>T/A; 3435 C>T) e CYP1B1 (4326 C>G) fossero associate o no
con la tossicità indotta dai taxani nelle pazienti caucasiche affette da cancro al seno.
E’ stata osservata una significativa associazione tra l'allele CYP1B1*3 e la ridotta
ricorrenza di reazioni di ipersensibilità alla terapia con taxani. E’ stato dunque
ipotizzato che l'aumentata produzione da parte del CYP1B1*3 di un metabolita
estrogenico, il 4-idrossiestradiolo (4-OHE2) potesse incrementare la formazione
dell'addotto 4-OHE2-Taxano, riducendo la tossicità ai taxani. L'allele del CYP1B1*3
è associato con un incremento dell'espressione dell'mRNA per il CYP1B1,
dell'attività catalitica e con la maggior affinità per i taxani (che lega, ma non
metabolizza) riducendo la disponibilità del farmaco attivo e la possibile tossicità.
Cosa che potrebbe spiegare l'implicazione del CYP1B1*3 nella protezione da
reazioni di ipersensibilità. Tali studi hanno suggerito che, se confermato in una più
ampia coorte di pazienti, il genotipo CYP1B1 4326 C/G potrebbe influenzare
l'ipersensibilità indotta da taxani e potrebbe rappresentare un biomarker predittore di
ipersensibilità.
12
Polimorfismi dei CYP 450 e Metabolismo del Docetaxel
Il sistema del CYP450, principalmente la sottofamiglia del CYP3A, metabolizza in
maniera estesa il docetaxel per ottenere prodotti inattivi di ossidazione. I dosaggi di
docetaxel usati nella pratica clinica provocano neutropenia di grado 3/4 nella
maggior parte dei pazienti: nel 56% dei pazienti con cancro alla mammella
metastatico trattati con 60 mg/m2 , nel 65% dei pazienti con cancro al polmone non a
piccole cellule con 75 mg/m2 e nel 95% dei pazienti con cancro al seno che
assumono 100 mg/m2 di docetaxel; mentre altri effetti avversi includono alopecia,
astenia, reazioni dermatologiche, ritenzione dei fluidi, reazioni di ipersensibilità,
neuropatie motorie e sensoriali, stomatiti e diarrea.10
Un importante svantaggio nell’uso di docetaxel è l’ampia variabilità interindividuale
nell’efficacia e nella tossicità. L’eliminazione del docetaxel avviene principalmente
tramite conversione metabolica per opera del CYP3A4 e CYP3A5, portando alla
formazione di metaboliti caratterizzati da un’attività citotossica ridotta (Fig.2).
Fig. 2 Metabolismo del Docetaxel
L’escrezione avviene principalmente tramite bile e feci (75%) e solo in piccola parte
per via urinaria (<5%).
13
La biotrasformazione è quindi la via principale di eliminazione del docetaxel che lo
rende un farmaco interessante per l’investigazione nei polimorfismi degli enzimi del
CYP450. Il contributo quantitativo stimato del CYP3A4/5 al metabolismo del
docetaxel nel polmone umano è 64-93%, ciò lo rende la maggior sottofamiglia del
CYP450 nell’eliminazione del docetaxel.11 Ad alte concentrazioni anche il CYP2C8
può avere un ruolo nell’eliminazione del farmaco.
L’affinità del CYP3A4 per il docetaxel è molto maggiore rispetto a quella del
CYP3A5 e per questo si può dire che il CYP3A4 ha la maggior capacità
metabolizzante.
In accordo con ciò, Goh et Al12 hanno esaminato la correlazione tra l’allele
CYP3A5*3 e la clearance del docetaxel nei pazienti asiatici malati di cancro e non
hanno osservato relazioni tra clearance e status genotipico del CYP3A5*3 con i
pazienti con CYP3A5*1/*1 (n=3), CYP3A5*1/*3 (n=13) e CYP3A5*3/*3 (n=9).
La scoperta è stata confermata da un altro studio13 condotto su 21 pazienti caucasici
malati di cancro, dimostrando che il metabolismo del docetaxel dipende solo per una
piccola frazione dall’attività del CYP3A5.
Nell’analisi NONMEM sul docetaxel condotta su 92 pazienti14 non è stato possibile
dimostrare una correlazione tra la clearance del docetaxel e la variante allelica
CYP3A4*1B nei pazienti che hanno ricevuto docetaxel in combinazione con
desametasone che è un debole induttore del CYP3A4.
L’assenza di correlazione con CYP3A5*3 è stata d’altra parte comunque confermata
nello studio di Tran et al. nel 200615 dove si è visto che la combinazione del genotipo
del CYP3A4 e del CYP3A5 ha rilevato una correlazione significativa: i portatori
dell’ aplotipo CYP3A4*1B / CYP3A5*1 avevano una clearance significativamente
maggiore. Questo effetto sembrava correlare con l’allele CYP3A4*1B e non molto
con l’allele CYP3A5*1, ciò concorda con l’aumento della trascrizione dell’allele
CYP3A4*1B in rapporto all’allele wild-type CYP3A4*1A.16,17
Sebbene tutti gli individui CYP3A4*1A/*1B fossero portatori dell’allele CYP3A5*1
l’analisi di 11 individui CYP3A5*1/*3 contro i 47 individui CYP3A5*3 non hanno
dimostrato differenze statistiche nella clearance del docetaxel tra i due gruppi
d’analisi, suggerendo che l’effetto sia stato causato dal polimorfismo del CYP3A4
piuttosto che dall’allele CYP3A5*1.
14
Recentemente le scoperte sulla combinazione allelica CYP3A4*1B / CYP3A5*1
sono state confermate in altri studi su 92 pazienti caucasici malati di cancro18,
mostrando una clearance del docetaxel aumentata del 64% nei portatori
CYP3A4*1B / CYP3A5*1 comparati ai portatori di CYP3A4*1A / CYP3A5*3.
Sebbene siano stati osservati degli effetti solo per i portatori di CYP3A4*1B/
CYP3A5*1, l’aplotipo combinato ha mostrato un effetto maggiormente pronunciato.
Apparentemente esiste proprio un’influenza del polimorfismo genetico CYP3A4/5
sulla clearance del docetaxel, sebbene l’impatto clinico debba essere ancora chiarito.
E’ stato di grande interesse osservare che il sesso fosse il fattore di maggior
correlazione con la clearance del docetaxel19, ciò indica anche la necessità di
analizzare l’effetto del polimorfismo genetico in maniera separata tra uomini e
donne.
15
Trasportatori di efflusso abc – abcb1 (p-glicoproteina)
La superfamiglia dei trasportatori di efflusso ABC consiste di circa 50 tipi di
trasportatori divisi in 7 sub-famiglie.
Il trasportatore meglio caratterizzato è l’ABCB1 (detto anche MDR1 o Pglicoproteina/P-gp)20. Questa proteina fu inizialmente scoperta come un trasportatore
ad efflusso coinvolto nella farmaco resistenza (multidrug resistance) delle cellule
tumorali 21(Fig.3).
Fig. 3
Ad ogni modo, l'ABCB1 è anche fisiologicamente espressa sulla superficie delle
cellule epiteliali di vari organi responsabili della distribuzione dei farmaci come
l'intestino, il fegato ed i reni, ma anche negli endoteli capillari della barriera
ematoencefalica e della barriera del fluido cerebro-spinale.22 E' inoltre presente sulla
superficie apicale delle cellule endoteliali in genere, controllando la disponibilità dei
farmaci nell'interfaccia tra sangue e tessuti.
Di conseguenza, ABCB1 è anche coinvolta nel metabolismo del farmaco, avendo un
ruolo nella cosiddetta fase zero (efflusso dei farmaci non modificati) del
metabolismo degli xenobiotici23.
La funzione della P-gp è di ridurre l’accumulo di alcuni farmaci a livello
intracellulare o d’organo attraverso un sistema di efflusso attivo, così da ridurre i
livelli effettivi di farmaco nel sito target.24
16
La P-gp è importante nello studio della farmacogenetica di molte classi di farmaci a
causa della significativa variabilità interindividuale nell’espressione e nella
funzionalità della proteina stessa.
Ad esempio l’espressione dell’mRNA ABCB1 nel fegato in soggetti sani può variare
di 200 volte, con corrispondente variazione del livello proteico da 20 a 50 volte.25
Analogamente l’espressione della P-gp varia da 2 a 10 volte a livello intestinale.26
Questa variabilità è probabilmente sostenuta dalla presenza di polimorfismi del gene
ABCB1. Il gene ABCB1 che codifica per la proteina P-gp è altamente polimorfico,
con più di 100 SNP identificati e ciascuno può determinare cambiamenti
dell’espressione e/o della funzione del trasportatore.
La posizione e la frequenza dei più comuni SNP del gene ABCB1 sono stati descritti
in recenti review da Kerb e Cascorbi.27, 28
Il più studiato polimorfismo genetico dell’ABCB1 è quello posizionato nell’esone 26
e denominato C3435T, che è stato osservato nel 50-60% della popolazione
caucasica, nel 40-50% degli Asiatici e nel 10-30% degli Africani.29
Alcuni studi hanno rivelato che nella popolazione caucasica la variante allelica si
associa ad una riduzione della produzione di mRNA e dell’espressione proteica nel
rene30, nei linfociti31, negli epatociti32, nella placenta33 e nel duodeno.34
L’effetto di queste alterazioni non è però stato descritto in maniera univoca e
richiede ulteriori conferme.35 Nonostante ciò, Wang et al.36 hanno dimostrato con
forte evidenza che il polimorfismo 3435 può alterare la stabilità dell’ABCB1 mRNA,
rivelando che la variante allelica 3435T è associata a bassi livelli di mRNA, come
risultato di un effetto sulla struttura secondaria dell’mRNA stesso.
La differente espressione di P-gp potrebbe avere un impatto sull’assorbimento e sulla
distribuzione dei farmaci, determinando un maggior assorbimento e concentrazioni
plasmatiche più elevate degli stessi.37,38
Può essere ipotizzato che l'ereditarietà del polimorfismo nel trasporto del farmaco del
gene ABCB1 possa interferire con le variazioni individuali alla risposta
farmacologica dei pazienti
trattati con taxani. Questi ultimi sono, infatti, un
substrato per il trasportatore ABCB1 (ATP Binding cassette) 39.
Nello studio condotto da A. Fajac et al.40 è stata osservata un'associazione molto
significativa ma ristretta alle donne in premenopausa, tra la farmacocinetica del
17
docetaxel ed il polimorfismo C3435T, poiché le pazienti con genotipo CC
presentavano valori medi più bassi dell'AUC del docetaxel rispetto alle pazienti con
genotipo CT e TT (P<0,0001).
Il genotipo 3435CC è solitamente associato ad alti livelli di ABCB1 mRNA e di
proteina. Esso è correlato inoltre all’aumento dell’efflusso di docetaxel in tessuti
normali e tumorali, il che comporterebbe la maggiore eliminazione del farmaco e di
conseguenza la più bassa AUC.41,42,43,44,45
Il meccanismo con cui questo polimorfismo sinonimo influisce sulla funzione di
ABCB1 potrebbe essere una ridotta stabilità dell’mRNA della variante 3435T e /o un
cambiamento conformazionale del sito di legame con il substrato della proteina
variante ABCB1.
Inoltre, una significativa associazione tra il polimorfismo C1236T e la clearance del
docetaxel è stata riportata da Bosc et al. nel 200646. Le pazienti, omozigoti per
l’allele T, hanno presentato una clearance inferiore del docetaxel pur non
raggiungendo la significatività statistica.
18
PARTE SPERIMENTALE
L’obiettivo primario del nostro studio è stato quello di correlare i profili
farmacogenomici relativi al metabolismo dei taxani con particolare riferimento al
Docetaxel con le tossicità dose limitanti riportate dai pazienti in corso di trattamento
chemioterapico in fase metastatica e adiuvante. Ad oggi sono numerosi gli studi che
tendono a stabilire un comune filo conduttore tra tossicità, attività clinica e
farmacocinetica dei Taxani. Per una miglior comprensione di questo fenomeno e sul
perché solo alcuni pazienti sviluppano severe tossicità dose limitanti, sono state
analizzate in maniera dettagliata le innumerevoli vie metaboliche del farmaco
all’interno della cellula, con attenzione verso i principali citocromi deputati al
metabolismo dello stesso, in particolare i citocromi CYP3A4, CYP3A5 ed il
trasportatore transmembrana ABCB1.
Presso l’U.O. di Oncologia dell’Azienda Ospedaliera Sant’Andrea, i pazienti
candidabili ad effettuare un trattamento chemioterapico convenzionale basato
sull’uso di taxani per neoplasie solide in fase adiuvante o metastatica, sono stati
preventivamente sottoposti all’analisi genomica dei principali citocromi deputati al
metabolismo dello stesso, in particolare i citocromi CYP3A4, CYP3A5 ed il
trasportatore transmembrana ABCB1, che ne influenzano l’attività e la tossicità.
Lo studio è un osservazionale retrospettivo che non ha previsto l’uso di esami
strumentali aggiuntivi, né costi aggiuntivi a carico del Servizio Sanitario Nazionale.
I pazienti sono stati trattati, nell’ambito della comune pratica clinica, su indicazione
dei clinici. I dati sui pazienti sono stati raccolti senza interferire con le procedure
diagnostiche e terapeutiche, poiché il protocollo ha previsto la valutazione
retrospettiva di tutti quei pazienti che tra il 2006 ed il 2012 hanno effettuato un
trattamento con regimi chemioterapici contenenti derivati dei taxani attraverso
l’analisi delle cartelle cliniche. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico
dell’Azienda Ospedaliera “Sant’Andrea” di Roma. L’obiettivo primario dello studio
è la correlazione tra i profili farmacogenomici relativi al gene del trasportatore
transmembrana ABCB1 dei taxani e le tossicità riportate in corso di trattamento con
tali farmaci chemioterapici in fase adiuvante o metastatica.
19
MATERIALI E METODI:
Nello studio sono stati presi in esame pazienti con tumori solidi in fase adiuvante o
metastatica sottoposti a trattamento chemioterapico con derivati dei taxani dal 2006
al 2012 per i quali è stata effettuata la valutazione genomica dell’enzima:
-
ABCB1 (3435 C> T)
I risultati della valutazione genomica non hanno in alcun modo influenzato la scelta
del regime o del dosaggio terapeutico del farmaco.
Criteri di inclusione
-
Consenso informato al trattamento chemioterapico firmato e datato personalmente
dal paziente prima dell’avvio del trattamento chemioterapico
-
Età ≥18 anni, maschio o femmina
-
Conferma istologica di tumore solido
-
ECOG Performance status (PS) 0- 1
-
Pazienti in trattamento chemioterapico contenente Docetaxel o Paclitaxel in fase
adiuvante o metastatica
-
Neuropatie periferiche di grado ≤1
-
Parametri ematologici e chimici nella norma secondo range di laboratorio
-
Clearance della creatinina (calcolata) > 50 ml/min
-
I pazienti dovevano essere sottoposti ad almeno 3 cicli di chemioterapia a base di
taxani
Criteri di esclusione:
-
Altre neoplasie maligne (eccetto carcinoma cutaneo basocellulare e carcinoma
della cervice uterina adeguatamente trattati) diagnosticate entro i 5 anni
precedenti
-
Malattie metaboliche non compensate, disfunzioni fisiche o esami di laboratorio
che possano pregiudicare l’uso di uno dei trattamenti sperimentali o possano,
20
secondo il giudizio dello sperimentatore, portare a complicazioni durante il
trattamento stesso
-
Storia di disabilità psichiatrica giudicata dall’investigatore come clinicamente
rilevante che possa precludere la compliance dello studio o il consenso
informato
-
IMA recente, cardiopatia ischemica sintomatica, aritmia
-
Abuso di droghe o alcool
-
Gravidanza o allattamento
Determinazione del genotipo
Tutti i pazienti appartenenti allo studio sono stati sottoposti a prelievo venoso di
sangue periferico nel giorno in cui effettuavano l’infusione del Taxano (giorno 1).
Il DNA genomico è stato isolato da campioni di sangue periferico utilizzando
l’estrattore automatico X-tractor Gene (Corbett Life Science, Australia).
Il polimorfismo ABCB1 C3435T è stato genotipizzato utilizzando la tecnologia
Pyrosequencing (Pyrosequencer PyroMark ID system - Biotage AB and Biosystems,
Uppsala, Sweden). Il sistema Pyrosequencing consente il monitoraggio in tempo
reale della sintesi di DNA, mediante il rilevamento della bioluminescenza prodotta al
termine di una cascata di reazioni enzimatiche, la quale, a sua volta viene innescata
dall’incorporazione di un nucleotide. L’intensità del segnale luminoso è direttamente
proporzionale al numero delle basi introdotte dalla polimerasi nel nuovo filamento di
DNA che si va formando per estensione del primer di sequenziamento appaiato al
prodotto di amplificazione denaturato.
I primers forward e reverse e il primer di sequenziamento sono stati disegnati
utilizzando il software PSQ Assay Design (Biotage AB and Biosystems, Uppsala,
Sweden). Sono stati utilizzati i seguenti primers: 5’-ATTGCCTATGGAGACAAC3’,
5’-TTACATTAGGCAGTGACTC-3’ come forward e reverse primers e 5’-
CTTTGCTGCCCTCAC-3’ come primer di sequenziamento. Il primer forward è
biotinilato al 5’. In breve, la regione genomica contenente il polimorfismo da
analizzare è stata amplificata mediante PCR utilizzando il seguente metodo:
denaturazione iniziale di 1 minuto a 95°C, 40 cicli di 20 secondi a 95 °C, 25 secondi
a 56 °C e 30 secondi a 72 °C; una fase finale di estensione di 5 minuti a 72°C.
21
La reazione di PCR è stata effettuata in un volume di 50 microlitri contenenti 40
nanogrammi di DNA genomico, 10 pmol di ogni primers, 0.2M di dNTPs, 1,5mM di
MgCl2 PCR buffer e 1,5 unità di Taq polimerasi (Takara Bio Inc. Otsu, Japan).
Il DNA a singolo filamento è stato isolato dalla reazione di PCR utilizzando la
Pyrosequencing Vacuum Prep Workstation (Biotage) e le biglie di streptavidina
coniugate a separosio (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) che legano la
biotina associata al primer biotinilato utilizzato come primer forward della reazione
di PCR. Dopo un breve lavaggio in etanolo 70%, incubazione nella soluzione di
denaturazione prima e in soluzione di lavaggio poi, le biglie (coniugate al DNA a
singolo filamento) vengono rilasciate nella piastra contenente il primer di sequenza.
L’annealing viene effettuato incubando la piastra a 80°C per 2 minuti e consentendo
poi al campione di raffreddarsi fino a raggiungere la temperatura ambiente. A questo
punto la piastra è pronta per essere processata dal Pyrosequencer che effettuerà il
sequenziamento del frammento di DNA e consentirà così di caratterizzare il sito
polimorfico.
Valutazione della tossicità post-trattamento
In giorno 14 e giorno 20 post trattamento i pazienti sono stati sottoposti a valutazione
clinica ed analisi ematochimiche per il rilevamento delle relative tossicità correlate al
farmaco.
Sulla base della valutazione degli esami ematochimici e della valutazione clinica i
pazienti sono stati avviati a prosecuzione delle cure secondo medesima schedula o
con modificazione della dose secondo tossicità riportata, sotto supervisione e cura
dell’oncologo curante.
Le tossicità (ematologiche e non ematologiche) sono state registrate secondo i
CTCAE (Common terminology criteria for adverse events v 3.0) che prevedono 5
gradi (Tab 1).
22
BASSA
Grado 0
Nessun evento avverso
Grado 1
Evento avverso lieve
Grado 2
Evento avverso moderato
Grado 3
Evento avverso severo
Grado 4
Evento
ALTA
avverso
che
mette in
pericolo la vita o invalidante
Grado 5
Morte correlata all’evento avverso
Tab.1 CTCAE v3.0 (National Cancer Institute, NCI)
Le tossicità sono state raggruppate in due gruppi: tossicità bassa (comprendente G0,
G1, G2) e tossicità alta (comprendete G3, G4, G5).
23
ANALISI STATISTICA
L’analisi statistica ha previsto inizialmente un’analisi descrittiva delle caratteristiche
demografiche, biologiche, terapeutiche della popolazione in studio. In un secondo
momento la popolazione è stata suddivisa in tre sottogruppi (secondo il genotipo) per
confrontarne il profilo di tossicità in termini di significatività statistica.
Variabili utilizzate
Secondo la metodologia statistica il grado di tossicità rappresenta la variabile
dipendente, ossia di esito, mentre le variabili indipendenti sono rappresentate dai
“fattori di rischio” (definiti dall’ipotesi di studio), più una serie di variabili definite
“confondenti”. Queste ultime sono in grado di modificare il grado di tossicità in
maniera indipendente dal fattore di rischio (per esempio un trattamento
polichemioterapico può modificare in maniera imprevista il grado di tossicità).
(Tab.2)
VARIABILI
Sesso
Femmine
Maschi
Fattori
confondenti
Età
Stadio di malattia
Metastatici
Non metastatici
Tumore primitivo
Mammella
Altro
Schema terapeutico
Mono
Poli
Polimorfismo ABCB1 C3435T
C/C
C/T
T/T
Fattore di rischio
studiato
Tossicità
Bassa (G0, G1, G2)
Alta (G3, G4, G5)
Variabile di esito
Tab.2 Variabili considerate nello studio
24
Metodi statistici
Lo studio descrittivo ha previsto il confronto tra i tre gruppi genotipici in relazione
alla percentuale di soggetti con alta e bassa tossicità. Per valutare le differenze tra
questi gruppi è stato utilizzato un metodo grafico (istogrammi di frequenza)
supportato dai seguenti metodi statistici:
-
Test del χ² per valutare se esiste un’associazione statisticamente significativa tra
appartenenza genotipica e grado di tossicità (se p<0,05 le due variabili sono
correlate in maniera statisticamente significativa).
-
Analisi della Varianza utilizzata per valutare se la media dell’età differisce in
maniera statisticamente significativa tra i due gruppi di tossicità (se p<0,05 la
differenza tra le due medie è statisticamente significativa).
Lo studio analitico ha previsto la stima della misura dell’incremento del rischio di
sviluppare un alto grado di tossicità che si ha nell’appartenere al gruppo degli esposti
ad un determinato fattore di rischio (nel nostro caso i genotipi C/C, C/T) rispetto al
gruppo dei non esposti (genotipo T/T). Tale parametro di stima viene indicato come
OR (Odds ratio).
Si calcolerà un OR grezzo dove la stima del rischio dipende da una sola variabile alla
volta (fattori di rischio o fattori di confondimento): ad esempio tossicità (alta, bassa)
come funzione del genotipo; tossicità (alta, bassa) come funzione dello stadio di
malattia.
Lo studio analitico si conclude con la Regressione Logistica Multivariata che
permette di creare un modello nel quale il grado di tossicità viene messo in relazione
con più variabili contemporaneamente (fattori di rischio e fattori confondenti): ad
esempio tossicità (alta, bassa) come funzione del genotipo, dello stadio di malattia,
dello schema di chemioterapia.
Gli OR che derivano da questa regressione si definiranno “OR corretti” poiché tale
stima tiene conto del contributo di tutte le variabili incluse nel modello.
25
RISULTATI
Nello studio sono stati reclutati 182 pazienti adulti (12 maschi e 170 femmine) con
un’età media di 58 aa (range 30-82) . Il 99% dei pazienti era di etnia caucasica.
I pazienti che hanno ricevuto chemioterapia a base di taxani sono stati 95 (52%) nel
setting adiuvante e 87(48%) in quello metastatico.
La popolazione è stata rappresentatata da 152 pazienti (84%) affette da neoplasia
maligna mammaria e 30 pazienti (16%) da altri tumori (carcinoma gastrico,
carcinioma polmonare, carcinomi genito-urinari).
I pazienti sottoposti ad un regime monochemioterapico comprendente Docetaxel o
Paclitaxel secondo schedule settimanali o trisettimanali sono stati 54 (30%) mentre
128 pazienti (70%) sono stati sottoposti a regimi polichemioterapici nei quali i taxani
sono stati associati ad altri agenti chemioterapici (Cisplatino, Carboplatino,
5Fluorouracile) e/o ad agenti biologici (Bevacizumab, Trastuzmab) dalla prima alla
quarta linea di trattamento.
I polimorfismi del gene ABCB1 C3435T all’interno della popolazione sono risultati
così distribuiti : 48 pazienti (26%) omozigoti C/C, 82 pazienti (45%) eterozigoti C/T,
52 pazienti (29%) omozigoti per la variante allelica T/T .
In 96 pazienti (53%) abbiamo registrato una bassa tossicità mentre in 86 pazienti
(47%) una tossicità alta. Nel nostro studio non abbiamo registrato nessun evento
avverso classificato come G5 (Tab.3).
26
VARIABILI
PAZIENTI
(N=182)
n
(%)
170
12
93
7
Sesso
Femmine
Maschi
Età
Mean = 58,0
Min-Max = (30-82)
n
(%)
Gruppo Etnico
Caucasico
Africana
Stadio di malattia
Metastatici
Non metastatici
181
1
99
1
87
95
48
52
Tumore primitivo
Mammella
Altro
152
30
84
16
Schema terapeutico
Mono
Poli
54
128
30
70
Polimorfismo ABCB1 C3435T
C/C
C/T
T/T
48
82
52
26
45
29
Tossicità
Bassa (G0, G1, G2)
Alta (G3, G4)
96
86
53
47
Tab. 3 Caratteristiche dei pazienti
27
La nostra attenzione è stata rivolta verso la tossicità alta. I gradi G3 e G4 di tossicità
sono quelli che incidono nella pratica clinica determinando riduzione del dosaggio
dei trattamenti, rinvio fino alla sospensione del trattamento stesso per comparsa di
eventi avversi gravi che possono richiedere l’ospedalizzazione, interventi chirurgici,
sequele invalidanti fino a mettere in pericolo la vita del paziente.
Fig. 4 Distribuzione percentuale dei due gradi di tossicità all’interno di ciascun gruppo
genotipico considerando l’intera popolazione.
Dalla Fig. 4 si nota come la percentuale di pazienti che sviluppano alta tossicità sia
molto più bassa nel genotipo T/T (34,62%) rispetto al genotipo C/C (50%) e al
genotipo C/T (53,66%).
La differenza tra le percentuali di alta tossicità tra T/T e C/T è statisticamente
significativa (p=0,03).
Questa differenza potrebbe essere la risultante dell’azione di altri fattori confondenti.
28
Innanzitutto considerando la primitività tumorale si è visto che l’84% del campione è
rappresentato da pazienti affette da carcinoma mammario. Per tale motivo le
successive analisi verranno effettuate su questo sottogruppo che è composto solo da
pazienti di sesso femminile.
Fig. 5 Distribuzione percentuale dei due gradi di tossicità all’interno di ciascun
gruppo genotipico, considerando solo la popolazione di pazienti affette da
carcinoma mammario.
Dalla Fig. 5 osserviamo come la percentuale di pazienti che sviluppano alta tossicità
sia molto più bassa nel genotipo T/T (34,09%) rispetto al genotipo C/C (56,1%) e al
genotipo C/T (55,22%). Queste differenze risultano più accentuate rispetto a quelle
osservate nell’intera popolazione (Fig. 4).
Infatti, non solo la differenza tra le percentuali di alta tossicità del genotipo T/T e
C/T è statisticamente significativa (p=0,03) ma anche quella tra T/T e C/C (p=0,04).
29
Per la stima del rischio di sviluppare alta tossicità, l’età non è stata considerata come
variabile di confondimento in quanto la differenza tra le età medie nei due gruppi di
tossicità non è statisticamente significativa (p=0,33) (Tab.4).
Variabile
Età media
(min-max)
Tossicità
Bassa
Alta
56,5
(30-79)
58,4
(36-82)
La differenza tra le età medie
nei due gruppi di tossicità non è
statisticamente
significativa
(p=0,33)
Tab.4
Come si può vedere dalla successiva tabella 5, il rischio di sviluppare alta tossicità
non sembra dipendere dallo stadio di malattia; infatti, il gruppo dei “non metastatici”
ha un incremento del rischio di solo 1,1 volte rispetto a quello dei metastatici non
raggiungendo tuttavia la significatività statistica OR=1,1 (95% CI 0,6-2,0 p=0,84).
Variabili
Stadio di malattia
Metastatici
Non metastatici
Schema terapeutico
Mono
Poli
Polimorfismo ABCB1
C3435T
C/C
C/T
T/T
Tossicità
Bassa
n (%)
Alta
n (%)
31 (40,3)
46 (59,7)
29 (38,7) 1 (riferimento)
46 (61,3) 1,1 (0,6-2,0)(p=0,84)
1 (riferimento)
1,1 (0,6-2,1) (p=0,78)
17 (22,1)
60 (77,9)
22 (29,3) 1,5 (0,7-3,0) (p=0,31)
53 (70,7) 1 (riferimento)
1,3 (0,6-2,9) (p=0,43)
1 (riferimento)
18 (23,4)
30 (39,0)
29 (37,7)
23 (30,7) 2,5 (1,0-5,9) (p=0,04)
37 (49,0) 2,4 (1,1-5,2) (p=0,03)
15 (20,0) 1 (riferimento)
2,5 (1,0-5,9) (p=0,04)
2,3 (1,0-5,1) (p=0,04)
1 (riferimento)
OR grezzo
(95%CI)
OR corretto
(95%CI)
Tab. 5
L’essere stati sottoposti a monochemioterapia sembrerebbe incrementare il rischio di
1,5 volte rispetto ai pazienti sottoposti alla polichemioterapia, questo risultato non è
statisticamente significativo OR=1,5 (95% CI 0,7-3,0 p=0,31).
L’unica variabile che risulta associata alla tossicità in maniera statisticamente
significativa è il genotipo.
30
I pazienti con genotipo C/C hanno un rischio di sviluppare una tossicità alta di 2,5
volte rispetto a quelli con genotipo T/T OR=2,5 (95% CI 1,0-5,9 p=0,04).
Invece i pazienti con genotipo C/T hanno un rischio di sviluppare una tossicità alta di
2,4 volte rispetto ai pazienti con genotipo T/T OR=2,4 (95% CI 1,1-5,2 p=0,03).
Consideriamo ora il modello di regressione logistica, dove il rischio associato a
ciascuna delle tre variabili presenti in tabella tiene conto anche delle interazioni tra di
esse (OR corretto).
Si nota come la quasi totalità della variabilità statistica della tossicità sia spiegata
dalla variabilità genotipica con valori simili a quelli dell’analisi univariata (C/C:
OR= 2,5 (95% CI 1,0-5,9 p=0,04) ; C/T: OR=2,3 (95% CI 1,0-5,1 p=0,04) (Tab.5).
CONCLUSIONI
I risultati del nostro studio mostrano che il polimorfismo C3435T di ABCB1 correla
in maniera statisticamente significativa con le tossicità alte registrate. I genotipi C/C
e CT hanno un rischio maggiore di sviluppare tossicità di grado 3 e grado 4.
Sono necessari ulteriori studi e campioni più numerosi per confermare e validare il
dato e per dimostrare che tale polimorfismo possa rappresentare un fattore predittivo
di tossicità al trattamento con schedule contenenti taxani.
E’ necessario inserire nell’analisi farmacogenomica non solo il gene della proteina
responsabile dell’efflusso del farmaco ma anche i geni coinvolti nel metabolismo
dello stesso.
31
DISCUSSIONE
L’obiettivo del nostro studio è stato individuare le relazioni potenziali tra
polimorfismi dell’esone 26 (C3435T)
del trasportatore ABCB1 e le tossicità
registrate nel corso di trattamenti con schemi terapeutici contenenti taxani.
Le analisi hanno rilevato correlazioni “genotype-related” nelle pazienti affette da
tumore della mammella con un maggior rischio di sviluppare tossicità nei genotipi
C/C e C/T rispetto al genotipo T/T.
Questo dato è apparentemente in disaccordo con la letteratura che dimostra come il
genotipo 3435CC sia di solito associato a più alti livelli di mRNA per ABCB1 e con
un aumentato efflusso del farmaco nei tessuti normali e tumorali; di conseguenza una
minore esposizione al farmaco dovrebbe determinare una minore tossicità nei
soggetti omozigoti C/C rispetto ai portatori di almeno un allele variante. Ha senso
osservare una minore AUC del Docetaxel nei pazienti omozigoti C/C, dato che alti
livelli di ABCB1 negli organi coinvolti nel metabolismo del farmaco determinano un
efflusso maggiore dei taxani, un’eliminazione del farmaco più alta e di conseguenza
una più bassa AUC47.
Il meccanismo attraverso il quale questo polimorfismo modifica la funzione del
trasportatore potrebbe essere legato ad una minore stabilità dell’mRNA nel genotipo
T/T. I dati della letteratura a riguardo sono controversi e il limite maggiore è legato
alla numerosità dei campioni, trattandosi di popolazioni molto esigue.
Nakamura et al. hanno studiato l’effetto del polimorfismo C3435T sui livelli di
espressione di mRNA della proteina MDR1. Nello studio condotto su 13 soggetti
sani giapponesi hanno evidenziato come la concentrazione di mRNA di MDR1 sia
maggiore nei soggetti T/T rispetto al genotipo C/C e C/T 48.
Nello studio di Tsai et al. condotto su 59 pazienti giapponesi affette da carcinoma
mammario e trattate con chemioterapia contente taxani, si è osservato come le
pazienti ABCB1 3435C/C tendessero a sviluppare un grado maggiore di neutropenia
rispetto ai genotipi contenenti almeno un allele T (p=0.057)49.
Al contrario nello studio di Tran et al. condotto su 58 pazienti trattati con taxani, la
neutropenia G3 veniva registrata più frequentemente nei pazienti con il genotipo
3435T/T MDR1 (TT 100%, CT 77,3%, CC 54,5% p=0.046)50.
32
In uno studio retrospettivo condotto su 182 pazienti non è stata trovata una
correlazione statisticamente significativa tra il polimorfismo C3435T e le tossicità
registrate (neutropenia e neuropatia)51.
Gli studi mostrano inoltre come non ci sia una correlazione statisticamente
significativa tra la variabilità interindividuale nella farmacocinetica dei taxani e la
presenza del polimorfismo C3435T per il gene ABCB152.
Ciò sembrerebbe giustificare l’esistenza di meccanismi compensatori di efflusso dei
farmaci, forse attraverso ABCC2 (MRP2) ed altri trasportatori non noti, che
regolerebbero l’eliminazione epatica dei taxani nei pazienti con un’alterata funzione
di ABCB1 legata alle varianti genetiche53.
La discordanza dei dati della letteratura potrebbe dipendere dal fatto che per il
trasportatore di membrana ABCB1 non esiste solo il polimorfismo da noi analizzato
ma almeno altri 4 (T-129C, A61G, C1236T, G2677T7A) ed inoltre il metabolismo
dei taxani non passa solo attraverso i trasportatori di membrana ma anche attraverso
il Citocromo P450 ed i suoi polimorfismi come CYP3A4 * 1B (A> G ), CYP3A5 *
3 (G> A), CYP2C8.
Questo potrebbe spiegare il motivo per cui nel nostro studio il genotipo T/T,
nonostante abbia un efflusso del farmaco più lento e un cambiamento
conformazionale del sito di legame del trasportatore ABCB1 con il substrato,
sviluppi un rischio minore di tossicità al trattamento. Questo poiché ci sono tante
altre vie attraverso le quali il farmaco viene eliminato e metabolizzato e si potrebbe
ipotizzare che proprio nel genotipo T/T i meccanismi compensatori siano amplificati.
Concludendo nel nostro studio abbiamo dimostrato che il polimorfismo di ABCB1
3435 C>T sembra essere un marcatore predittivo di tossicità ai taxani.
Il nostro studio vuole sottolineare l’importanza di indagare le conseguenze funzionali
di polimorfismi genetici delle proteine per una migliore caratterizzazione ed
interpretazione dell’effetto dei Taxani nella pratica clinica. Abbiamo visto come un
polimorfismo allelico per il trasportatore ABCB1 porti a variazioni di tossicità da
farmaco che rappresenta un limite importante nella gestione clinica dei pazienti in
trattamento con farmaci antiblastici.
Il risultato di questo studio, insieme ad ulteriori analisi complementari, rappresenta
un importante parametro di valutazione ai fini del miglioramento della tollerabilità
33
del farmaco in termine di riduzione dell’incidenza di tossicità dose limitanti,
migliorando quindi l’efficacia del farmaco stesso da solo o all’interno di un regime
terapeutico polichemioterapico.
Una seconda fase dello studio comprenderà nella valutazione farmacogenomica lo
studio degli altri polimorfismi implicati nel metabolismo dei taxani, tra cui
CYP3A4, CYP3A5 e ABCB1 (1236 C>T) e la correlazione tra questi polimorfismi e
le tossicità. E’ prevista inoltre un’analisi secondaria per definire la correlazione tra
profili farmacogenomici relativi agli enzimi deputati al metabolismo dei taxani e la
sopravvivenza globale del paziente, sopravvivenza libera da malattia per i pazienti
trattati in fase adiuvante e la sopravvivenza libera da progressione per i pazienti in
fase metastatica.
È possibile che sia la nostra popolazione di studio sia quella appartenente ad altri
studi di farmacocinetica e farmacodinamica del Docetaxel genotipo-correlati,
precedentemente effettuati, abbiano una numerosità del campione non così
rappresentativa da raggiungere una potenza adeguata a rilevare il reale impatto
predittivo dei polimorfismi genici.
Lo studio svolto rientra in un programma più ampio che partendo dall’osservazione
clinica, requisito fondamentale per il riconoscimento dei bisogni non corrisposti dei
Pazienti oncologici, prevede oltre all’analisi dei polimorfismi legati al metabolismo
dei farmaci, una serie di valutazioni di natura farmacogenomica improntata sulla
prevenzione del rischio di tossicità (ematologiche, non ematologiche, cardiache) da
agenti chemioterapici. La finalità è l’individuazione di profili genomici che possano
adattare al singolo paziente una giusta dose di farmaco efficace nell’ambito dei
normali dosaggi secondo schedule di trattamento preimpostate, riducendo al minimo
il rischio di tossicità dose limitanti che determinerebbero il ritardo o l’interruzione
del percorso di cura del paziente oncologico. La presenza di specifici polimorfismi
capaci di modificare sostanzialmente la velocità di metabolismo dei farmaci, il loro
trasporto e la loro eliminazione determina un’esposizione del Paziente a
concentrazioni plasmatiche imprevedibili, se non specificatamente analizzate.
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