INTRODUZIONE Le biotecnologie rappresentano una delle frontiere più promettenti della scienza contemporanea, in grado di fornire all’umanità nuove opportunità per combattere le malattie e per allargare gli orizzonti della nostra conoscenza dei sistemi viventi. La sperimentazione biotecnologica a livello cellulare sta diventando imprescindibile per lo studio del differenziamento cellulare e la morfogenesi, il controllo dell’espressione genica, la biologia cellulare del cancro, la determinazione delle predisposizioni genetiche per le malattie, le basi molecolari dell’attività dei farmaci, le modificazioni genetiche di animali e piante. Per prodotti biotecnologici si intendono proteine prodotte con la tecnologia del DNA ricombinante e dell’ingegneria genetica in sistemi cellulari in vitro. Negli anni ‘80 e ‘90 con il raggiungimento del sequenzionamento completo del genoma di molti organismi, fino a quello recente del genoma umano, la possibilità di produrre in vitro proteine purificate è diventata praticamente illimitata. In generale i prodotti che fino ad ora hanno raggiunto l’utilizzo clinico sono state proteine nella configurazione nativa, cioè corrispondente al gene umano normale intatto. Oggi, invece, vengono utilizzate delle proteine chimeriche, ovvero molecole composte da porzioni codificate da geni umani e porzioni 1 codificate da geni di altre specie; per queste proteine, l’enorme allargamento delle conoscenze sulle strutture tridimensionali, con la identificazione dei domini strutturali, è stato decisivo per la ingegnerizzazione di nuovi prodotti : esempio sono gli anticorpi monoclonali chimerici. RUOLO DEL TNF NELLE MALATTIE AUOIMMUNI Prima di prendere in esame lo sviluppo e la funzione degli anticorpi monoclonali chimerici e non, ed in particolare dei farmaci anti-TNF, bisogna descrivere il ruolo del TNF (tumor necrosis factor) e di altre citochine in molte malattie autoimmuni disabilitanti. L’estesa ricerca preclinica, nelle malattie autoimmuni, si è focalizzata sulla regolazione dell’espressione delle citochine con particolare interesse all’artrite reumatoide, e questo sforzo multidisciplinare ha contribuito a spiegare i ruoli delle citochine in questa ed in altre malattie autoimmuni [1]. Il TNF-α (fig.1) è emerso da questi studi come un importantissimo regolatore dell’espressione di altre citochine pro- 2 infiammatorie come l’interleuchina-1 e l’interleuchina-6, diventando così un bersaglio chiave per l’intervento terapeutico (fig.1). Figura 1. Struttura del TNF-α. Il TNF-α è una citochina proinfiammatoria e immunoregolatoria che svolge numerosi effetti sistemici. Sebbene il TNF sia espresso principalmente dai macrofagi, viene anche prodotto da altre cellule, come linfociti, monociti, cheratinociti, fibroblasti, i quali svolgono ruoli importanti nei vari disordini reumatologici. I recettori per il TNF (fig.2) sono situati su tutti i tipi di cellule. Sono stati identificati due diversi recettori di superficie per il TNF-α detti rispettivamente TNF-R1 o p-55 e TNF-R2 o p-75. Il primo è coinvolto nella maggior parte degli effetti proinfiammatori e citotossici del TNF-α, mentre il secondo sembra svolgere un ruolo maggiore nelle risposte proliferative. 3 Figura 2. Recettori per il TNF. Il TNF-α induce varie azioni proinfiammatorie nelle cellule endoteliali, tra cui la produzione di citochine, l’espressione di molecole di adesione, la liberazione di sostanze procoagulatorie e l’induzione di sintetasi dell'ossido nitrico (NOS). Queste alterazioni possono scatenare lo shock settico. Inoltre, il TNF-α stimola i linfociti B e T, induce febbre, sopprime la lipasi lipoproteica negli adipociti e stimola gli epatociti a produrre proteine di fase acuta. Il TNF-α non è presente, a livello ematico, in individui sani [2]. Una sovrapproduzione di TNF conduce ad alcune malattie associate all’infiammazione, tra cui la sindrome di Behçet, il morbo di Crohn e tante altre. Tutto ciò ha portato allo sviluppo di diversi 4 farmaci, chiamati anti-TNF-α che contrastano i differenti stadi della produzione e secrezione del TNF-α. La sintesi di TNF può essere inibita da inibitori della fosfodiesterasi, prostanoidi, adenosina, corticosteroidi, interleuchina 10 e da specifici inibitori della metalloproteasi [3]. 5 SVILUPPO DELLA TERAPIA CON ANTI-TNF Come gia detto, l’eccessivo blocco dei TNF può essere utile terapeuticamente per i suoi effetti a cascata sulle citochine proinfiammatorie. Il primo passo logico nello sviluppo di farmaci proteici capaci di neutralizzare i TNF, è emerso dalla ricerca preclinica. Si è infatti visto che gli anticorpi monoclonali dei criceti diretti al TNF murino erano in grado di ridurre l’infiammazione e il danno alle giunture nei modelli di artrite di animali, riconoscendo definitivamente la validità dell’approccio con farmaci anti-TNF nelle malattie autoimmuni. Tuttavia, gli anticorpi monoclonali murini hanno diversi limiti terapeutici dovuti alla loro alta immunogenicità, infatti solo anticorpi chimerici o completamente umani hanno ottenuto l’approvazione per la terapia di malattie croniche autoimmuni [4]. L'immunogenicità degli anticorpi rimane una delle limitazioni associate alla somministrazione di anticorpi monoclonali murini a soggetti umani. Nella maggior parte dei casi una singola iniezione di anticorpi monoclonali murini provocherà una risposta immunitaria nel 50-80% dei pazienti, e generalmente si rivela la presenza di anticorpi umani anti murini (HAMA) entro 14 giorni dalla somministrazione, e ripetute somministrazioni (per esempio a scopo terapeutico) aumenteranno significativamente la risposta, anche in quegli individui 6 che erano stati insensibili alla prima dose. La risposta immunitaria provocherà la distruzione immediata delle seguenti dosi di anticorpi somministrate. In pratica, quindi, l'efficacia terapeutica degli anticorpi monoclonali murini viene limitata alla prima o, al massimo, alla seconda dose somministrata. La tecnologia del DNA ricombinante ha fornito un alternativo e riuscito metodo per ridurre l’immunogenicità innata degli anticorpi monoclonali murini. Sono stati clonati i geni di tutti i sottotipi di immunoglobuline umane, e questo ha permesso la produzione di vari anticorpi ibridi ad immunogenicità ridotta. Il primo metodo impiegato per ridurre l'antigenicità di un anticorpo monoclonale murino è consistito nel costruire semplicemente dei geni “chimerici” che codificavano proteine in cui le regioni variabili degli anticorpi murini erano fuse con le regioni costanti di un anticorpo umano: l’anticorpo chimerico conservava la specificità di legame ma assomigliava maggiormente a un anticorpo umano naturale. Da questi lavori di biotecnologia sono nati due farmaci come l’Infliximab (Remicade) e l’Adalimumab (Humira) che rappresentano una importante linea di farmaci biologici anti-TNF con applicazione clinica. Contemporaneamente allo sviluppo degli anticorpi monoclonali in terapia, forme solubili di recettore TNF (TNF-Rs) sono state isolate dall’urina umana. Questi recettori troncati sono in grado di legare 7 TNF-α e TNF-β e possono regolare l’attività biologica di queste citochine. L’esistenza di TNF-Rs nei fluidi di pazienti con artrite reumatoide ha mostrato un modo alternativo di esplorare i farmaci proteici come regolatori dell’attività del TNF in vivo [5]. La scoperta delle funzioni dei recettori solubili dimerici TNF è stata un’altra importante linea di sviluppo e rappresenta un ottimo modo di controllo delle citochine. Il prodotto terapeutico finale di questa ricerca è l’etanercept (Embrel), un recettore solubile del TNF con applicazione clinica in diversi disordini autoimmuni. Entrambi i tipi di anti-TNF biologici (fig.3), i recettori solubili dimerici e gli anticorpi monoclonali sono stati sviluppati per mezzo della biologia molecolare e i farmaci proteici tesi al TNF rappresentano oggi uno dei passi più importanti nel campo delle biotecnologie farmaceutiche [5]. Figura 3. Rappresentazione schematica di Infliximab, Adalimumab e Etanercept. 8 RECETTORI DIMERICI SOLUBILI L’uso di questi recettori in terapia fu postulato all’inizio degli anni novanta ed è stato seguito con successo da ricercatori dell’Immunex. Questi ricercatori sono stati in grado di clonare ed esprimere geni che codificano recettori umani e murini usando la tecnica di ricombinazione del DNA [6], ottenendo un gran numero di proteine ricombinanti. I recettori monomeri umani per i TNF sono stati i prodotti iniziali sviluppati come farmaci, ma fu presto evidente la mancanza di legame alle citochine. Si sviluppò in seguito la dimerizzazione del recettore solubile che portò ad un grande aumento nell’affinità di legame e nell’attività biologica. L’omodimero fu costruito impiegando tecniche di biologia molecolare per costruire un gene chimerico: la porzione extracellulare legante il TNF del p-75 è stato collegato al DNA che codifica i domini delle IgG umane [7]. Il clone ottenuto, consistente in sequenze totalmente umane, fu introdotto nelle cellule di mammifero per esprimere la proteina di fusione chimerica TNFR-Fc. Questa proteina che, dopo la traslazione, è ancora monomerica, forma ponti di solfuro tra le porzioni di cisteina del segmento Fc, producendo il recettore solubile dimerico attivo che è secreto nei mezzi di coltura. 9 Il recettore solubile chimerico lega con alta affinità due molecole TNF, sequestrando così la citochina nei fluidi biologici. Ha eccellente attività in vivo e la presenza della porzione di Fc permette, oltre alla dimerizzazione, una più lunga emivita plasmatica alla proteina [7]. SVILUPPO DI PROTEINE RICOMBINANTI La produzione biotecnologica di proteine ricombinanti include diversi stadi quali: A) Clonazione iniziale del gene che codifica la proteina desiderata in un plasmide. B) Successiva inserzione del vettore di espressione in una cellula adatta per ottenere un sistema specifico di espressione del vettore ospite. Le cellule ospiti possono essere procarioti o eucarioti a seconda del risultato che si vuole ottenere. La produzione della proteina terapeutica attiva in cellule di mammifero è minore rispetto ad E.Coli ma ha vantaggi di tipo funzionale. Le cellule ospiti useranno i loro meccanismi di traduzione e trascrizione per esprimere 10 discrete quantità di proteine ricombinanti clonate. Dopo lo sviluppo del processo per ottimizzare il prodotto e la qualità, la proteina viene C) ottenuta tramite fermentazione su larga scala o per processi di colture di cellule. D) Il punto finale è la purificazione e il controllo della qualità della proteina ricombinante [8]. ETANERCEPT La produzione di etanercept segue lo schema visto sopra ma il passo A) ha richiesto il disegno preliminare di una strategia di clonazione per costruire il gene chimerico codificando la proteina ricombinante di fusione umana rhu TNFR-Fc in seguito chiamato etanercept. Questo fu fatto su differenti geni umani, tra cui ad esempio la sequenza che lega il TNF del recettore p-75 e la porzione Fc dell’IgG1 umana. Il gene per il TNF-R2 fu derivato da un insieme di c-DNA di cellule fibroblaste umane clonate nel vettore di espressione eucariotico p-CAV/NOT-TNFR,usato come fonte per la sequenza di DNA della regione extracellulare del nativo TNF-R. Un frammento del p- 11 CAV/NOT-TNFR contenente la sequenza che codifica l’intera regione extracellulare del TNF-R, fu legato con un secondo frammento di restrizione del plasmide p-IXY498. L’ultima sequenza codifica per gli amminoacidi della porzione Fc dell’IgG1 umana, il dominio che costituirà la cornice di dimerizzazione nella costruzione finale della proteina (fig.4) [9]. Figura 4. Struttura dell’Etanercept. 12 ANTICORPI MONOCLONALI: DISEGNO E PRODUZIONE Gli anticorpi monoclonali (Mabs) murini derivano da cellule ibride (ibridomi) generati dall’immunizzazione di un animale con un antigene bersaglio, unendo poi le cellule B produttrici dell’anticorpo con le cellule tumorali di un topo . Le cellule ottenute (ibridoma) si possono coltivare facilmente per produrre anticorpi monoclonali, poichè esse combinano le proprietà di crescita tipiche delle cellule tumorali con la specificità di produzione di anticorpi della cellula B originaria[10]. Gli anticorpi chimerici sono costituiti da una regione costante umana (C) ed una parte di regione variabile (V) non umana, poiché le regioni variabili contengono i domini che legano l’antigene, sufficienti a determinare la specificità dell’anticorpo (fig.5). Figura 5. Rappresentazione schematica dell’Infliximab. 13 Gli anticorpi chimerici mantengono infatti l’alta affinità e la capacità neutralizzante dell’anticorpo non umano originario, migliorando inoltre parecchie caratteristiche della proteina, come ad esempio l‘emivita plasmatica e la risposta immunogenica nelle applicazioni terapeutiche [11]. INFLIXIMAB I metodi per la produzione biotecnologica dei Mabs chimerici sono ben conosciuti e si affidano alla tecnologia dell’ibridoma accoppiata alle tecniche di ingegneria genetica. L’anticorpo chimerico A2 anti-TNF o Infliximab fu sviluppato legando i geni delle regioni costanti dell’IgG1 con quelle dell’antigene legante varie regioni clonate da un Mab murino anti-TNFα. L’ibridoma originale anti-TNFα murino fu originato tramite immunizzazione di topi BALB/C con TNFα umano. L’anticorpo chimerico A2 anti -TNF permise l’isolamento dei geni che codificano i domini che legano l’antigene dell’anticorpo murinico, cioè le regioni variabili della catena pesante (Vh) e leggera (Vl). Questi segmenti di DNA furono uniti al DNA che codifica per le regioni costanti umane pesanti (Ch) e leggere (Cl) per produrre geni che codificano le immunoglobuline chimeriche [12]. 14 Ciò fu fatto impiegando vettori di espressione per il plasmide trasportando sequenza di catena umana Ch e Cl funzionalmente complete, costruite per permettere il facile inserimento di qualsiasi segmento di catena Vh o Vl (fig.6). > Mouse-Human chimeric chain 1 Anti-TNF alpha VH QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY ADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Mouse-Human chimeric chain 1 Anti-TNF alpha VL SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLMYSAFNRYTGVPD RFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR > Mouse-Human chimeric chain 2 Anti-TNF alpha VH QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY ADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Mouse-Human chimeric chain 2 Anti-TNF alpha VL SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLMYSAFNRYTGVPD RFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR Figura 6. Sequenze amminoacidiche delle varie catene dell’Infliximab. I due vettori di espressione che trasportano i geni della catena chimerica leggera e pesante furono inseriti in cellule di mammifero. La cellula recipiente usata è la SP2/0, una cellula mieloide che può 15 sintetizzare, assemblare e secernere immunoglobuline glicosilate codificate dai geni transfetti. Queste cellule, dette transfected, si coltivano in condizioni che permettono l’espressione dei geni incorporati sia in coltura che nella cavità peritoneale di un topo, e le catene di immunoglobuline prodotte si possono recuperare come anticorpi intatti dalla coltura o dal fluido ascitico. Le cellule SP2/0 transfette con l’infliximab furono usate per creare la grande cell bank C168J e WBC per la produzione dell’anticorpo ricombinante per mezzo di continue colture di cellule di perfusione. Dopo la filtrazione l’anticorpo è purificato e testato per contaminazione microbica, ph e contenuto di endotossine. I differenti passi nel processo di purificazione includono affinità e cromatografia anionica. La validità e la specificità dell’infliximab derivano dalla regione variabile del Mab A2 murino originale [13]. ADALIMUMAB Molti anticorpi chimerici causano tuttora eventi avversi e, in alcuni pazienti, possono indurre una risposta mediata da HACA (Human Anti Chimeric Antibodies). Una soluzione per ridurre ulteriormente le risposte immunogeniche indotte da anticorpi 16 chimerici è rimuovere tutte le sequenze topo-derivate e quindi sviluppare interamente gli anticorpi umani monoclonali. I topi transgenici e le tecniche di “phage display” sono le tecnologie chiave ampliamente usate per isolare tali anticorpi umani, portando all’approvazione dell’adalimumab, un anticorpo monoclonale ricombinante diretto al TNF–α umano, il primo anticorpo umano ad essere approvato. L’adalimumab fu sviluppato da Knoll e Abbott e fabbricato da Abbott con il nome commerciale di Humira. L’adalimumab è espresso nelle cellule ovariche di criceti cinesi, si lega specificatamente al TNF-α neutralizzando la sua funzione biologica bloccando l’interazione con i recettori p-55 e p-75 per il TNF. L’adalimumab è considerato interamente umano nel senso che le sequenze di gene codificante non contengono elementi clonati da altre specie animali. L’adalimumab (fig.7) è stato ottenuto con la metodologia di “phage display” una potente tecnica per legare genotipi e fenotipi, impiegata per selezionare i polipeptidi con nuove funzioni. Nella “phage display”, frammenti di DNA che codificano combinazioni di polipetidi si fondono in frammenti per geni specifici delle proteine di membrana di batteriofagi, così che i geni di fusione siano visualizzati sulla superficie dei batteriofagi stessi. 17 Figura 7. Struttura schematica dell’Adalimumab . Gli elementi con specificità di legame possono essere isolati in vitro legandoli ad un recettore immobile, un processo chiamato “panning”. Il passaggio finale è determinare la sequenza di polipeptidi ad alta affinità, chiudendo così l’anello genotipo-fenotipo. L’adalimumab fu isolato da studiosi dell’istituto di biotecnologie dell’Università di Cambridge come D2E7 attraverso selezione guidata su “phage display”, usando l’anticorpo monoclonale murino MAK-195 come stampo. 18 L’adalimumab è purificato attraverso vari passaggi di cromatografia ed è soggetto a trattamento a basso ph e a filtrazione per l’inattivazione e la rimozione del virus [14]. CONCLUSIONI Nonostante i grandi passi in avanti che sono stati fatti negli ultimi anni, ancora parecchie sfide preoccupano pazienti, medici e industrie biotecnologiche, tra cui l’immunogenicità e gli alti costi di questi farmaci. Anni di studi e sviluppo tecnologico di queste molecole hanno portato grandi vantaggi, soprattutto con l’avvento dell’umanizzazione delle proteine ricombinanti e i Mabs, ma ciò nonostante queste proteine possono stimolare ancora la produzione di anticorpi neutralizzanti specifici con una possibile riduzione dell’efficacia del farmaco. La presenza di anticorpi anti-etanercept non è comune ma è stata evidenziata in pazienti con artrite reumatoide e psoriasi, specialmente in monoterapia. E’ stata rilevata anche la presenza di anticorpi anti- adalimumab con risultati che variano a seconda della dose, della frequenza di 19 somministrazione e della somministrazione concomitante di Metotrexato [15, 16]. Sono stati trovati anche degli anticorpi dell’infliximab in pazienti con artrite reumatoide o con il morbo di Crohn ed è stata evidenziata un’associazione tra anticorpi dell’infliximab e la riduzione dell’efficacia del farmaco stesso. In questo momento non sembra sia possibile una risoluzione di questo problema in breve tempo, ma le aziende di biotecnologia farmaceutica stanno lavorando sotto tantissimi aspetti. L’altro problema da affrontare per lo sviluppo e la diffusione di questi farmaci è il loro altissimo costo, ma, poiché i farmaci biotecnologici sono parte del nostro futuro, si sta lavorando tantissimo anche in questo senso. La competizione può anche giocare un ruolo importante: le prime aziende bio-farmaceutiche hanno gia iniziato a rilasciare i brevetti ed infatti l’Agenzia Europea del Farmaco ha gia approvato le linee guida per lo sviluppo e l’approvazione di biofarmaci generici [17]. Nonostante queste sfide, i farmaci biotecnologici sono una realtà i cui benefici sono sotto gli occhi di tutti, ma c’è ancora molto da lavorare per fornire ai pazienti medicinali sicuri, efficaci ed anche economici. 20 BIBLIOGRAFIA [1] Feldmann M. Pathogenesis of arthritis: recent research progress. 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