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PGS 20IZ146.0.0 – MOD. 40IZ329.0.0
PROGETTO DI RICERCA CORRENTE IZS PLV 21/11 RC
Titolo del progetto:
I metalli nel sangue: un approccio innovativo nella scelta di biomarker di patologie
neurodegenerative
Responsabile Scientifico: Dr.ssa Stefania Squadrone
Ricerca finanziata da: Ricerca finanziata dal Ministero della Salute - Dipartimento per la
Sanità Pubblica Veterinaria, la Nutrizione e la Sicurezza degli Alimenti
Sintesi
Nell’ultimo decennio si è osservato un crescente interesse nello studio del coinvolgimento dei metalli in
processi neurobiologici, come la regolazione della trasmissione sinaptica, ed il ripiegamento o “folding”
delle proteine. E’ stato inoltre dimostrato che alcuni ioni metallici sono implicati nella patogenesi di
malattie neuro-degenerative come Parkinson e Alzheimer; infatti gli aggregati di Aß, alla base della
patologia, si formano solo in presenza di ioni rame e ferro.
In molte patologie di questo tipo vi sono infatti prove evidenti dell'associazione tra la neurodegenerazione e
l'aggregazione proteica e di una ulteriore correlazione tra quest'ultima ed il danno ossidativo.
Obiettivi
L'individuazione di alterazioni nel livello degli oligoelementi nel sangue potrebbe costituire un valido
ausilio nello screening iniziale di malattie rare come le atassie..Nel presente studio abbiamo considerato
soggetti affetti da diverse tipologie di SCA, atassie maggiormente diffuse nell'adulto e AT, che invece
coinvolge i bambini, in parallelo con controlli sani, ed effettuato il dosaggio dei metalli rame, manganese,
zinco, cobalto, molibdeno, vanadio, cromo, selenio, antimonio, piombo e cadmio nella matrice sangue. In
parallelo su linee cellulari immortalizzate (SCA e AT) si è valutata l'espressione di enzimi come le
superossido dismutasi (SOD1 e SOD2) di cui rame, zinco e manganese sono cofattori, enzimi che
contrastano il danno cellulare dovuto agli stress ossidativi, oltreché l’espressione genica di catalasi (CAT) e
glutatione perossidasi (GPX 1).
Risultati
Oligoelementi nel sangue: manganese (Mn), selenio (Se) , rame (Cu) e zinco (Zn).
Mn: i soggetti sani presentano valori statisticamente più alti (p<0,05) rispetto ai soggetti affetti da SCA ed
AT (Figura 1) , in particolare quelli affetti dalla forma SCA2 hanno in tenori più bassi.
Selenio: i soggetti sani presentano valori del metallo statisticamente più bassi (p<0,05) rispetto ai soggetti
affetti da SCA. Solamente per i maschi l’aumento di concentrazione tra soggetti sani e malati è
statisticamente significativo (p<0,05).
Rame: i soggetti sani presentano valori del metallo più alti rispetto ai soggetti affetti da SCA ma più bassi
rispetto ai soggetti affetti da AT. La differenza di concentrazione di rame riscontrata tra le due tipologie di
soggetti affetti da malattie neurodegenerative è statisticamente significativa (Figura 2).
Zinco: i soggetti sani presentano valori del metallo più alti rispetto ai soggetti affetti da SCA e AT che però
non risultano avere una significatività statistica.
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PGS 20IZ146.0.0 – MOD. 40IZ329.0.0
PROGETTO DI RICERCA CORRENTE IZS PLV 21/11 RC
Figura 1
Figura 2
Metalli tossici ed elementi in traccia
Il confronto tra i tenori dei metalli cobalto, cadmio, antimonio e vanadio non ha sottolineato differenze
significative tra controlli e pazienti affetti da AT e SCA , lo stesso si può dire per i metalli cromo e piombo.
I molibdeno in tutti i campioni era inferiore al limite strumentale.
Real Time RT-PCR di espressione
L’analisi di espressione genica degli enzimi implicati nella risposta allo stress ossidativo ha evidenziato
che, nelle linee dei pazienti A-T, solo i livelli di espressione di mRNA di CAT risultano significativamente
aumentati di circa il 50% rispetto alle linee di controlli sani. Al contrario, le linee ottenute dai pazienti SCA
mostrano livelli di espressione di CAT ridotti di circa il 20% rispetto a controlli sani. In nessuno dei due
gruppi di pazienti è stato possibile evidenziare una disregolazione della Glutatione Perossidasi GPX1.
Infine, confrontando i valori medi di espressione di mRNA di SOD2 delle tre popolazioni si è rilevata una
riduzione significativa di circa il 15% nei pazienti SCA ma nessuna differenza nelle linee dei pazienti A-T.
Analisi dell’attività dell’enzima Superossido Dismutasi (SOD 1 e SOD2)
Il saggio enzimatico per valutare il livello di attività delle diverse superossido dismutasi è stato svolto in
parallelo sulle linee ottenute da pazienti SCA , A-T e da controlli sani.
SOD1 (l’enzima citoplasmatico Cu/Zn-SOD): le linee ottenute dai pazienti A-T mostrano una riduzione
dell’attività della Cu/Zn-SOD di circa il 40% rispetto ai controlli sani. Al contrario i pazienti SCA pur
mostrando una lieve riduzione, non statisticamente significativa, dell’attività enzimatica di circa il 10%, si
comportano in modo paragonabile ai controlli.
SOD2 (isoforma mitocondriale MnSOD), l’analisi ha mostrato un’attività ridotta del 30% nelle linee A-T
rispetto alle linee dei controlli sani e non ha evidenziato differenze statisticamente significative nelle linee
dei pazienti SCA presi in esame .
Discussione
E' evidente che sono numerose le patologie neurodegenerative in cui gli stress ossidativi e i metalli giocano
un ruolo importante, tra cui le atassie oggetto di studio di questa ricerca.
Il dosaggio dei metalli nel sangue dei pazienti affetti da diverse forme genetiche di atassia spinocerebellare
(SCAs) e da atassia telengectesia (AT) ha come dato statisticamente significativo (p <0,05) un basso livello
di manganese, dato comparabile con uno studio effettuato su un'altra patologia neurodegenerativa, la SLA
(Nagata et al., 1985). Nel caso dell'Atassia-Telangiectasia (AT) si è riscontrato un alterato valore del rame
che è più elevato rispetto agli altri soggetti affetti da SCAs (p <0,05), mentre si abbassa in maniera
statisticamente significativa (p <0,05) nei soggetti affetti da SCA2 rispetto ai controlli. E' stato inoltre
dimostrato un significativo (p <0,05) aumento del tenore di selenio ematico nei pazienti affetti da SCAs
rispetto ai soggetti sani.
L’analisi di espressione genica svolta su linee linfoblastoidi di pazienti A-T ha permesso di valutare un
aumento dell’ mRNA dell’enzima detossificante catalasi, direttamente regolata in maniera negativa dalla
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presenza di cationi di Cu, nella reazione di detossificazione da perossido di idrogeno: maggiore è la
concentrazione dello ione rame, minore saranno la funzione e la velocità della reazione della catalasi,
aumentando i livelli di ROS all’interno della cellula. In risposta a questo aumento di H2O2, potrebbe
attivarsi un loop positivo che sostiene la risposta antiossidante, stimolando ulteriormente la trascrizione di
CAT, aumentandone quindi la dose di espressione di mRNA. Contrariamente all’atteso, i livelli di
espressione dell’mRNA della Mn-SOD non mostrano differenze tra pazienti A-T e controlli, ma sembra che
l’effetto della riduzione dello ione Mn abbia effetto solo a livello di attività enzimatica. Infatti, i pazienti AT mostrano una riduzione dell’attività delle due diverse isoforme di Superossido Dismutasi citoplasmatica
Cu/Zn-SOD, SOD1, e mitocondriale Mn-SOD, SOD2. Questo dato correla con quanto emerso dalla
quantificazione dei rispettivi metalli cofattori: la riduzione del cofattore, riduce l’attività enzimatica.
E’ interessante notare che la linea cellulare di un paziente con mutazione con effetto meno grave (AT34,
mutazione di splicing con lieve livello di proteina funzionante residua) mostra un livello di MnSOD più
simile a quelli identificati nei controlli sani.
Dai nostri risultati si evidenzia la presenza di un deficit nel sistema di risposta allo stress ossidativo,
valutabile come riduzione dell’espressione di catalasi e superossido dismutasi2.
Conclusioni
L'importanza di questi primi risultati risiede nel fatto che, dimostrata un'alterazione nell'omeostasi dei
biometalli, si può presumere una correlazione tra questo fenomeno e le patologie oggetto di studio. In
particolare, considerando l'espressione di enzimi come le superossido dismutasi (SOD) (di cui rame, zinco e
manganese sono cofattori) e la catalasi, enzimi che contrastano il danno cellulare dovuto ai processi
ossidativi che tanta parte hanno nelle patologie neurodegenerative, si può supporre che una loro up/down
regolazione possa rispecchiare i dati ottenuti.
Inoltre il dosaggio dei metalli nel sangue può esser di ausilio per indirizzare una diagnosi genetica, talvolta
complessa, come nel caso dell’atassia telangiectasia. Le indagini genetiche sono infatti spesso lunghe e
dispendiose e poter restringere il campo delle patologie sospette con una semplice rilevazione dei biometalli
nel sangue, ed in particolare di manganese e rame, consentirebbe un notevole risparmio di tempi e di costi.
A tal proposito occorre ricordare che in bibliografia sono carenti i dati relativi alla determinazione di questi
metalli nel sangue di soggetti affetti da patologie neurodegenerative; la maggior parte degli studi condotti
concentra infatti le determinazioni in distretti specifici dell'organismo, consentendo una quantificazione
localizzata del metallo, ma non la valutazione dello stesso come marker periferico di monitoraggio
dell'evoluzione della malattia.
Parole chiave: atassie, metalli, biomarkers, sangue