BREVI NOTE
lnterazione del glucosio con peptidi
i·: uoto l'Ile il glnco~io reagisce •·on vari amminoacid i, specialment.e in soluzione
•·oueentrata o in ambiente anidro: si formano prima X -glucosidi !abili, che successivamente, soprattutto in ambiente acido, subiscono la trasposizione di Amadori,
for mando composti resistenti all'idrolisi; ~i formano intine derivati ftuaniri e prodotti
bruni 1 •2 •
Abbiamo volu to indagare le possibilità di reazione del glucosio con peptidi. Si
riferiscono i primi risultati ottenuti trattando con glucosio due peptidi: leucil-glicilglicina e glicil-leucina (Hoffmann-La Roche).
25 !J.mOli di glucosio e 25 fLmOli del tripeptide, seiolti in 2 mi di acqua, sono stati
laseiati per vario tempo (da 2 a i ore) entro un bagnomaria bollente; nn a parte della
soluzione è 8tata cromatografata su colonna (<'m 1,9 x 100) di Sephadex G-10 (Polidest.rano della Ditta Pharmacia di Uppsala), equilibrata con tampone fosfato 0,02 M
a p H 7 ,O contenente 0,9 % di N aCl; la veloci t:\ di flusso era. di 25 m l per ora. Si rac t•oglievano frazioni di 2 ml e si analizzavano sia con la ninidrina (secondo RosE~ 8)
l'he con l'antrone (secondo ScOTT & )iELVIN 4 ).
Dai diagrammi ottenuti riportando i valori colorimetrici •Ielle due reazioni in
funzione del numero delle frazioni (Fig. l) si vede che già dopo 2 ore, ma <·o n maggiore
ev idenza dopo t.empi più lunghi (fino a 6 ore), le frazioni che si colorano con ninidrina
J ore
.5j
IO
4
5 ore
or~
Fig. L -
·.o t
C.> ~
10~
J
6 ore
Curvo di oluiziono delhi miscela
glucosio + J.eu-GII-Gii da cromatografia s u colonna. di Sephadex
ll-10, dopo vari tompi di reazione
a. 100•. Linee intore: reazione con
ninldrina ; lineo
trnttogglato :
rcuziono con a.ntrone.
7 ore
·'l
5o
60
70
-·lnn. /st. Super. Sanità (1966) 2, 53 1-533.
532
E SPERIENZE E RI CJ::RCH E
danno due pic('hi in t·orri~<pondenza , a ll' incirt'a . delle frazio ni ilfi·5!l e fl(l.(i4. mentre
quelle c he si colorano con l'a ut rone tlauno d ne pil'<'hi iu l'OITi-'lpoiulenza de lle frazioni
60·64 e 6.'\.fi!l. L e frazioni ()Q. (i4 ~>ouo Rtate rit·romato)Zrafate snlla ~te~<;;a t·oluntw;
il picco eorri;;pondente rtlle frazioni (i(l.(i4 ì• ri;;nltfl to molto !'vid!'nt e , mentrc ~Zii altri
rlue lo erano meno.
Un campion e della ;.;uht?.iOIH' t·oni;.;pondente a ll a zonfl t·entral e del pit•t·o t' ~tat.o
cromatugrafatu s u carta \\'hatmau :\ . l (fase mobil e ll · hutauoln·acitlo acetit·o·at·(pta
4: l: I ), Ria <'ome t.ale che dopo idroli~<i (24 ore a JlOO iu liri!\:\ ) (Fig. 2). Il prodotto
1,0..-- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - -
Rr
0.9
0,8 --
DLou
0,7
QLt u
o
o
Lou·Glo·Gh
Lou-Gio ·Gio
0,6 - - -
0,5
0,4
Lou·Gh
0,3 -
- - -- -- -
e
0,2
o
Gli
o
0,1
tr.u.60-64
traz.60·64
idrolll'Z
Lou-Gh-Gli
Gh +Lou
GlucoSio
Lou-Glo· Glo
dopo 6 ort
a 100°(
Fig. 2. -
Rappresentazione composita dci cromutogrammi su ca t·ta (Case mobile: n·butuuolo, a c ido
acetico, acqua 4: l : 1).
non idrolizza to dava, per spntzzamentu cnn ninidriua. una d(•hol e m a t't' hia f•ou nua
leggera coda con Rf c irca 0,17 e un 'a ltra con Rf 0,4 1; quello itlrolizzato dava uua
macchia t·on Rf 0,19 ( = glicin a) e un 'altra cnn Rf 0,74 (
lencina); per ~p mzza ­
ment.o con ftalato di anilina si aveva una m aeehifl hnma t·on H f 0. 10 ( = l!luro><io ).
Il tripeptide ha Rf = 0,67.
Semhr:1 pertanto ch e il glu cosio non ~>i combini t·ol tripeptide , ma Rt :wdti da.
es8o la. glicina , legandosi a qnest.n. e lilJera ndo le tu·il -glit·ina (1'. J\1. 18B); <'i<'• (· (·o nfprmato da i crumatugrammi ùei prodotti di idrolisi. Da uota rt• c ile il tripeptiùe tra.tt.ato
come sopra, ma in assenza di· glueosio, no n si idrolizza a pprezzahilm ent.e. Pro ba hil A1111. l sl . Supcr. Sa11ilù (1966) 2, 53 1·533 .
COSTANZO, GAUDIANO E PORCELLI
533
mente la. maggiore affinità del glucosio per la. glicina anzichè p er la. leucina 5 sposta
requilibl'io d 'idrolisi verRo la formazione di glicina e leucil-glicina anzicbè di leucina
e glicil -glicina. In effetti abbiamo trovato che il glucosio, trattato per 6 ore in soluzione
1,25 . 10· 2 M a LOOo C con la quantità stechiometrica di glicina, reagisce, mentre non
reagi11ce che in misura minima con la leucina, formando prodotti bruni. Analoghi
riRultaH si ottengono operando a 60° C per 48 ore, ma in tal caso la resa è minore e
si formano anc he prodotti bruni.
La reazione fra glucosio e glicil-leucina è stata fatta avvenire in condizioni uguali
a quelle usate per il tripeptide; il prodotto ottenuto ha, in cromatografia su carta,
tm Rf di 0,17 circa, e dopo idrolisi libera glicina e glucosio. RiRpetto al tripeptide
si ha, sia a 100° C che a f)Qo C, nna resa minore ed una maggior formazione rli prodotti
bruni.
Concludendo: nelle condizioni descritte il glucoRio non si lega ai peptidi , ma alla
glicina che se ne distacca per idroliRi, sia che questa ne costituisca l'amminoacido
N -terminale, sia che ne costituisca l'amminoacido C-terminale. È nostro intendimento
estendere questo studio ad altri pept.idi e ad altri zuccheri, per me~lio chiarire il mec caniMilO della reazione.
Riassunto. - È s tato studiato il comportamento del glucosio in soluzione acquosa con leucil-glicil-glicina e glicil-leucina. L'esame C"romatografico su Sepbadex
G -10 e su carta ha portato alla conclusione che in entrambi i casi il glucosio si lega
alla glicina separatasi dai peptidi.
7 maggio 1966.
~ U NZIO C OSTANZO , ALDO G AUDIANO
e GIOVANNI P o RCELLI*
Laboratori (li Biologia
l
2
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RICHABDS,
BURTON,
• Centro di Chimica de l l<'a.rmaco e de l Prodotti biologicllme n te a ttivi del C. N.R. prc88o l'Università Cattolica de l Sacro Cuoro· ROrnl\.
A nn. I si. S uper. Sanità (1966) 2, 531 ·533.
,......
Attività enzimatiche nel fegato di ratti sottoposti
ad intossicazione cronica con tetracloruro di carbonio
L<> rnoditic·azioui morfolfllo(il'lit', hiol'himida• t'd iu partic-olare enzima.tidH•. l'Iii'
iut.('rveHg-ono n el fegato di :wimali ~ottoposti ad iH t osRic·azi()IH' aeuta o ~< ub ac·ut a da
tetrac·loruro di carbonio (( '('14) :<ono s ta ti' oggetto tli nunii'I'O><f' ril'f•rche ; una raRHegna
s ull 'argo m ento \' ienf' pre;;f'rltata da Houn.I.IEH '·
~ ehht>n e t ecnid1t> p a rtil'olari JHII<sa no m t>tft>n• in ev idf'll za . ~?,i :\ dopo poc·hi l'f't•ondi da.lla ~o mmini ~< tra z iou e tli <'Cl 4 • segni di danno nuelea re 2 , ì• opinion(' ormai
:w<'redit.atn 1 •3 • l'h e il pun to di attac·ro cll>IJ'azio ne lesiva da ('( '14 s ulla t·ellula e pat ira
F<ia il re tir-olo f' J Hlopla>~matil'o 4 •5 • Hono v erò int e reRioiati a ni'IH• i mitoC'ondri a,s e i li ><o~<umi 4 ,~- ro, ]JiÌl o me no precoeem e ntl·.
l>rA :-<ZAN I 10 ha seguito s in dalle prinw ore per Ke i giorni il t·onlportament.o d egli
e nzimi li:<o:<orniali ed h a m e~<so in ('\·idcnza l'aumento di a lt-uni enzimi piì1 prel'Ol'f'
( fo ~< fatas i , (3-g lic·uronidasi )_ di altri piì1 tardi vo ma p('r~<il<t('n!P (eat.e psiua. arihmlfa t a«i A e B, rihonu!'lea s i). LP atth·i1 :'1 insedimentabili negli omogcnati di d e tti en 1.imi ,
l'he a ni varw a d un I'ORpi•·uo aume nto t ra le 1:! f' le :!4 <HC dalla ;,omminist razion e
d el toE<Ril'o , tendouo f•o l t e mpo :l ritomare. alla no r ma .
J\pJl a preRent ~> l\ota riferiamo !'Il eli un a rh-Pn·a r ig uanlantt> le \·ariazioni di alt·uni
enzimi l'it .opla ~ mat i1·i epa.t ic•i i t t ratti Ro tto poR t i ad u11 lu11go p e riodo d i som mini ~t ra ­
zionf' di CC I,, ~<ns pnsa una ~et t.im ana prima d e l ~a<;rilic · io , per osser Yare. lòìe poRRi bile,
a leuui uspl:'tti hio('),imiri più p l:'.rRist enti del dan11o e patiro !'I'Oilil'n da CCI,. T a l<> ri ren·n Ri inquadra in una iuda ~i n<' più vaRt.a int<>~<a a stu cli ~tre g li effet ti to s~ ic· i di akune
sn>:ta uze <' la JlORt<ihile protezion i' o riparazione da partf' di e;,tralli di o rgauo .
l'm·te SJJf'riliiPIIIoiP.
Sono s tati m essi in e::~ pc rim ent o due Krttppi di ratti di se;,~;o
l'emminile. eli reppo \\' i;;tar -l:Jaxo. a,lltwa.t i n el nostro l!!ti t n to. All'inizio cl f' ll'e><p er imento il JW"II deg li a nimali si agginwa in m edia in torno ai HìO fl.· [ln g ruppo di ratti
fu tPIIltto di !'On trollo e ril'evet.t.e clue volLe p er Ret.t imann 0,1 ml/ 100 g di pe~'<o, pc>r
l i ~Pttim:w e, di ~<o luzione t i~iologi<-a.. lJn !leeonrlo gruppo rie!'vette due volt e In setti m a na , p e r lo ;:t.f' RKo periodo rli te mpo , CCl,. alla c!ose di 0 ,1 ml/ 100 g di pe~<o, ioiempre p e r
\·ia Rot.t0\'1\L:l.ltf':t.
'l'raflf•or.;a u11 a ~'<etlimana <lal\"ultima iniezio 11 e g li a 11ima li furo11o sarrilicati per
d ecapitazione. I fegati furon o p rele\·a ti , p e>:a t i immediatamente, e i"H eet>s~<iv amell te
om ogeneizz:tti in tubi di Potter iu ~<arcarosio 0,2fi i\L f'li a 0 °.
Una part e ù ell'o mogen ato (l : IO p /Y) fu utilizzata p er la determi11a zion o de lle
a.t.tivit:\ d ei !leguenti enzimi: ghH:osio -H-fos fatasi, mali l'O· d ei drogena~i , citucromossida~'<i
e ca te p siu:t: un 'altra, parte fu sottopos ta. ad ultracentri fu gaz ione in centrifuga. Chris t
UM!!:GA a. 40.000 giri per 30' (3.000.000 g · min ): s ul s upern atante <'U~<Ì ottenuto ~'<i
effettuò IH tle t ermi nazione d elhi a t t ivit:ì i11sedime11tabile de lla eatep><ina ; etl infine F<i
utiliz?.ÌI nu a terza parte per la de t.c rmiuazione d el l'azoto con m iero- K,ieldalil. l'e ri particolari d elle tecniche di o mogeneizza;r.iouee per la tletenninazione d ellaeatepsina rim a u diamo ati nn la\'Oro preeed ent f' 11 ; per la determinazioni.' della ei t or ro mo~s id a~ i f. Rtato
utili;r.zato il m et,odo spettro fot oml:'t ril·o di C'ooper.-tt>in. modilkato da APPEL~IAK S 12 ;
l 'atti\·it :\ d ella gl neosio- 6-fosfata:<i i.1 Atata d eterminata t'o! metodo indicato da D t:: Dt'\'E
el al. 14 e quella dell a m a lico-ù eidrogeHaRi se<·onllo il met.oclo di BEAIJFAY 19 •
Per tutt(J il p eriodo d ell 'esp erimen t.o i ratt.i d C' i d ne g ruppi furono alirnen t a t i
c·u11 la die ta ~ taud anl d ell'ht.ituto.
A Il !l. / si . S u per . Sa11ilà (t 966) Z, 534 ·536 ,
535
C:AUDIANO, PETTI, POLIZZI E TARTARINI
Risultati.
L'accrescimento degli animali non :;embra essere stato disturbato
dalla somministrazione di CCI4 : infatti i ratti eli controllo sono pat~sati da un peso
medio iniziale di 161,5 g ad uno finale di 217 (accrescimento medio g 55,4 ± L3,6);
mentre i ratti trattati, che all' inizio pesavano in media 161,6 g, a.lla fine avevano
raggiunto i 222 g (accresc·imento medio 61,0 ± 12,9). Neanche il peso percentuale
<lei fegato ed il contenuto di azoto epatico, come si vede dalla Tabella l , hanno
;mbito \'ariazioni per effetto <lei trattamento.
Attività enzimatiche nel fegato di ratti sottoposti ad intossicazione cronica
con CCI. (0,1 ml/ 100 g di peso per 17 settimane, sottocute) In confronto col controiiJ.
Param etri misurati
Pceo dol !cgato (g/ IOOg animale)
Azoto epatico (mg/g di teRsuto)
Ratti di controllo
2,71
32,4
±
±
Hatti trattati con CCI•
--2,63 ± 0,39 (Il) •
0,32 (Il) •
3,7 (Il) •
!12,6
±
2 ,6
p
( Il) •
.lttivUà enzimatiche (u **/g di N)
<:i tocromossidasi .
glucosio-6-fosfatasi .
malico-deidrogenasi
\:atepsina (attività totale)
catepsina (attività insedimet~tabile in °~ della totale)
391,0
567,0
607,0
34,2
J: 97 ( 9) •
± 179 ( 9) •
± 151 (10) •
± 9,5 (lO) •
4,2 ± 1.1 (LO) •
359,0
438,0
484,0
39,3
± 114 ( 9) •
± 122 ( 9). < O, l
± 89 (10) • < 0,05
J: 9,6 ( LO) •
7,8 ::!: 2,3 (lO) • < 0,001
• Dovlaziono staudard. TrtL parentesi, il numero dogli animali.
•• Jo:ceetto c he per la cltocromossldasl, una unità enzimatica è la qUAntità di enzima che nello
condizioni del test determina la scissione di una IJ.lllOle di substrato nell'unità di tempo (minuto).
Per la c itocromossidasi una unità enzimatica è la quantità di enzima che causa la diminuzione di
un'unità del logaritmo decimale della concentrazione del citocromo C ridotto/minuto/100 mi di
miscela di Incubazione.
Circa il comportamento dei quattro enzimi studiati, daUa tabella rif!ulta che la
citocromossidasi non presenta variazioni di una qualche entità, la glucosio-6-fosfatasi
Remhra diminuire negli anim ali trattati, ma la diminuzione non raggiunge il livello
della 11ignificatività statistica (O, l> P > 0,05). Significativo invece appare l'abba;;samento della malico-deidrogeoasi. Riguardo alle variazioni della catepsina. mentre
non Ri hanno variazioni di rilievo nella attività. totale dell 'enzima, si evidenzia
nn netto aumento della percentuale i11sedimentabile negli omogenati degli animali
trattati, indice di una possibile alterazione della permeabilità dei lisosomi, in <'ui è
localizzata la catepsina.
Dai nostri risultati a ppare che l'intossic·azione cronica da CCI4 non produce efietU
molto diversi da quelli t.rovati da altri Autori per l'intosf!icazione aeuta o subacuta.
Anche se di minore entità, la caduta della malico-deidrogenasi da noi riscontrata
si accorda con i risultati di Rl:Es & S INHA 15 , mentre il netto aumento <Iella attività insedimentabile della catepsina, l'inRensibilità della C'itocromossidasi al CC1 4
e, pm· con il suo modesto valore Rtatistico, la caduta della glucosio-6-fosfatasi, corri~ponòono a quanto trovato da BEAU~'AY et al. •.
Differisce tlai dati degli autori ora citati e di DIANZANI lo il comportamento della
attività totale della catepsina: in particolare nelle ricerche di Dianzani, a 6 giorni
dalla somminist.razione di una singola dose elevatissima di cct•. l'enzima presenta.
un 'attività tre volte più elevata rispet.t.o agli animali normali e BEAUFAY Pt al. '• in
. 11111.
lsl. Supu. Sanità ( 1966) 2, 634·536 .
536
ESPERIENZE E RICERCHE
seguito a somministrazione per 5 giorni consecutivi di dosi più basse di CCt., mettono
in evidenza un 'attività cateptica all'incirca doppia rispetto ai controlli.
Si può pensare che il trattamento prolungato eon CCI, provochi fenomeni di
adattamento e resistenza specifica a l t·OSP.ico 18 , ma è evidente che l'intos!licazi one cronica può avere alterato profondamen te i rapporti reciproci quantitat ivi fra paren chima e tessuto connettivale e determinato un grado più o m eno elevato di fibrosi
dell'organo 17 , modificandone la risposta agli agenti tossicL
Per avere un'idea dell'entita della fibrosi, abbiamo anche determinato (col metodo di NETJ MAN & L OGAN 18 modificato) il contenuto in idrossiprolina, che P. risultato
di 44,8 ( ± 6,7 ) mg/ 100 g di peso di fegato fresco nei controlli e di 61,8 ( ± 5,7)
mg nei trattati; l'aumento, del 37 %, è statisticamente significativo (P < 0,05). Inol tre nel nostro caso , in cui la det-erminazione dell'attività transaminasica glutammicop iruvico nel siero di alcuni a nimali di controllo (in media 4,06 mU) e di animali trattati (3,37 m U) ci porta ad escludere l'esistenza di fatti necrotici acuti in atto, ei sembra logico pensare che le alterazioni biochimiche così persistenti da noi osservate pos sono caratterizzare alcuni aspetti dell'intossicazione cronica da CC14 , anche se non si
può escludere che preludano a processi di riparazioneStudi paralleli, istologici, su frammenti di fegato , già da noi presi in conside razione,
potranno meglio chiarire la situazione.
9 maggio 1966.
1
2
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8
7
8
e
10
11
12
1a
14
16
te
17
t8
ALDO GAUDIANO, GUIDO P ETTI, MARIA POLIZZI
e SILVIA TARTARINI
Labm-awri di Biologia
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Prodotti di alterazione della tiamina nelle soluzioni
iniettabili e loro tossicità acuta e sub-cronica
La facile alterabilità di alcuni farmaci in soluzione, specialmente alle temperature comunemente usate nei processi di sterilizzazione, pone non solo il problema
di mantenere il tar~aco al livello dichiarato di concentrazione e quindi terapeuticamente utile (il che ~ talvolta ottenibile con un opportuno sovradosaggio), ma anche
quello , sp~sso trascurato. doi pl'odotti di alterazione, che, oltre ad essere generalmente sprovvisti di azione terapeutica, possono avere una loro tossicità, diversa
da quella del farmaco inalterato.
È nostro intendimento studiare da questo punto di vista le vitamine: a tale
scopo abbiamo per prima preso in esame la tiamina o Vitamina B 1 •
La ti11.mina è abbastanza termostabile in soluzione leggermente acida (pH
intorno a 4); la stabilità diminuisce in ambiente neutro e soprattutto alcalino, ed
anche in ambiente fortemente acido.
Per stabilire condizioni non dissimili da. quelle che poesono aversi nelle soluzioni
inietta bili, abbiamo autoclavato una soluzione di tiamina a p H 6,5. Caratterizzati i prodotti ottenuti mediante cromatografia su carta, ne abbiamo saggiato, nelloro complesso,
la to~icità acuta e quella subcronica in confronto con quelle della tiamina inalterata.
Preparazione delle soluzioni. -- Si è usata tiamina cloridrato F. U. della Ditta
C. Erba. Se ne sono preparate tre soluzioni alle concentrazioni di 10, 25 e 50 mg/ml,
che si sono portate a pH 6,5. Le soluzioni sono state poi infialate (Renza azoto). Alcune
fiale sono state sterilizzate per tindallizzazione (5 volte, a distanza di 24 ore, per l ora
a 60°C; alt.re sono state autoclavate per vari giorni (ogni giorno per l ora a 1150C)
finchè il titolo in tiamina, determinato còl metodo spettrofotometrico_.al tiocromo 1 ,
risultava di non oltre il 2% di quello iniziale. Nelle fiale tindallizzate il t.itolo restava
pressochè inalterato.
Esame cromawgrafico . -· Le soluzioni alterate, notevolmente colorate in giallo,
sono state sottoposte a cromatografia su carta usando carta 'Vhatman n. l e, come
faae mobile, le miscele 1 n -butanolo-etanolo-acqua nel rapporto 2: l: l 1 o 2:2: l;
quest'ultima dà una risoluzione migliore. L'identificazione dei componenti è stat.a
fatta esaminando i cromatogrammi a luce U.V. di basaa lunghezza d'onda (lampada
germicida della Generai Electric Co. schermata. con filtro Corning n. 9863), spruzzandoli poi con i reattivi usati da LHOEST, BuSSE & BAUMANN 1 e da WINDHEUSER &
HJGUCHJ •, ed eseguendo cromatogrammi con sostanze di confronto.
Il secondo solvente ha permeBBo di evidenziare, nelle soluzioni alterate, almeno
5 prodotti: 2-metil-4-ammino-5amminometil-pirimidina (Rf 0,42), tiamina (Rf 0,62),
2-metil-4 -ammino-5-ossimetil-pirimidina (Rf O, 77), tiocromo (Rf 0,82), 4-metil-5o!lsietil-tiazolo (Rf 0,91); si vedono anche piccole quantità di altri prodotti, alcuni
dei quali fluorescenti, non ben differenziati, con Rf inferio•e a 0,4.
1'ossicità acuta . - È stata saggiata in topini l!ian..:hi del peso di ca. 20 g. mediante
inoculazione nella vena caudale. Dopo alcune prove orientative si sono iniettate a
gruppi di 10 animali per ogni dosaggio quantità di tiàmina alterata fra 100 e 500 mg
per Kg di peso corporeo; la DL60 è risultata pari a 260 mg/kg (Fig. 1). Prove parallele
.dnn. /st. Su-per. SaniUi (1966) 2, 537 -539.
...,.
53R
E SPERIENZE E RICERCHF.
eaeguite con tiamina
con la let.teratura 4 •
inte~ra
lta.nno dato una
VL~0
di l2ii mg 'kg , in perfet to accordo
1. -
t'urvA. dose/ mortalità ne l topino Pl'r·
l prodotti di demolizioni' termica d ello
tiamlnn. (Autoclavatr~ a Ila•, ogni
giorno per un 'ora. Hno n titolo lo t o m etrico ' del 2 %).
~'Il{.
100
200
300 400 500 mgf kg
Tiam ina alterata
'l'ossidtrì subcro11ica. -- :f.: stata saggiata in ratti a lbini (ceppo \\"i!>tar) di se~<so
maschile del pe~o iniziale intorno a. 80 g. Ad un lotto di 15 animali sono stati iniet.ta.ti
l{iornalmente, per 42 ~io mi cOIHiet'utivi , per via intramwwolare, 0,2 mi ( = li m~) di soluzione di tiamina alterata; ad un altro lotto di 15 animali ò stata iniettata la stesRa quant.it:\ di t iamina inalterata; ad un terzo egua l lotto (controlli) ;;i è iniet.tata una sohtziont>
fisiologica. La diet.a. era per tutti quella. standarcl p er r atti uf\ata nel nostro Istituto .
Durant e !"esperimento i ratti non hanno mostrato a lcun fenomeno a normale.
Alla fin e gli animali, tenuti 12 ore a digiuno, sono stati pesati, iuor ulati i. p. con 0,2 mi
di soluzi one di eparina all'l ~ .. e, dopo cin~a l ora, sacrificati. Sono stati pesati fegato ,
milza, reni , Rurreni, testicoli , cuore, timo; si sono inoltre determinati azotemia, glicemia, emoglobinemia, ematocrit.o , eritrociti e leucociti. Azotemia e glicemia sono
state determinate con i metodi enzimatici specifici per l'urea e il glucosio, usando i
reattivi della ditta Hoelu·inger; l'emoglobinemia t', stata det-erminata colorimetrica mente dopo denatura.zione a lc·alina .
I risultati sono raccolti nella Tabella l. In nessun caso le differenze sono ris ultate statisticamente signific!ttive.
Conrlusi01d. - Il risultato più interessante dei nostri esperimenti è la minor('l
tossicità dei prodotti di alterazione della tiamina rispetto a quella della vitamina
inalterata. Ciò è dovuto probabilmente al fatto ch e in quest'ultima è presente, nelranello tiazolico , la funzion e ammonica quatemaria , che è invece assente nel 4rnetil-5-ossietil-tiazolo formatosi per demolizione della tiamina. È interessante a
a questo proposito rilevare che la ditiopropiltiamina, nella quale l'anello tiazolico èaper to, ha una tossirità da 2 a 5 volte minore di quella della tiamina 6• 6 .
Se ne potrebbe quindi dedurre che la tossicitn della tiamina sia in gran parte di tipo
c urarico, cioè legata all'azoto quaternario; lo shock tiaminico, in vece, sarebbe legato
alla presenza dell'anello pirimidinico 7 • Sembra pertanto di poter escludere che i casi
mortali talora verificatisi nell 'liomo in seguito a so mministrazione parenterale di dosi
elevate tli Vitamina B 1 s i possano imputare ai prodotti di a lterazione della vitamina .
.dun.
/st . :;uper. Smril<ì (19GG) 2,
537·5~9.
CAUDlANO, PETTI, POLIZZI E TARTARINI
539
TABELLA l.
Valori medi ( ± deviazione standard) dl alcuni parametri
In ratti trattati con tlamlna alterata tennlcamente o Inalterata
P U I't\11\ otri
l
ml.• urati
Peso iniziale (g).
Accrescimento ponderale dopo
42 giorni (g)
Peso 0 {, del fegato
» della milza
~ dei reni
• <lei surreni
• dei testicoli
• del cuore.
•> tlel timo
Azotemia (N ureico) mg/ 100 ml
Glicemia g/1000 mi
Emoglobinem ia g/ 100 ml
Ema.tocrito
Eritrociti (m ilioni/mmc)
Leucociti (pe r mmc)
Ho.tti di controllo
79,9 ± 11,8
127,9
2,87
o, 15
0,7 1
0,021
1,38
0,27
0,18
16,3
0,64
16,7
48,5
7,86
9 107
l
Hnttl inie ttati con •
--
tinmlna 1titcro.ta Jtiamina inalterata
85,3 ± 7,7
82,8 ± 9,0
± :l5,0 121,6 ± 13,4 123, l J: 19,5
2,76 ± 0,13
2,87 ± 0,27
± 0,14
0, 15 ± 0,06
0, 15 ± 0,06
± 0,08
0,76 ± 0,08
0,69 ± 0,05
± 0,07
± 0,003 0,020 ± 0,002 0,02 1 ± 0,004
1,32 ± 0, 16
1,33 ± 0,25
± 0,24
0,29 ± 0,05
0,28 ± 0,03
± 0,03
0,19 ± 0,06
0,18 ± 0,05
± 0,06
15,0 ± :3, l
15,7 ± 2.8
± 1,8
0,65 ± 0,06
0,66 ± 0,08
± 0,07
17,4 ± 2,0
16,9 ± 1,2
± 1,6
49,5 ± 2,8
± 2,7
48,8 ± 2,3
-'7,99 ± 0,66
7,87 .±: 0,41
- 0,75
± 945
7933 ± 1760 9 121 ± 920
• I rutti, in lotti di 15, sono stati luicttuti g iornulmcntc. pt•r 42
con 0,2 mi (5 mg) di tiaminn alterata o Inalterata.
~g.,
pur via intramuscolarc,
Per quanto riguarda la tossicit:\ subcronica, è nos tra opinione che le discordanze
tlella letteratura 8 siano dovute, più che alle diverse tecniche usate, all'insufficiente
numero di animali trattati ; dalle nostre esperienze risulta che nè la tiamina nè i s uoi
prodotti di a lterazione modificano in maniera statisticamente significativa i para·
metri da noi presi in esame nel ratto.
9 maggio 1966.
ALU()
GAUDIA NO, GUIDO PETTI, MARIA P OLIZZI
e SILVIA TARTAIUNI
Laboratori di Biologia
GAUDIANO , A., Rend. Ist. Super. Sanità, t1, 591 (1954).
LHOEST , \V. H., L. \V. Buss E & C. A. BAU~tAI'i:-1, ./ . . lm . Phann . A ss., Sci . E(l. ,
<47, 254 ( 1958).
3 Wt~DHEU S ER, J. J. & T. IIJGUCHI, ,/. Pltarm. &ci. , 51, :l54 (!962).
• ROBINS ON , F. A. The Vitamin B Complex, J. \\'il ey and Sons, !. ew York 195 1, p. 85.
~ F U.JIWARA, M., Medicina R ev. (Chiba, Japan). l , 28. citato in: ('hem .• l bslr., 49,
334 1 (1955).
6 SmoNNET, H., TnÉNEVOT R. & M. AuC LAIR, Thérapie. 14, 970 (l959}.
7 MOURIQUAND, G., R . CHARONKAT, P. LEC HAT, v. EDEL, J. C HARETON & R. C HWIII·
ZOLA, Convegno sulle vitamine, Roma. C.N.R., 1953, p. 453.
s GALA~ri N I - LIGORI, M. & G. PETTI, Rend. Ist. Super. 8anità, 22, lli)9 (1959) .
l
2
.111n. 1st . Super . Sa11ilù (1966) 2, 537· 5311 .
Tentativi di isolamento di vrrus arho
Durante gli ultimi venti anni vi è stato Utl notevole inc reme nto nelle ricerclw
ijui virus trasmessi dagli artropodi (zeccl1e, zanzare, ec<· .) in m olte parti del mondo,
a rausa della rilevante importa nza assunta da queRt i virus nella patologia umana ed
a nimale. Circa 200 virus appartenenti a quest,o gruppo sono stati finora isolat-i e notizie
di isolamento di nuov i ceppi vengono continuamente aCl aggiungersi. Solo una part e di
essi (circa 50) sono stati finora dimostra ti come agenti eziologici di malatt ia nell ' uomo.
L e conrlizi oni necessarie pe r la sopravvivenza d i questi virus in un 'area geo~ra­
fica dipendono da molt i fattori solo in p a rte del ineati. l>erchè> la cin·olazione in natura
sia poS8ibile, è necessario che siano riuniti nello stesso habitat specie animali che fun gano da riserva (serbatoi di v irus) e vettori. In questi animali il virus può sopravvivere a lungo causando un a viremia che consente l'infezione dei vettori , senza determinare pe rò segni evidenti di malattia. I vettori sono artropodi e matofagi in cui , per
ht definizione stessa di virus arbo, il virus si deve molt iplicare attivamente. L 'a rtro podo si infetta succhia.ndo il sangue su di un a nimale in fase viremica e, dopo una fase
di incuuazione durante la quale la trasmiSllione. i• impossibi le, pungendo un nuovo
ospite an imale o l'uomo, inocula ad esso il v irus.
A pa r te gli arbovirus r esponsabili di sporad iche epide mie, co me la feb bre gialla
a Lisbona nel 18 19 e la Dengue in Greda nel 1927, nelle quali la ma lattia in t rodotta
forse accidentalmente non s i è poi stabilita. in fo ci en demici, quelli fin ora ripetutamente
isolati in vari paesi d ' E uropa, sono:
l ) 11 virus dell'encefalite centro-europea, trasmesso da zerc he ùi vane spec i ~
e per lo piì1 dall 'I..wdes ricinus, isolato in Cecoslovacchia 1 e poi in molt i altri paeRi
dell ' Europa centr:>-setten trionale 2 e, nell 'E uropa meridionale, anche in Jugoslavia 3 •
2) Il vi rus ll'est Nile isolato per la prima vol ta in Uganda dal sangue ùi u11
mala to 4 e susseguentemen te in Egitto ed in Israele, e del quale recentemente si ì·
dimostrata una più ampia circolazione n el bacino del Mediterra neo con l'isolamento
ci el virus d al Gulex modestus nella Francia m eridionale 6 •
3) I virus della fe bbre da Pappataci (ceppi Napoletano e Siciliano) isolati pe r
1a prima volta in Italia da SAnrN 6 durante la seconda guerra mondiale dal sangue di
malati e s uccessivamente in Egitto dal PhlebotomuH papatasi 1 •
4) Il virus Tahyna isolato recen temente in Cecoslovacchia da zanza re del genere .Aiides 8 e che m uase a dat i sierologici sem br a sia ampiamente diffuso in E uropa.
In Italia vi sono stati solo limi tati ten tativi di isolamen to dei virus arbo. D 'altra
parte l'affinità geografica , climatica e faunistica dell' Italia con altri paesi con finant i
dove gli a ruovirus sono presenti lascia suppone che sia possibile una circolazione di
tali virus . U na recente inchiesta sierologica da noi condotta in due diverse region i
italiane (Lazio e Venezia Giu lia) 9,10 ha dimostrato, median te le prove di ini bizione della
e moagglut inazione e di neutralizzazione in topo, che un a parte <Iella popolazione e
degli an imali aveva avut,Q precedent i con tatti con alcun i dei 10 differenti virus con tr o
cui i sieri erano st.ati saggiati.. Questo dato ci h a indotto a iniziare ricerch e sistematiche
pe r la raccolta di artropodi vettori e pe r l' isola mento di v irus da essi 11 •
A1111. f s/ . .';uper. i:)clllilù (I!IUG) 2 , 5 4U ·fl41 .
LOPES, BALDUCCJ, VEBANI, SACCÀ, STELLA E SCIROCCHI
541
Nel periodo maggio-settembre 1965 sono stati raccolti campioni di zanzare nella
zona di Fondi (prov. di Latina). Per la cattura degli esemplari sono state predisposte
un certo numero di stazioni di cattura, consistenti in camere da letto, ricoveri animali
(stalle, porcili, gallinai), ricoveri naturali (grotte), ponticelli stradali, in cui le zanzare
sono state catturate per lo più mediante aspiratore a bocca, talora con trappole con·
tenenti un piccolo animale (cavia o pollo). Alcuni esemplari, infine, sono stati catturati
nella vegetazione preaao i focolai larva.li mediante retini entomologici di nylon. I
campioni sono stati trasportati vivi in Istituto e quivi classificati e divisi in lotti.
Ogni lotto, tritato e sospeso in soluzione salina contenente 0,75 % di albumina
bovina {frazione V), è stato saggiato per la presenza di virus con due diverse tecniche :
l) inoculazione intracerebrale in topini di 24-48 ore ed osservazione per la
comparsa di segni di malattia o paralisi o morte durante 21 giorni ;
2) inoculazione in colture di fibroblasti embrionali di pollo ed eventuale successiva prova di interferenza con un altro arbovirus (Sinclbis).
In totale sono stati inoculati 3639 esemplari suddivisi in 33 lotti di cui 3085
esemplari (26 lotti) di Culex pipiens e 554 esemplari (7 lotti) di Aiides vexans.
Alcuni lotti hanno determinato nel topino neonato segni apparenti di una lieve
malattia che non è stata confermata nè si è sintomatologicamente aggravata nei successivi passaggi. Abbiamo perciò dovuto considerare completamente negativi tutti i
lotti finora saggiati appartenenti alla stagione di raccolta 1965. Tali dati non sono
sufficienti a stabilire l'assenza di circolazione nella zona studiata almeno di quei
virus di cui abbiamo evidenti indicazioni sierologiche. L 'isolamento di virus arbo
dai vettori richiede l' esame di migliaia di esemplari, essendo molto bassa la percentuale di artropodi infetti.
Nel marzo 1966 i nostri tentativi di isolamento di virus arbo sono stati ripresi
e proseguono tuttora con raccolte periodiche di zecche, zanzare e piccoli mammiferi
selvatici, possibili animali riserva.
H.ingra.zla.mo la Signora Vlrglnia Chiodera (Laboratori dJ Mlcroblologia) e il Sig. G larnbattlsta
Dell'Uomo (Laboratori di Part\BIIitoltgla) per l'M8ls~za tecnica prestata al nostro lavoro.
8 giugno 1966.
MARIA
C.
LOPES, MARCO BALDUCCI e PAOLA""VERANI
Laboratori di ll!icrobiologia
GtuSEPPE SAccA., ENRICO STELLA e AuousTo Scrnoccm
La.boratori di Parassitologia
1
1
3
4
J. Presse Méà., 5 7 , 1084 (1949).
H. Ann. 1st. Super. Sanità, 1, 647 (1965).
LIKAR, M . & J. KMET. Bull. World Health. Organ., 15, 275 {1956).
SMITHBURN, K. C., T. P. HUGHES, A. W . BURKE & J. H. PAUL. A m. J. Trop . M ed.,
KREJCI,
MORITSCH,
10 , 471 (1940).
a HANNOUN, C., R. PANTHIER, J. MoucHET & J. P. EouzAN. Compt. Rend., 159,
1
7
8
4170 (1964).
A. B., C.
SCHMIDT, J. R.,
9, 450 (1960).
S ABIN,
B . PHILIP &
J. R.
M. L. SCHMIDT &
BARDOS, V. & V. DANIELOVA. J.
PAUL. J.
J.
Am . .llled. Assoc., 114, 603 (1944).
A m. J. Trop. Med. Hyg .,
G . Mc WlLLIAMS.
Ilyg. Epidemiol. Microbiol. lmmwnol. Prague,
l, 264 {1959).
Am. J. Trop.
Med. Hyg. (In corso di stampa).
BALDUCCI , M ., P. VERANI, M. C. LOPES & B. GREGORIO, Am. J. Trop. Med.
Hyg., {In corso di stampa).
EDITORIALE {G. Sa.). Ann. 1st. Swper. Sanità, 1, I-II (1965).
a VERANI, P., M. BALDUCCI, M. C. LOPES, A . ALEMANNO & G. SACCA,
10
n
Ann. Isl.
Su~r.
Sanità ( 1966) 2, M0·541.
