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Funzione simil-tiroidea nell’ascidia
Ciona intestinalis
Dr Rosaria Esposito
Tutor: Dr A. Spagnuolo (SZN, Cellular and Developmental Biology group)
Dr V. Matranga (CNR, Palermo)
In collaborazione con il Prof R. Di Lauro
Organificazione dello iodio: il punto di partenza nell’evoluzione della
ghiandola tiroidea
Il primo evento nell’evoluzione dell’ organo tiroide è stato lo sviluppo, nelle prime forme di vita, di una
capacità’ di fissare lo iodio e legarlo a proteine.
+
Gli ormoni tiroidei, in principio, rappresentavano molto
probabilmente una semplice riserva di iodio, pronto da
essere usato come antiossidante, e non svolgevano alcun altra
funzione.
Tiroxina (T4)
Tyrosina
3 – Iodotyrosina
(MIT)
3, 5 – Diiodotyrosina
(DIT)
Tri - iodotyroninea(T3)
Organificazione dello iodio: il punto di partenza nell’evoluzione della
ghiandola tiroidea
Heyland and Moroz, Journal of Experimental Biology, 2005
La catena alimentare ha poi contribuito alla diffusione di molecole di iodio organico anche in
specie marine che non erano capaci di sintetizzare gli ormoni tiroidei.
I composti iodati sono stati poi cooptati, nel corso dell’evoluzione, come molecole di segnale in
diversi processi biologici, quali sviluppo, crescita e riproduzione.
Il decremento di disponibilità di iodio, nel passaggio dalla vita acquatica a quella terrestre,
indussero le specie viventi a sviluppare la capacità di fissare lo iodio.
Dall’Endostilo alla Tiroide
Sviluppo ex novo di un organo esclusivamente dedicato alla sintesi di ormoni tiroidei
Thyroid
Tiroide tipica
La tiroide del pesce zebra consiste
di follicoli singoli e non organizzati
in una struttura ghiandolare
L’endostilo della larva di lampreda si
trasforma direttamente nella tiroide
follicolare dell’organismo adulto durante
la metamorphosis
Endostyle
Usano parte di un organo digestivo, l’endostilo, per fissare lo iodio
Nei cordati più semplici, quali
anfiosso e Ciona, l’endostilo, un
organo coinvolto nella secrezione
del
muco
necessario
per
intrappolare particelle di cibo
presenti nell’acqua di mare,
acquisì anche la capacità di fissare
lo iodio.
Ghiandola tiroidea e produzione degli ormoni tiroidei (THs)
Sezione di ghiandola tiroidea
1.
2.
3.
4.
1.
2.
3.
Le cellule follicolari sintetizzano la tiroglobulina
Lo iodio viene legato alla tiroglobulina per formare gli ormoni
tiroidei T3 e T4
Enzimi intracellulari separanoT3 e T4 dalla tiroglobulina
T3 e T4 liberi vengono immessi nel sangue circolante
T4 o T3 entrano nel nucleo e interagiscono con lo specifico
recettore TR (Recettore nucleare)
Vengono reclutati dei coattivatori (CoA)
L’espressione genica della cellula viene regolata
Produzione di THs
Funzioni degli ormoni tiroidei
Gli ormoni tiroidei agiscono su molti processi fisiologici e una loro carenza non è compatibile con
una “buona” salute.
Metabolismo
Sviluppo del sistema
nervoso centrale
Crescita
Metamorfosi
Sistema
cardiovascolare
1/I Xenopus laevis; 2/II Ciona intestinalis; 3/III
Amphioxus; 4/IV Lamprey; 5/V Ambystomatids
salamander; 6/VI Flatfish; 7/VII Zebrafish
La comprensione dei meccanismi molecolari e morfogenetici, che sottendono l’organogenesi di
una ghiandola così fondamentale per la vita, è di estrema importanza per una migliore conoscenza
dell’embriologia, fisiologia e patologia di questo organo. A tale scopo studi di filogenesi e di
comparazione costituiscono un punto chiave per ricostruire la storia della funzione tiroide-simile
nel corso dell’evoluzione.
Ciona intestinalis come modello per studiare l’evoluzione della funzione tiroide-simile
I Tunicati sono considerati i parenti più prossimi dei
Vertebrati.
La Ciona intestinalis è una ascidia che appartiene al phylum
Cordati, subphylum Tunicati.
E’ caratterizzata da uno stadio larvale e uno stadio adulto
come risultato della metamorfosi.
L’endostilo e’ localizzato sul pavimento del faringe ed e’
caratterizzato da 9 regioni. : 7, 8 and 9 sono le regioni
tiroide-equivalenti. L’endostilo produce MIT, DIT eT4
Gli ormoni tiroidei giocano un ruolo fondamentale nella
metamorfosi di Ciona.
T4 induce la metamorfosi, mentre KClO4, un goitrogeno
(sostanza che interferisce con la sintesi dei TH) inibisce il
fenomeno.
Il genoma diCiona contiene i geni
omologhi degli enzimi necessari per la
sintesi dei THs e del putativo recettore
(Ci-NR1) dei THs
Finora nel genoma di Ciona non e’ stato
identificato il gene omologo della tiroglobulina
di vertebrati
Scopo del progetto
1. Identificazione della proteina(e) usata come base per
la sintesi degli ormoni tiroidei
2. Determinazione del meccanismo di azione degli
ormoni tiroidei attraverso una caratterizzazione
funzionale del putativo recettore di Ciona (Ci-NR1)
1. Identificazione della proteina(e) usata come base per la sintesi degli ormoni tiroidei
Come ottenere una buona quantità di proteine estratte dall’endostilo?
 Esiste un anticorpo commerciale anti-T4 che riconosce qualche banda nell’analisi
dell’estratto proteico di Ciona medianteWestern Blot?
Selected Reaction Monitoring / Mass Spectrometry
M Endst. Stom.
75 kDa
L’analisi mediante SRM/MS ha rivelato la presenza di T4 libero e legato a peptidi, in estratti di endostilo.
Estratti di proteine da stomaco and ovario sono stati usati come controllo negativo.
1. Identificazione della proteina(e) usata come base per la sintesi degli ormoni tiroidei
Identificazione di peptide(i) legati aT4: arricchimento della proteina(e) di interesse
Immunoprecipitazione
Polyacrylamide gel elettrophoresi
Estratti totali di endostilo e stomaco (controllo
negativo) analizzati mediante SDS-PAGE.
Uno spot specifico, corrispondente a un peso
molecolare di circa75 kDa, è stato tagliato da gel.
Ab lega T4
Isolamento dei
Complessi Abcomplessi Abproteina sono
proteina
resi insolubili (centrifugazione)
Endst.
Stom.
M
Stom.
75 kDa
75 kDa
Mass spectrometry
In collaborazione con Prof P. Pucci and Dr M. Monti (CEINGE-Università degli Studi di Napoli Federico II)
Prof A. Amoresano (Università degli Studi di Napoli Federico II)
Endst.
2. Caratterizzazione funzionale di Ci-NR1
In collaborazione con Prof. G. De Vita (Università degli Studi di Napoli Federico II)
Prof A. Amoresano (Università degli Studi di Napoli Federico II)
Nina Dathan (TIGEM, Napoli)
Ci-NR1 codifica per una proteina di 67KDa, che condivide >70% identità nel dominio di legame al DNA (DBD) e≥ 30%
identità nel dominio di legame all’ormone (LBD) con i recettori degli ormoni tiroidei dei vertebrati (TRs).
DBD
LBD
Saggio di legame e
analisi mediante
spettrometria di
massa
Ci-NR1 espressione
and purificazione
DBD
+
T4
+
T4
Proteina non relata
Risultati preliminari indicano che Ci-NR1
è capace di legare siaT3 sia T4
Risultati preliminari indicano che la
proteina
purificata
di
Ci-NR1
interagisce in vitro con T4
Conclusioni
L’anticorpo anti-T4 si sta rivelando strumentale per l’ identificazione della proteina coinvolta nella
sintesi di ormoni tiroidei in Ciona intestinalis, aggiungendo quindi un fondamentale, innovativo e
prezioso tassello nella “storia” della funzione tiroidea nel corso della filogenesi animale.
Lo studio indica anche che Ci-NR1 mostra alcune proprietà funzionali di un tipico recettore
tiroideo.
I nostri risultati supportano ulteriormente il legame filogenetico tra la ghiandola tiroidea e
l’endostilo.