la biologia molecolare in laboratorio: presente e futuro

LA BIOLOGIA
MOLECOLARE IN
LABORATORIO:
PRESENTE E FUTURO
Trento 26 Novembre 2012
P. Lanzafame
U.O. Microbiologia e Virologia - Trento
Come chi stando per terra
raccoglie le mele da un
albero alto e rigoglioso
può raggiungere solo
quelle pochissime situate
vicino al tronco, mentre la
quasi totalità rimangono
lontane e irraggiungibili,
così nella valutazione delle
malattie umane fino ad ora
si è potuto comprendere e
quindi mettere in atto
misure diagnostiche e
terapeutiche solo di pochi
e facilmente accessibili
processi patologici
F. Collins 2001
La biologia molecolare è una branca della
biologia che studia gli esseri viventi a livello dei
meccanismi molecolari alla base della loro
fisiologia, concentrandosi in particolare sulle
interazioni tra le macromolecole, ovvero proteine
e acidi nucleici (DNA e RNA).
Per biologia molecolare si definiscono, in
genere, una serie di tecniche che consentono la
rilevazione, l'analisi, la manipolazione,
l'amplificazione e la copia degli acidi nucleici
1960: Lei ha un’ epatite da siero
1970: Lei ha un’ epatite da virus non A-non B
1990: Lei ha un’ epatite da HCV
2000: Lei ha un epatite da HCV genotipo 1
2010: Lei ha un epatite da HCV genotipo 1 con
un polimorfismo CC del gene IL28B sul
cromosoma 19, le probabilità di risposta al
trattamento sono buone
• 2011: Il genotyping SNPs rs8099919 nel gene
IL28B è associato con la progressione
dell’epatite C ad infezione cronica e con il
fallimento terapeutico
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• Alcuni esperimenti negli anni trenta e quaranta fornirono
le basi su cui la disciplina sarebbe poi nata: nel 1935 si
collegò per la prima volta l'ereditarietà ai cromosomi.
• Il termine biologia molecolare risale al 1938, coniato da
Warren Weaver, direttore della fondazione Rockfeller,.
• Nel 1943 Avery correlò il trasferimento di tratti somatici
tra ceppi batterici al DNA
• Nel 1953 Hershey e Chase dimostrarono che il materiale
genetico è costituito dal DNA.
• La nascita della biologia molecolare si può però far
risalire alla scoperta della struttura del DNA da parte di
Watson e Crick.
• Meselson e Stahl nel 1958 dimostrarono il meccanismo
di replicazione del DNA e poco dopo il codice genetico fu
decodificato dal gruppo di Crick.
Nel 1953, la scoperta della struttura a
doppia elica del DNA (James Watson e
Francis Crick ) ha segnato il passaggio alle
biotecnologie innovative e la nascita dell’
“ingegneria genetica”
• Il dogma centrale della biologia molecolare è il
principio secondo il quale il flusso dell'informazione
genetica è monodirezionale e parte dagli acidi nucleici
per arrivare alle proteine. In questo processo sono
identificabili tre punti: l'informazione genetica è
conservata nel DNA, che viene trasformato sotto forma
di RNA, il quale viene successivamente tradotto in
proteine, la forma "operativa" dell'informazione
contenuta nel genoma.
• Questo costituisce il meccanismo di base
dell'espressione dei geni e la direzione fondamentale del
flusso di informazione genetica.
LA TRAVERSATA DEL DESERTO
• 1965 – 1972: Da scienza teorica a scienza pratica
– 1973: primi sequenziamenti di Maxam-Gilbert
– 1975: sequenziamento metodo Sanger
– 1977: sequenziamento nuovo metodo di Maxam-Gilbert
1975 – 1980: La realizzazione delle tecniche di
ingegneria genetica
• 1955: scoperta della DNA – polimerasi (A. Kornberg)
• 1983: la Polymerase chain reaction
•
• Il sequenziamento del DNA è un processo che
serve a mettere in fila le basi che costituiscono il
frammento di DNA in analisi, in modo da poterlo
leggere propriamente ed analizzare.
• Conoscere l'esatta sequenza delle basi è di
fondamentale importanza per tutti i modelli di
ricerca in biologia molecolare poiché rende
possibile stabilire la presenza di mutazioni, la
struttura primaria dei geni, la localizzazione di
specifici elementi (promotori, terminatori,
sequenze satelliti)
Sequencing methods: Sanger
sequencing
Gli studi sul DNA ed in particolare sul DNA
ricombinante e l’evoluzione delle tecniche
di sintesi chimica hanno permesso di
realizzare
sonde
genetiche
che,
mediante reazioni di ibridazione degli acidi
nucleici, sono state ampiamente impiegate
per la rilevazione ed identificazione
genica
Le basi teoriche della PCR furono
descritte da Gobind Khorana negli anni
’70 (J Mol Biol 1971)
Suscitò particolare interesse solo nella
metà degli anni ’80 quando Kary Mullis
descrisse una tecnica che consentiva di
ottenere grosse quantità di DNA di geni a
copia singola dal DNA genomico.
Sometimes a
good idea
comes to you
when you are
not looking
for it
K.B. Mullis
Prima della sua scoperta, per effettuare
l'amplificazione del DNA con tecniche di
laboratorio, era necessario aggiungere
nuovo enzima dopo ciascun ciclo di
riscaldamento, favorendo così la
possibilità di inquinamento del campione e
non permettendo la completa automazione
del processo
• La procedura iniziale prevedeva l’utilizzo del frammento
di Klenow dell’enzima DNA polimerasi di E.Coli che
veniva aggiunto fresco ad ogni ciclo di amplificazione:
questo enzima essendo termolabile veniva infatti
inattivato durante il passaggio di denaturazione del DNA.
• L’avvento della Taq DNA polimerasi da Thermophilus
aquaticus ha notevolmente facilitato l’automazione di
tale procedura e ha permesso di lavorare a temperature
di annealing e di estensione (72°C) molto più elevate,
aumentando così la stringenza dell’ibridazione fra primer
e templato e quindi la specificità del prodotto amplificato.
R. Williamson (Molecular genetics and the transformation
of clinical chemistry, Atlanta 1989)
…la chimica clinica si trova in una crisi di identità
schiacciata fra le prime grandi esperienze di
automazione e dal progredire della ricerca nell’ambito
della diagnostica molecolare…..
….I grandi progressi analitici, la sempre migliore
definizione delle patologie associate a difetti genetici e
gli studi sulle basi molecolari della suscettibilità alle
malattie complesse porteranno in un futuro non troppo
lontano all’allargamento delle ricerche molecolari dai
laboratori specialistici ai “laboratori tradizionali”.
Sta al chimico-clinico rispondere a questa sfida (o
opportunità) riorganizzando e riqualificando la propria
attività
……. dalla PCR convenzionale al multiplexing
alla Real Time PCR in «urgenza» a
……………!!!!!!!???
Variations and modifications of PCR
Hot start PCR
Prevention of non-specific amplification
Nested PCR
Designed mainly to increase sensitivity
RT-PCR
Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was developed to amplify RNA
targets
Multiplex PCR
Two or more sets of primers specific for different targets are introduced
in the same tube, allowing multiple target sequences to be amplified
simultaneously
Broad-range PCR
This application uses conserved sequences within phylogenetically
informative genetic targets to diagnose infection : e.g. universal
primers set to target herpesvirus infections
Arbitrarily primed PCR
Involves the use of a single short (10-15 base) arbitrarily chosen primer
to amplify genomic DNA under low-stringency conditions. Useful in
determining whether 2 isolates of the same species are
epidemiologically related
Quantitative PCR
Normalization to internal or external standards.
Value in determinig the clinical significance of a positive qualitative
result for therapy, for clinical course and responsiveness to therapy
Increasing use of automation
Sample extraction process
Instrument automates: manual steps are limited to loading and
unloading, with reagents in sealed, bar-coded, ready-to-use
cassettes for fast and accurate reagent data entry
Automated PCR System
Assay for detection
Assay for quantification
•Chlamydia trachomatis
•Neisseria gonorrhea
•Mycobacterium avium
•Mycobacterium intracellulare
•HIV-1 viral load quantification
•CMV viral load quantification,
•Hepatitis B virus (HBV) viral load
•Hepatitis C virus (HCV viral load
Automated Sequencing
HIV, HCV, HBV (viral genotyping and
resistance testing)
TOTAL
AUTOMATION
Insert Swab into
Elution Reagent Vial and
Break at Scope
1
Vortex and Dispense
Sample into Port S
2
Total Hands-On time <1 Minute
Insert Cartridge and
Start Assay
3
•I microarrays sono caratterizzati da una potenziale
capacità di rilevazione ed identificazione di migliaia di
geni microbici
•Sebbene inizialmente applicati alla ricerca, ed in
particolare a studi di espressione genica, il loro utilizzo
nei laboratori di microbiologia clinica sta diventando una
realtà destinata, nell’immediato futuro, a modificare la
diagnostica microbiologica
•La capacità di rilevare un gran numero di patogeni e/o
monitorare la variabilità delle popolazioni microbiche e
l’approccio metagenomico potrebbero modificare la
nostra capacità di comprensione delle malattie infettive
Evoluzione di Virochip™
Metagenomics for microbial detection / discovery
Genomics
Deep Sequencing
Massively Parallel
PCR and mass
spectrometry (PLEX(PLEX-ID)
Microarrays
• La tradizionale ricerca genomica sui microrganismi
determina le sequenze di DNA di singoli microbi,
esaminando ceppi coltivati. La metagenomica è un
approccio basato sull'utilizzo di tecniche genomiche
moderne per lo studio di comunità microbiche
direttamente nel loro ambiente naturale, evitando così il
problema del prelevamento e coltivazione in laboratorio.
• Nella metagenomica, l’informazione sulle sequenze di
DNA viene estratta da intere comunità microbiche in situ.
• Si basa sul sequenziamento del genoma di
microrganismi di uno stesso luogo, la cui analisi
effettuata nel proprio habitat naturale viene definita
metagenoma. La maggior parte di questi organismi sono
di difficile coltivazione a causa delle loro particolari
esigenze.
Microarray for Pathogen Discovery
A new monkey adenovirus
(Chiu, Stewart, 2003 Vir.)
ABV, the likely etiologic agent of
PDD (Kistler, et al., 2008, Virol J)
HTCV, a novel human cardiovirus in children
with respiratory / gastrointestinal infection
(Chiu, et al, 2008, PNAS)
XMRV, a gammaretrovirus associated a type of hereditary
prostate cancer (Urisman, et al, 2006, PloS Pathogens)
A Metagenomics Investigation of the 2009 Influenza A
H1N1 Pandemic (n=17)
2009 H1N1 is More Similar to Swine than
Human Influenza H1N1 by Virochip
The PLEX-ID system combines the sensitivity of nucleic acid
amplification with the accuracy of high-performance
electrospray ionization mass spectrometry followed by basecomposition analysis to identify a broad array of
microorganisms, including bacteria, viruses, fungi, and
parasites. Certain PLEX-ID assays also provide information
about drug resistance, virulence, and strain type. Anticipated
public health and biodefense applications include epidemiologic
research and identification of emerging or previously unknown
agents.
Applicazioni in Clinica
Studio dei profili di espressione genica
Determinazione dei polimorfismi genomici dell’ospite
Finora riservati quasi esclusivamente
all’uso nella ricerca
– M. tuberculosis, Salmonella, Shigella
– Sepsi
– SNPs (B19v, HCV)
Proteomics meets microbiology
The ever increasing number of completed sequences for important
human pathogens will lead to a similar rise in demand for new methods to
facilitate identification and functional analysis of the gene products
PROTEOMA
«PROTEins within a genOME»
Proteomics can be defined as the
study of the full set of proteins
expressed by an organism, tissue
or cell, and the change in their
expression patterns under different
conditions
Carolyn I. Phillips et al. Proteomics meets microbiology:
technical advances in the global mapping of protein
expression and function Cellular Microbiology (2005)7(8),1061
Il proteoma è l'insieme di tutti i possibili
prodotti proteici espressi in una cellula,
incluse tutte le isoforme e le modificazioni
post-traduzionali. Il proteoma è dinamico
nel tempo, varia in risposta a fattori esterni
e differisce sostanzialmente tra i diversi
tipi cellulari di uno stesso organismo
Attualmente la proteomica si sviluppa su
tre diversi livelli:
• Proteomica sistematica: identificazione e
caratterizzazione del proteoma
• Proteomica differenziale: espressione differenziale delle
proteine in cellule diverse di uno stesso organismo ed in
momenti di vita diversi di una stessa cellula;
• Proteomica funzionale: comprende lo studio delle
interazioni tra proteine (interattomica), lo studio delle
interazioni tra una proteina ed i suoi substrati
(metabolomica) e lo studio delle funzioni specifiche delle
proteine (genomica enzimatica, genomica biochimica).
Proteomic methods
•
•
•
•
High resolution two-dimensional electropresis (D-GE)
High performance liquid chromatografy (HPLC)
Mass spectrometry (MS)
Protein microarray
The development of automated, highthroughput proteomic technologies such
as MALDI-TOF MS has enabled large
numbers of samples to be analyzed
simultaneously in a short time
J. B. Fenn and K.Tanaka
Nobel Prizes in Chemistry 2002 "for their
development of soft desorption ionisation methods
for mass spectrometric analyses of biological
macromolecules"
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight
mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
S. Emonet, et al. Application and use of various mass spectrometry methods
in clinical microbiology . Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1604–1613
The first description of the use of MS for bacterial identification
Small amount of
biological material
Anhalt JP, Fenselau C. Identification of bacteria using massspectrometry. Anal Chem 1975; 47: 219–225.
VanBogelen RA, Abshire KZ, Moldover B, Olson ER, Neidhardt FC.
Escherichia coli proteome analysis using the gene-protein
database. Electrophoresis. 1997 Aug;18(8):1243-51.
MALDI-TOF MS
1-2 min
- Automated and rapid molecular
identification of microorganisms
•
•
•
•
•
•
•
•
Enterobacteriaceae
Non-fermenting bacteria
Staphylococci
Enterococci
β-haemolytic streptococci
Anaerobes
Yeast
Mycobacteria
-Virulence/resistance factors
Measurement
- high accurate
- reproducibile
- low cost -analysis
Challenges
• Sample type , quality, specific storage
• Hardware/software/database
Maier, T. , Klepel, S. , Renner, U. , & Kostrzewa, M. . (2006).
Fast and reliable MALDI-TOF MS-based microorganism identification.
Nature Methods Application Notes, 25(2), 68-71
Il laboratorio di diagnostica molecolare
Ottimizzazione
flusso di lavoro
Affidabilità
Ampio menu
applicativo
Flessibilità
Convenienza
Soluzioni basate
su costo-efficacia
Gestione di vari
tipi di campione
Standardizzazione
Consolidamento
Conformità alle
normative
(CE-IvD)
Facilità d‘utilizzo
Sicurezza di
processo
Risparmio
di tempo
Tracciabilità
del campione
La dotazione tecnologica di cui disponiamo
deve essere inserita in una organizzazione del
lavoro tale da garantire dei risultati di qualità
analitica di eccellenza in tempo utile per la cura
del paziente.
Solo così i nostri risultati diventano
clinicamente significativi.
Principali criteri per individuare l’utilità e la
valenza clinica di un nuovo test diagnostico
• C’è un razionale perché il test sia richiesto dal
clinico?
• Il test è utile per la salute del paziente?
• Un test più semplice può fornire informazioni
equivalenti?
• Il test aumenta il livello di conoscenza clinica?
• E’ possibile fare a meno del test?
Principali criteri per la scelta di un
test diagnostico
• Utilità clinica: capacità di un test di modificare la
decisione del medico in senso diagnostico,
prognostico e terapeutico
• Efficacia: capacità di fornire informazioni utili per
la gestione del paziente
• Efficienza: capacità di raggiungere l’obiettivo
con la migliore allocazione delle risorse
Ma…….
Problemi interpretativi che da sempre
sono alla base della valutazione clinica
del referto microbiologico sono
frequentemente “amplificati”
dalle tecniche molecolari: non sempre
il dato strettamente biologico correla
con la malattia …….
Pros e Cons of molecular
diagnostic methods
DILEMMAS
Not highly sensitive
Low contamination risk
Highly sensitive
High contamination risk
Not highly specific
Wide identification range
Highly specific
False negatives
Based on single or few
markers = incomplete view
Low cost and fast
Genome-wide or Metagenomewide identification
High cost, time-consuming
…..ciò richiede una capacità di
interpretazione del referto molecolare
che oltre alla garanzia che si è
proceduto secondo uno standard
qualitativo di eccellenza sia anche il
frutto di una attenta valutazione clinica
……..Il futuro dipende
soprattutto da noi…….
• Riduzione di operatori con formazione
specialistica specifica
• Riduzione delle capacità critiche
sperimentali e di valutazione tecnica
• Emergenza di nuove professioni
…Stay hungry, stay ………
GRAZIE
PER
L’ATTENZIONE