DIAGNOSTICA
MICROBIOLOGICA
IL SUCCESSO DELLA MEDICINA MODERNA
DIPENDE DALLA INDIVIDUAZIONE DI SPECIFICI
MICRORGANISMI:
-Virus
-Batteri
-Funghi
-Parassiti
In diversi tipi di campioni
diagnosi DIRETTA
ricerca diretta del
microrganismo responsabile
della malattia o di parti di
questo
Diagnosi
microbiologica
diagnosi INDIRETTA
ricerca degli anticorpi
specifici che si sviluppano in
seguito all’infezione da parte
del microrganismo
SFIDE NELLA DIAGNOSI
MICROBIOLOGICA
DIAGNOSI ED INDIVIDUZIONE DI MICRORGANISMI:
- microrganismi non coltivabili o difficili da coltivare
- necessità di refertazione veloce
- inadeguatezza dei metodi fenotipici (biochimici)
PROGNOSI E MANAGEMENT:
- necessità di informazioni quantitative
- test di suscettibilità (resistenze) senza coltivazione
MESSA A PUNTO DI UN BUON
SISTEMA DI DIAGNOSI
Un buon sistema diagnostico dovrebbe avere tre
caratteristiche principali
1 Sensibilità: misura della capacità del test di individuare
quantità molto piccole del target in presenza di altre
microrganismo
2 Specificità: il test deve fornire un risultato positivo solo
in presenza del microrganismo target
3 Semplicità: il test deve essere effettuato in maniera
efficiente (e possibilmente economica) a livello di routine
Diagnostica virologica
1. Diagnosi diretta
1. Esame diretto del campione
1. Individuazione antigeni
2. Individuazione acidi nucleici
2. Isolamento virale dal campione
2. Diagnosi indiretta
1. Ricerca anticorpi virus-specifici
DIAGNOSI DI LABORATORIO
INDIRETTA:
LA SIEROLOGIA
Sierologia
E’ la messa in evidenza della risposta
immunitaria dell’ospite nei confronti
dell’agente patogeno
Tecniche per rilevare gli anticorpi
specifici
Sierologia
Definizioni
• Titolazione: valutazione “quantitativa” degli anticorpi
nel siero del paziente (IgG, IgM, IgA)
• Sieroconversione, aumento titolo anticorpale tra fase
acuta e fase convalescente dell’infezione
• Infezione primaria: prima volta che un individuo viene
infettato da un agente patogeno
• Reinfezione: alcuni agenti patogeni possono reinfettare
lo stesso individuo (gli Ab già in circolazione NON sono
protettivi)
Profilo sierologico tipico dopo un’infezione
Titolo anticorpale nel siero
Reinfezione
IgG
IgM
Tempo (settimane)
Le IgM sono le prime a comparire, compaiono poi le IgG
Nel corso di una reinfezione, le IgM possono essere assenti o
presenti transitoriamente a basso titolo
La sierologia è l’unica indagine di
laboratorio che consente di discriminare
tra infezioni primarie ed episodi di
ricorrenza di una malattia infettiva
Importanza prognostica
Importante per il corretto management
Infezione primaria
Criteri per la diagnosi di infezione primaria
Presenza di IgM
Sieroconversione
Aumento di 4 volte o più del titolo di IgG o
degli anticorpi totali tra il siero acuto e
convalescente
Un singolo titolo elevato di IgG (o anticorpi
totali) è poco attendibile
Reinfezione
Criteri per la diagnosi di reinfezione
Aumento di 4 volte o più del titolo di IgG o
degli anticorpi totali tra siero acuto e
convalescente
Assenza o lieve aumento di IgM
Anticorpi nel liquor
Usati soprattutto per la diagnosi dell’encefalite
da HSV e VZV
Il liquor normalmente non contiene anticorpi (o
basse concentrazioni)
La presenza di anticorpi suggerisce la presenza di
meningite o meningoencefalite
Titolo di Ac nel liquor/ titolo di Ac sierico > 1/100
è indicativo di meningite o meningoencefalite
La diagnosi dipende dalla presenza di una barriera
emato-encefalica intatta
Tecniche di diagnosi sierologica
• Tecniche classiche:
–
–
–
–
–
Test di fissazione del complemento
Test di emoagglutino-inibizione
Tecniche di IF
Test di neutralizzazione
Immunoelettroforesi
• Nuove tecniche:
–
–
–
–
–
Radioimmunoassay (RIA)
Enzyme linked immunoasorbent assay (ELISA)
Agglutiazione di paricelle di lattice
Wstern Blot
RIBA, Line immunoassay
Test di fissazione del complemento
Antigeni di superficie cellulari e anticorpi
specifici danno luogo ad un processo di lisi in
presenza di complemento
il fenomeno non si verifica se il complemento è
stato sottratto da una reazione antigeneanticorpo avvenuta in precedenza
FISSAZONE DEL COMPLEMENTO
Test di fissazione del complemento
1/4
1/8
1/16
1/32
Siero acuto
Siero
convalescente
Antigene X posto in presenza del siero e di complemento
reazione antigene-anticorpo e sottrazione di
complemento
Aggiunta di emazie di montone sensibilizzate e antisiero
specifico non avviene la lisi dei globuli rossi in quanto il
complemento è stato "utilizzato" dalla precedente reazione’
Emoagglutinazione ed Inibizione
della Emoagglutinazione
Virus emoagglutinante
Anticorpi inibenti l’emoagglutinazione
Eritrociti emoagglutinabili (dipende
dalla specie animale)
FASE 1: Diluizioni seriali di virus vengono incubate
con una quantità standardizzata di eritrociti
Virus emoagglutinante
Virus non-emoagglutinante
FASE 2: Se il virus è emoagglutinante gli eritrociti
sedimentano formano una ampia area agglutinata.
Diversamente formano un sedimento compatto
Virus emoagglutinante
Virus non-emoagglutinante
Il titolo emoagglutinante di un virus corrisponde alla più
alta diluizione in cui si osserva ancora emoagglutinazione
INIBIZIONE DELL’EMOAGGLUTINAZIONE
Diluizioni seriali del siero in esame vengono incubate con
quantità standardizzate del virus emoagglutinante
Siero negativo
Siero positivo
FASE 2: Successivamente vengono aggiunti eritrociti
agglutinabili
Siero negativo
Siero positivo
FASE 3: Se sono presenti anticorpi inibenti
l’emoagglutinazione, gli eritrociti sedimentano formando
un bottone a margini netti
Siero negativo
Siero positivo
Il titolo inibente l’emoagglutinazione di un siero
corrisponde alla più alta diluizione in grado di inibire
l’emoagglutinazione
ELISA per ricerca anticorpi anti-HIV
ELISA su micropiastra: lo sviluppo di colore indica positività nei
test
Immunofluorescenza
Ricerca di Anticorpi nel siero del paziente
cimentato con cellule infettate virus specifici
Western Blot
HIV-1 Western Blot
• Corsia 1: Controllo positivo
• Corsia 2: Controllo negativo
• Campione A: Negativo
• Campione B: Indeterminato
• Campione C: Positivo
Sierologia per diagnosi di
infezione virale
Utilità dei risultati sierologici
L’utilità del dato sierologico dipende dal singolo virus
Per es., per virus come quello della rosolia e dell’epatite
A, l’insorgenza dei sintomi clinici coincide con lo
sviluppo di Ac. Il riscontro di IgM o di un titolo
crescente di IgG nel siero del paziente indica una
malattia attiva
Tuttavia, molti virus spesso causano sintomi clinici
prima della comparsa di Ac (es. diarrea, sintomi
respiratori). In questo caso, la diagnosi sierologica
sarà retrospettiva
Altri virus producono malattia clinica mesi o anni dopo
la sieroconversione (per es. HIV). Nel caso di questi
virus, la semplice presenza di Ac è sufficiente per
porre diagnosi definitiva.
Problemi con la sierologia
Lungo periodo di tempo richiesto per la diagnosi
basata sul confronto tra siero acuto e convalescente
Infezioni lievi, come quelle causate da HSV-2
(infezione genitale), possono non produrre una
risposta immunitaria umorale rilevabile
Cross-reattività antigenica tra virus correlati (es.
HSV e VZV) possono portare a risultati falsi positivi
Pazienti immunocompromessi spesso danno una
risposta umorale ridotta o assente
Pazienti trasfusi con sangue o emoderivati possono
dare falsi positivi a causa del trasferimento di Ac
DIAGNOSI DI LABORATORIO
DIRETTA:
Isolamento del virus o
messa in evidenza di
parti di esso
Isolamento in coltura cellulare
Fibroblasti non infettati
Fibroblasti infettati da rhinovirus
Corpi di inclusione nelle cellule
infettate
Immunofluorescenza
Saggi ELISA per rilevare antigeni virali
Western blot per evidenziare antigeni virali
Western blot
Diagnostica molecolare
TARGET
(bersaglio)
3’
AGTACATGCA
TCATGTACGT
DNA
3’
5’
PROBE
(sonda)
TCATGTACGT
5’
5’
3’
Fred Tenover (1988):
“L’obiettivo della tecnologia delle sonde
di DNA è eliminare la coltivazione di
routine dei microrganismi”
Diagnostica molecolare in microbiologia
Individuazione diretta di un agente eziologico
mediante dimostrazione di sue componenti
specifiche nel materiale patologico con ottima
specificità e sensibilità e senza procedere a
isolamento in vitro
Proteine (utilizzando anticorpi)
Acidi nucleici (utilizzando sonde di acidi nucleici)
Ma ‘diagnostica molecolare’ significa ormai
diagnostica per saggi su acidi nucleici
Possibili svantaggi delle tecniche molecolari
rispetto alle tecniche classiche
• Necessitano di laboratori attrezzati
• Il personale deve avere esperienza di biologia
molecolare.
• Costi ancora elevati
• Falsi positivi (contaminazioni)
• Non forniscono alcune informazioni che ci
fornisce SOLO l’isolamento del microrganismo
– È vitale?
Diagnostica molecolare in microbiologia:
VANTAGGI ATTESI
Specificità
Sensibilità
Rapidità
Praticità
Economicità
Vasta applicabilità
Diagnostica molecolare in microbiologia
VANTAGGI ATTESI
•Specificità
Sensibilità
Rapidità
Praticità
Economicità
Vasta applicabilità
Introduzione
• Le tecniche di biologia molecolare
messe a punto per la diagnosi
microbiologia sono state inizialmente
basate sul principio dell’utilizzo di
sonde oligonucleotidiche in grado di
appaiarsi con l’acido nucleico bersaglio
• Ancora oggi molti saggi commerciali
sfruttano lo stesso principio
Processazione campione
Acidi nucleici
Esposizione a sonda in
fase liquida o solida
Sistema di rivelazione del
riconoscimento fra sonda e bersaglio
POSITIVO
NEGATIVO
Caratteristiche ed utilizzo delle
sonde
• Possiamo definire sonda una sequenza
nucleotidica in grado di riconoscere con
assoluta specificità ed elevata sensibilità
una sequenza complementare, mediante
interazioni molecolari
• La sonda ideale può appaiarsi solo al suo
bersaglio
• Può essere a DNA o ad RNA
• La dimensione può andare da 10 a 104
nucleotidi ( 10 a 40)
Principi di ibridazione degli
acidi nucleici
• L’ibridazione è la reazione attraverso la quale
due sequenze di acidi nucleici a singolo
filamento fra loro complementari reagiscono
specificamente formando un ibrido
• Tale ibrido si forma mediante specifico
appaiamento tra basi complementari
• La stabilità dell’ibridazione dipende dal grado
di appaiamento delle basi dei due filamenti
• La stabilità di un ibrido si esprime mediante la
Tm (temperatura di melting), ossia il punto
medio dell’intervallo di temperatura in cui i
due filamenti si separano
Tm
• E’ la temperatura in corrispondenza della
quale l’ibrido è denaturato al 50%
• E’ un parametro per valutare la
temperatura ideale alla quale condurre
l’ibridazione
• Si calcola che la temperatura ottimale di
ibridazione si situi circa 20°C al di sotto
della Tm
• La Tm fisiologica del DNA si trova
nell’intervallo fra 85-95°C ed è tanto più
alta quanto maggiore è la percentuale di GC
in una sequenza
Fattori che influenzano la
stabilità dell’ibrido
1. Lunghezza degli acidi nucleici
le sonde brevi
tendono ad ibridare molto rapidamente, ma
ovviamente sono più soggette ad ibridazioni
aspecifiche
2. Composizione in basi
la % in GC influenza
la Tm dell’ibrido Tm=0.41 (%GC) + 69.3
in un range da 0.01-1M si
3. Forza ionica
registra una variazione di Tm pari a 16°C per ogni
variazioni di 10 della concentrazione di sali
4. Percentuale di mismatch
si verifica una
riduzione della Tm di 1°C per ogni punto % di
mismatch
Fattori che influenzano la
stabilità dell’ibrido
A
T
C
G
[NaCl]
100
% di sonda
non appaiata
al bersaglio
50
0
Tm
T
Temperatura di ‘melting’ (Tm):
temperatura alla quale il 50% di una
sonda è appaiata al bersaglio
complementare
Diagnostica molecolare
Target
1) Gene che fornisce una funzione essenziale al microrganismo e
contenente regioni con sequenze sia conservate (invarianti) che variabili
•seq. altamente conservata: per identificazione
agente patogeno (es. gene dell’rRNA)
•seq. variabile intraspecie: per studi epidemiologici
2) Gene di virulenza la cui identificazione distingue il ceppo (o il tipo e la
specie) patogeno da quello non patogeno strettamente correlato
gene in grado di codificare tossine, macromolecole
con proprietà antigeniche o con attività adesinica
Metodi per ottenere le
sonde
• Generalmente la sequenza corrispondente alla sonda
viene clonata in un vettore
Primer antisenso
M13
EcoRI
EcoRI
SONDA
Primer senso M13
+1
pCR II TOPO
3900 pb
Metodi per marcare le sonde
• Le sostanze utilizzate per la
marcatura delle sonde vengono
incorporate nella sonda stessa
mediante una serie di procedimenti:
• Sono degli esempi la
– Nick translation
– PCR
– Trascrizione in vitro
Marcatura della sonda
• Si incorporano nucleotidi modificati
con:
– ISOTOPI RADIOATTIVI
– BIOTINA
– MOLECOLE FLORESCENTI
Marcatura della sonda
• Generalmente la modificazione
mediante fosfatasi alcalina o
perossidasi di rafano viene effettuata
chimicamente
• Il legami dell’enzima alla sonda
avviene attraverso un composto detto
spaziatore che espone l’enzima al di
fuori della sonda in modo che la
reazione di ibridazione non risenta di
problemi di ingombro sterico
Strategie di ibridazione
• In soluzione, in fase solida o in situ
– In soluzione: è la più efficace e rapida, ma
richiede la separazione degli ibridi dalla sonda
libera. Questo viene effettuato con colonne di
idrossiapatite, che lega il DNA ds
– Su fase solida: campione denaturato ed
immobilizzato su un supporto (filtro di
nitrocellulosa o nylon) e sonda marcata in
soluzione (Dot Blot, Southern Blot, Northern
Blot, membrane-filter assay).
– In situ: a partire da strisci, colture cellulare o
sezioni di tessuto nelle quali si ricerca il genoma
dell’agente patogeno
Tecniche di ibridazione “classiche”
1. Digestione ed
elettroforesi
2. Trasferimento
su membrana
“Southern blot”
3. Ibridazione con
sonda marcata
4. Rimozione
sonda non legata
5. Autoradiografia
“Southern blot”
Tecniche di ibridazione “classiche”
‘Membrane-filter’ assay
Tecniche di ibridazione “classiche”
La specificità della reazione dipende dalla
complementarietà fra probe e target e dalle
condizioni sperimentali impiegate (stringenza)
La sensibilità di questi metodi è spesso non
superiore a quella dei metodi convenzionali di
isolamento,
Essendo in genere sistemi abbastanza laboriosi, non
hanno trovato vasta applicazione diagnostica
Diagnostica molecolare in infettivologia
VANTAGGI ATTESI
Specificità
•Sensibilità
Rapidità
Praticità
Economicità
Vasta applicabilità
AMPLIFICAZIONE
• L’amplificazione può avvenire
attraverso due strategie generali o
una combinazione delle due:
– La sonda può essere dotata di un sistema
di amplificazione del segnale
– Può essere incrementata la quantità
dell’acido nucleico bersaglio
Diagnostica molecolare - Sistemi di amplificazione
1.
sonda
Amplificazione
del segnale
identificazione
2.
Amplificazione
del bersaglio
identificazione
Tecniche impiegate in Biologia Molecolare
per ottenere una amplificazione del
segnale
• Una sonda che ibrida con pochi bersagli
può essere identificata solo se il segnale
è sufficientemente amplificato
•Esistono vari sistemi per raggiungere
questo scopo:
•Branched DNA (bDNA)
•Hybrid Capture System
Schema del “Branched DNA” (bDNA)
E’ costituito da una sequenza oligonucleotidica concepita per ibridare
indirettamente, tramite particolari sonde leganti, con l’acido nucleico
bersaglio e da una ramificazione di oligonucleotidi che servono come
sito di ibridazione per sonde coniugate con fosfatasi alcalina
Le sonde leganti fanno da ponte sia tra l’acido nucleico bersaglio e le
sonde a cattura (legate al supporto), sia tra l’acido nucleico bersaglio
e il DNA ramificato
L’amplificazione del segnale è dovuta all’attacco al DNA ramificato
legato indirettamente al DNA bersaglio di 60-300 molecole di enzima
E’ un sistema quantitativo
Utilizzato per virus delle epatiti e HIV
Schema del “Branch DNA”
(bDNA)
Sistema di “cattura dell’ibrido”
(Hybrid Capture System)
1. Estrazione acidi nucleici del microrganismo
2. Ibridazione del DNA bersaglio con una sonda ad
RNA
3. “Cattura” ibridi RNA/DNA in fase solida (formato tubo o
micropiastra)
4. Reazione degli ibridi “catturati” con anticorpi coniugati
5. Rilevazione del segnale (chemoluminescenza o fluorescenza)
Tecniche impiegate in Biologia Molecolare
per ottenere una amplificazione del
target
•PCR
•LCR
•Sistemi basati sulla trascrizione (TAS, 3SR,
NASBA, LAT)
•Cyclic Probe Reaction
•Qβ
β Replicase Amplification
•Strand Displacement Amplification
Amplificazione degli acidi
nucleici
LA PCR
• Reazione a catena della polimerasi (PCR)
• Ha rivoluzionato la biologia molecolare
• 1983 Mullis
PCR - polymerase chain reaction
Reazione a catena in vitro, catalizzata da DNA-polimerasi,
mediante la quale si riproduce esponenzialmente uno
specifico frammento di DNA delimitato da sequenze note
PCR
Diagnostica molecolare – Sensibilità
confronto tra metodi
Ibridazione
diretta
amplificazione
sonda
identificazione
PCR
identificazione
LA PCR
La PCR è un metodo rapido e versatile che consente
l’amplificazione in vitro di sequenze bersaglio presenti in
un campione eterogeneo di molecole di acidi nucleici
Si tratta di una reazione enzimatica, di carattere
ciclico, che consente di copiare la sequenza bersaglio
sfruttando una DNA polimerasi termostabile che utilizza
come innesco due oligonucleotidi complementari al
target
Schema della PCR
Ogni ciclo aumenta il numero di copie di target (prodotto)
PCR - componenti
• Campione (estratto di DNA/RNA)
• Buffer (Tris pH 7.8-9.0; KCl ~ 50 mM)
• dNTPs (50-200 µM ciascuno)
• Primer (5-20 pmol/50 µl)
• Enzima: DNA-pol DNA-dipendente termostabile
(es. Taq, Pfu, Tli, Tth, etc.), ~ 1 U/µl
• Ioni Mg2+ (cloruro, solfato) ~ 1.2-3.0 mM
PCR – parametri da ottimizzare
• Numero di cicli (25-35 per la maggioranza delle applicazioni)
• Temperatura annealing
• Concentrazione Mg2+
• Disegno primer
• Additivi
– DMSO (regioni ricche in GC)
– ssDNA-binding protein (aumento specificità)
– DNA-pol proofreading (‘long PCR’, fino a 30-40 kb)
Primer design
Target (+)
5’ CGGCAAGTCGCTAGGCTCCGC...ATGGCTGCTCTAGCTAGGTGGAGAA 3’
3’ GATCGATCCACCTC 5’
Primer (+)
5’GCAAGTCGCTAGGC 3’
Primer (–)
3’ TCCGTTCAGCGATCCGAGGCG...TACCGACGAGATCGATCCACCTCTT 5’
Target (–)
Primer design
5’ ACACTTGACCGATGCTAGCTAGGTCAAGAAGA 3’
GATGCTAGCTA
C
G
C
G
A
T
G
C
T
A
T
A
5’ ACA C
G AAGA 3’
Evitare strutture secondarie (loop)
Primer design
5’ CGTAGCTGGATGCTAGCTAGGTACAGAA 3’
5’ CACGTCGTAGCTGCTGATCTCGGTTCTG 3’
5’ CGTAGCTGGATGCTAGCTAGGTACAGAA 3’
3’ GTCTTGGCTCTAGTCGTCGATGCTGCAC 5’
dimeri di primer
Evitare complementarietà fra i primer
Sistemi di rilevamento del prodotto di PCR
I sistemi di
rilevamento dei
prodotti di
amplificazione
sfruttano:
Elettroforesi su
gel
Ibridazione in
fase solida o
liquida
Tecniche per la rivelazione dei prodotti di PCR (Ibridazione)
Ibridazione: - per dimostrare la specificità del prodotto ottenuto
- per identificare una mutazione del DNA amplificato
In fase solida:
Elettroforesi, trasferimento del DNA su filtro di nylon o su carta di
nitrocellulosa, fissaggio e denaturazione, marcatura con DNA
sonda marcato
In fase liquida:
Denaturazione prodotto di amplificazione, ibridazione con
oligonucleotide interno marcato e risoluzione su gel
Tecniche per la rivelazione dell’ibrido prodotto PCR/sonda
Metodi diretti:
Prevedono l’impiego di traccianti diretti come fluorofori, radionuclidi o il
legame dell’enzima rivelatore direttamente alla sonda e l’aggiunta del
substrato corrispondente (l’enzima legato alla sonda è in grado di
trasformare substrati incolori in prodotti colorati)
Es. per fosfatasi alcalina o perossidasi si usano substrati enzimatici
chemiluminescenti: in presenza dell’enzima il substrato forma un
intermedio altamente instabile che si decompone con emissione di
energia luminosa.
L’intensità del segnale luminoso, rivelato mediante impressione di
una pellicola fotografica o mediante luminometro, è direttamente
proporzionale al numero di molecole di enzima implicate nella
reazione.
Tecniche per la rivelazione dell’ibrido prodotto PCR/sonda
Metodi indiretti:
Prevedono l’impiego di traccianti indiretti (molecole intermediarie) in
grado di riconoscere i “marcatori” fissati alla sonda o all’amplificato. A
loro volta, questi intermedi vengono marcati con enzimi di rivelazione.
•uno dei sistemi più usati: biotina/avidina: il DNA
amplificato marcato con biotina (i primer sono biotinilati) viene
ibridato con la sonda, l’ibrido biotinilato viene incubato con
l’avidina coniugata con l’enzima (es. perossidasi di rafano) ed
infine il substrato viene messo a contatto con il complesso
DNA-biotina-avidina-enzima. Reazione colorimetrica misurata
allo spettrofotometro
• l’ibrido viene riconosciuto tramite Ac diretti contro la
molecola marcante (Ac anti-biotina) o contro la doppia elica di
DNA a doppio filamento; infine viene utilizzato un Ac anti-Ac
marcato con un enzima. L’aggiunta del substrato dell’enzima
rivela il complesso formatosi
Tecnologia Amplicor
Blue
complex
Sonda legata alla BSA
BSA ancorata alla plastica
Colorazione rilevata
alla spettrofotometro
Requisiti di qualità per i laboratori
che offrono diagnostica basata su
PCR
Da “Herpes: Progress with diagnostic tests and vaccines for
Alphaherpesviruses”. A cura di PD. Griffiths e A. Volpi
CONTROLLI QUALITATIVI DELLA PCR
Per valutare • la sensibilità e la specificità della reazione
• l’eventuale presenza di falsi negativi o falsi positivi
1) Controllo POSITIVO: campione contenente la sequenza bersaglio da
amplificare; è opportuno che questo campione non contenga un numero troppo
elevato di copie (> 105-106) per evitare durante la manipolazione di creare
aerosol, fonte di contaminazione
Quantità elevata non permetterebbe di evidenziare un eventuale calo di
sensibilità della reazione (potrebbe dare risultati falsamente negativi nei
campioni in cui il numero di copie è notevolemente inferiore rispetto al controllo)
2) Controllo NEGATIVO: campione non contenente la sequenza bersaglio da
amplificare (per valutare la eventuale contaminazione).
NB: nella fasi di standardizzazione è consigliabile includere un controllo di
SPECIFICITA’: campione con sequenze non specifiche
Riduzione della
contaminazione
• Metodi per l’eliminazione dell’amplicone:
– Trattamento con 4’-aminometil-isopsoralene,
reagisce con la pirimidina per formare un
ciclobutano una volta fotoattivata. I legami
crociati che si formano bloccano la reazione di
estensione della polimerasi
– Uracile DNA glicosilasi: rimuove l’uracile dalla
catena zucchero-fosfato del DNA ss e ds. Il
sito risultante non può essere replicato dalla
polimerasi. In questo modo si possono trattare
primers ottenuti con uracile al posto della
timina o ampliconi ottenuti nello stesso modo
Sviluppo di un protocollo di PCR per applicazioni di
diagnostica microbiologica
analisi di sequenza (database)
disegno dei primer
Valutazione della sensibilità con
“stampi” a quantità nota
Valutazione della specificità impiegando molteplici
controlli costituiti da DNA (umano e virale)
campi di applicazione
Diversi metodi di PCR o sue
applicazioni specifiche
• RT-PCR: PCR preceduta da retrotrascrizione di RNA
in DNA
• Nested PCR
• PCR multiplex
• DNA finger printing dopo amplificazione
• RAPD
• PCR in situ
PCR “nested” (interna)
Consiste nella ri-amplificazione con una seconda coppia di primer “interna”
alla prima (2 reazioni di PCR)
Il frammento di PCR amplificato nella prima reazione di PCR con la coppia
di primer “più esterni” viene ulteriormente amplificato nella seconda
reazione di PCR con una coppia di primer che fiancheggiano una sequenza
interna al segmento bersaglio della prima reazione
Permette •di migliorare sia la sensibilità che la specificità
dell’amplificazione
•di evitare l’ibridazione del prodotto amplificato con sonde
specifiche
PCR “multiplex”
Per amplificare diversi segmenti genomici nella stessa reazione: vengono
utilizzate più coppie di primer
Scelta del target
genotipi virali: seq. geniche variabili
Posizione dei primer
in relazione alla lunghezza e alla sequenza
dei segmenti amplificati
Disegno dei primer
con cinetica di reazione simile
Sviluppo della reazione di PCR
a) ricerca condizioni adatte per ciascuna
coppia di primer, separatamente
b) aggiunta, in sequenza, delle coppie di
primer, modificando, se necessario, le condizioni
es: riduzione amplificazioni non specifiche
variazioni concentrazioni relative dei primer
Ottimizzazione della reazione
- aumento, se necessario, di alcuni componenti:
ioni magnesio, polimerasi
- variazione tempi e temperature dei cicli:
tempo di estensione più lungo
temperatura di annealing più alta
Multiplex PCR (Herpesvirus DNA pol)
Multiplex PCR (DNA polimerasi Herpesvirus)
PCR e digestione amplificato con enzimi di restrizione
Tipizzazione di HPV
Campione
AccI AluI
303
116
60
ND
Controllo +
AccI AluI
ND MW
1114/900
692
500/489
404
320
242
190
147
124
110
67
RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD)
Tecnica utilizzata per la caratterizzazione di organismi
a livello di DNA, basata sulla PCR
Viene utilizzata frequentemente per stabilire parentele
genetiche tra popolazioni
L’utilizzo di random primer consente di ottenere un DNA
fingerprinting
Un singolo primer a sequenza casuale, se lega due regioni
del DNA stampo in condizioni opportune può dar luogo ad
un amplificato
RAPD
Se il primer si lega in più siti del genoma potranno
essere ottenuti diversi amplificati di PCR
I diversi prodotti di amplificazione potranno essere
separati e visualizzati su gel di agarosio
Se due campioni di DNA hanno la stessa origine genetica
produrranno un pattern di bande simili
Questa procedura è ampiamente usata per distinguere
differenti ceppi di microrganismi
L’impiego della RAPD richiede riproducibilità dei
risultati, uso di DNA di qualità e l’impiego di diversi
primers
RAPD
RAPD
PCR “in situ ”
Permette di combinare lo studio della localizzazione cellulare, mediante
ibridazione in situ, con l’estrema sensibilità dell’amplificazione
L’acido nucleico (DNA) viene amplificato nelle cellule e nei tessuti
morfologicamente intatti.
Prevede diverse fasi:
1) Fissazione:
paraformaldeide (1-4%), formalina (10%),
acido acetico/etanolo (1/3)
2) Permeabilizzazione: enzimi proteolitici (proteinasi K per cellule fissate su
vetrino o pronasi per sezioni tissutali)
3) Amplificazione
4) Rivelazione:
diretta, basata su incorporazione di nucleotidi
marcati con fluorescina nel prodotto di
amplificazione
indiretta, con sonde marcate specifiche per il
prodotto amplificato: i prodotti ibridi vengono
individuati mediante metodi immunochimici o
autoradiografici
RT/PCR “in situ ”
Viene amplificato l’RNA: ad esempio un RNA messaggero o un RNA virale
Rispetto alla PCR in situ, prevede in più anche una fase di degradazione
del DNA genomico cellulare e la retro-trascrizione dell’RNA in DNA:
1) Fissazione
2) Permeabilizzazione
3) Digestione del DNA (DNAsi)
4) Retrotrascrizione (cDNA)
3) Amplificazione
4) Rivelazione
PCR “ in situ “
• PCR in situ indiretta di sequenze di DNA di
HBV in sezioni tissutali epatiche
PCR “in situ “
• PCR in situ indiretta di sequenze di DNA di
HIV-1 in cellule infettate e non infettate
Reazione a catena della ligsi
(LCR)
• E’ un’altra tecnica per l’amplificazione di
una sequenza bersaglio
• Rispetto alla PCR viene utilizzata una ligasi
termostabile per unire oligonucleotidi
adiacenti
• E’ anch’essa ciclica: denaturazione,
appaiamento, ligazione
• La LCR utilizza 4 oligonucleotidi
• In 20-30 cicli si ha un’amplificazione pari a
106 volte il DNA bersaglio
Ligase Chain Reaction (LCR)
1° passaggio: denaturazione
mediante calore
Sequenze bersaglio
2
4
1
3
4 sonde
CALORE
Sequenze bersaglio
1
2
3
4
Sequenze bersaglio
Ligase Chain Reaction (LCR)
2° passaggio: rinaturazione
mediante raffreddamento
Raffreddamento
1
2
3
4
3° passaggio: riempimento dello
spazio vuoto
1
2
3
4
Polimerasi+ dNTPS
Ligase Chain Reaction (LCR)
4° passaggio: legame
Ligasi
1
2
3
4
Sistemi di amplificazione basati
sulla trascrizione
• TAS (transcription based amplification
system)
– Consiste nella ripetizione di un ciclo composto
da due fasi: il DNA denaturato (o RNA) diventa
bersaglio di un oligonucleotide che contiene il
sito di legame per una trascrittasi inversa.
Viene prodotto DNA complementare e dopo
denaturazione l’operazione si ripete. Nella
seconda fase una RNA polimerasi produce molte
copie di RNA ognuna delle quali compie un nuovo
ciclo
– Con questo metodo in 4 cicli si ottengono 106
copie di DNA
– Uno sviluppo commerciale è rappresentato dalla
Nucleic Acid Sequence Based Amplification
(NASBA)
Transcription based amplification
system
• Isotermica (41.5°C)
• Autocatalitica
• Utilizza due enzimi: transcrittasi inversa e T7
RNA polimerasi
• 2 Primers, uno contenente il sito di legame per
la RNA polimerasi (primer 1)
• dNTPs
Principio della TSA
1.
Il primer 1 (che porta la sequenza
promoter per RNA polimerasi) si lega al
target e la RT da origine alla prima catena
di cDNA
2.
A questo punto l’attività RNAse H dell’RT
degrada l’RNA permettendo al primer 2 di
legarsi al cDNA
3.
Si genera uno stampo a DNA a doppia elica
comprendente la sequenza promoter per
RNA pol.
4.
RNA pol inizia la trascrizione dallo stampo
portando alla formazione di 100-1000 cp di
RNA
5.
Primer 2 si lega all’amplicone di RNA
creando nuovo cDNA che farà da stampo
per la formazione di un eteroduplex
6.
L’attività RNAse H degrada l’RNA……
PCR QUANTITATIVA
La reazione di PCR può anche fornire dei dati
quantitativi,
questa informazione è importante per valutare la carica
microbica di un determinato campione
In questo caso è necessario disporre di un opportuno
standard da utilizzare per la quantificazione del
campione
Sono stati sviluppati diversi approcci per la
quantificazione con sistemi di rilevamento classici su gel,
colorimetrici o fluorescenti
Quantificazione degli acidi
nucleici
• Indicazione di prognosi: HIV, CMV,
EBV, HSV (encefaliti)
• Indicazione sull’andamento della
terapia: HIV, HBV, HCV, HSV
(encefaliti)
• Indicazioni sul rischio di trasmissione:
HCV (materno-fetale), HIV-1, HBV
Metodi di PCR-quantitativa con
competitore
• Il metodo è basato sulla co-amplificazione
di due specie di stampo simili, la sequenza
da quantificare e il competitore introdotto
in quantità nota
• Questo compete con la sequenza bersaglio
per i primers; quindi si amplificherà con la
stessa velocità
• La quantità del prodotto finale è calcolata
in maniera diversa in sistemi diversi, ma il
rapporto fra i prodotti riflette il rapporto
fra le quantità iniziali di bersaglio e
competitore
PCR QUANTITATIVA COMPETITIVA
M
1 2 3 4 5 6 M
E’ richiesto l’uso di un competitore
che è amplificato dalla stessa copia
di primers del target e che dà un
amplificato di dimensioni diverse
Il competitore, di quantità nota, è
aggiunto in quantità scalari mentre
il campione è mantenuto fisso
Con questo metodo è richiesta una quantità sufficiente di
campione per poterlo confrontare con le diluizioni di
competitore
Per una stima più affidabile può essere necessario
ripetere l’analisi utilizzando una finestra di diluizione del
competitore meno ampia
PCR-ELISA QUANTITATIVA
Con questo sistema di analisi è
necessario effettuare delle diluizioni
del campione
poichè i sistemi colorimetrici sono
efficienti in un limitato intervallo di
concentrazioni
PCR QUANTITATIVA REAL-TIME I
Sfortunatamente i sistemi di quantificazione classici
richiedono un certo numero di manipolazioni e
incrementano il rischio di contaminazione dovuto alle
manipolazioni dei prodotti di amplificazione.
Recentemente sono stati proposti dei sistemi di
quantificazione basati sull’uso di molecole fluorescenti.
Questi sistemi permettono di misurare la comparsa dei
prodotti di PCR in real-time evitando di ricorrere alle
manipolazioni post-PCR (riducendo i rischi di
contaminazione ed i tempi di analisi)
PCR QUANTITATIVA REAL-TIME II
Sono stati sviluppati sistemi fluorescenti di rilevamento
dei prodotti di amplificazione di tipo:
Specifico (sonde ad idrolisi, sonde ad ibridazione,
molecular beacons, sunrise primer e scorpion primer)
Aspecifico (molecole fluorescenti leganti il DNA)
In generale i sistemi di tipo specifico sono preferibili
nella diagnostica perché consentono un maggiore livello
di specificità e danno dei risultati più affidabili in
condizioni di basse o alte concentrazioni del DNA
ricercato
VANTAGGI DELLA REAL-TIME PCR
Consente la quantificazione in un ampio intervallo di
concentrazioni (da poche copie a 106-107 )
Permette una stima più corretta rispetto ai sistemi di
quantificazione in end-point
Ridotta variabilità intra-saggio ed inter-saggio
Tutte queste caratteristiche rendono la real-time PCR un
ottimo strumento per la quantificazione dei microrganismi,
che possono presentare un’ampia variabilità nella carica
microbica
Strumentazione per Real Time PCR
Smart Cycler
(Cepheid)
LightCycler
(Roche)
iCycler
(BioRad)
7900HT System
(Applied Biosystems)
Fasi della curva di amplificazione della PCR I
Fasi della curva di amplificazione della PCR II
Metodiche di real time PCR
SYBR Green I
Sonde di ibridazione Sonde ad idrolisi
SYBR Green
SYBR Green: molecola
intercalante fluorescente: si
lega alle molecole di DNA a
doppio filamento
Sistema di rilevazione quantitativa di acidi nucleici meno
specifico e meno sensibile rispetto a quelli basati sull’impiego
di sonde
Sonde ad ibridazione: Sonde FRET
Sono utilizzati due sonde complementari alla stessa catena di un amplificato.
Le 2 sonde sono coniugati con due diversi fluorofori, uno dei quali viene eccitato
da una luce esterna mentre il secondo viene eccitato dalla luce emessa dal primo.
Perchè ciò avvenga i due fluorofori devono essere molto vicini
La quantità di amplificato sarà relazionabile alla quantità di luce emessa dal
secondo fluoroforo
Sonde ad ibridazione: MOLECULAR BEACONS
Sonda ad idrolisi:
Tecnologia Taq-Man
primer senso
sonda
Primer anti senso
Tecnologia Taq-Man
hν
hν
Cos’è il ciclo soglia - Threshold Cycle (CT)?
Il ciclo soglia (CT) è il ciclo della reazione di amplificazione in cui il
segnale di fluorescenza del campione supera il valore soglia
0.9
0.8
0.7
Sample
0.6
∆Rn
Rn
0.5
0.4
Threshold
0.3
0.2
No template
baseline
0.1
0.0
0
5
10
15
20
CT
25
30
35
40
Analisi della cinetica della reazione in Real-Time PCR per una serie di
concentrazioni scalari dello standard (A5:5x106 copie, B5:5x105 copie,
C5:5x104 copie, D5:5x103 copie, E5:5x102 copie, F5:5x101 copie, G5:5
copie). Lo strumento determina il numero iniziale di copie del DNA
bersaglio analizzando ciclo per ciclo la variazione del segnale della
fluorescenza come risultato dell’amplificazione del DNA durante la PCR.
Cycle: numero di cicli; ∆Rn:variazione dell’intensità del reporter il cui
valore è normalizzato con quello del reference.
Tecnologia Taq-Man
OTTIMIZZAZIONE DEL PROTOCOLLO DI ANALISI
PROGETTAZIONE DEL SISTEMA PRIMER-SONDA
COSTRUZIONE E QUANTIFICAZIONE DELLO STANDARD
OTTIMIZZAZIONE DELLA REAZIONE SULLO STANDARD
VALUTAZIONE SUI CAMPIONI
La PCR QUANTITATIVA in Virologia
Il primo candidato per l’applicazione quantitativa della
PCR è stato HIV-1
Accoppiando la reazione di retro-trascrizione
all’amplificazione è possibile ricercare sia l’RNA virale
che il DNA provirale integrato nel genoma cellulare.
Grazie alla PCR quantitativa è possibile effettuare il
monitoraggio dell’infezione per valutare la comparsa di
ceppi resistenti ai farmaci
La PCR QUANTITATIVA in Virologia
•Un’altra importante applicazione riguarda le infezioni da
virus delle epatiti
•Il monitoraggio quantitativo della viremia consente non solo di
confermare un dato di positività sierologica, ma permette di
valutare lo stato e l’attività dell’infezione, seguire e predire
l’evoluzione della malattia e l’efficacia delle terapie
•Inoltre la PCR quantitativa è essenziale nel
monitoraggio degli herpesvirus nei pazienti trapiantati e
nelle encefaliti
Diagnostica molecolare - Sensibilità
Ibridazione
Rivelazione
Sensibilità
(copie target)
Ibridazione diretta fase solida
Ibridazione diretta fase liquida
Previa amplificazione
non radioattivo
106 - 108
radioattivo
105 - 106
non radioattivo
105 - 107
radioattivo
104 - 105
vari sistemi
100 - 102
La sensibilità dei sistemi con amplificazione non è in
genere raggiunta dai sistemi di coltivazione in vitro
Diagnostica molecolare in infettivologia
VANTAGGI ATTESI
Specificità
Sensibilità
•Rapidità
Praticità
Economicità
Vasta applicabilità
Diagnostica molecolare – tempi di esecuzione
Diagnostica molecolare
Isolamento in vitro
Processazione campione
Processazione campione
Acidi nucleici
Sistema di coltivazione
Amplificazione
Crescita
Rivelazione
Identificazione
24-48 ore
2-30 giorni
Diagnostica molecolare in infettivologia
VANTAGGI ATTESI
Specificità
Sensibilità
Rapidità
•Praticità
Economicità
Vasta applicabilità
Aumentata praticità nella diagnostica molecolare
Fase di lavoro
Procedure
originarie
Procedure attuali
Processazione
campione
Estrazione con
solventi organici,
difficoltà con RNA
Estrazione con resine
specifiche o semplice lisi,
sistemi RNA-specifici
Amplificazione
Qualità variabile di
enzimi e strumenti,
parametri non
ottimizzati
Qualità elevata di enzimi
e strumenti, parametri
ottimizzati
Rivelazione
Impiego di sonde
radioattive, formati
non automatizzabili,
contaminazioni
Eliminazione sonde
radioattive, automazione
(micropiastre), controllo
delle contaminazioni
Norme per la conservazione e l’invio del
materiale per diagnostica molecolare
DNA → stabile
RNA → instabile
Ricerca del microrganismo intracellulare in fluidi biologici (es.
sangue)
Refrigerare ma NON congelare (la rottura delle cellule allo
scongelamento diminuisce la concentrazione degli acidi
nucleici nel campione)
Ricerca del microrganismo extracellulare in fluidi biologici
(es. liquor, plasma)
Il congelamento garantisce la conservazione a lungo termine
e non influisce sull’esito del test
Tempi di invio per
materiale non
congelato
DNA
RNA
qualitativo
entro 24-72 ore
quantitativo entro 12-24 ore
qualitativo
entro 6-12 ore
quantitativo entro 4-8 ore
Estrazione acidi nucleici
1. Fenolo/cloroformio
1.
Lisi cellule
Applicabilità
universale, buona
qualità dell’estratto se
rimossi bene i solventi
Tossico, fenolo acido
per RNA.
2. Aggiunta fenolo/cloroformio
3. Recupero fase acquosa
4. Precipitazione acidi nucleici in
alcol
Estrazione acidi nucleici
2. Salting out
1.
Lisi cellule in eccesso di sali
Semplice, economico,
non tossico, buona
qualità dell’estratto
Difficile se presenti
molte proteine
(plasma), soluzioni
RNAsi-free per RNA.
2. Precipitazione proteine-sali
3. Recupero fase acquosa
4. Precipitazione acidi nucleici in alcol
Aqueous layer
(DNA / RNA)
NaCl added
Cell extract
alcohol added
Precipitated
proteins
Precipitated
DNA / RNA
Estrazione acidi nucleici
3. Uso di resine su colonna
1.
Lisi cellule
2. Adsorbimento su resina
3. Lavaggio
4. Eluizione acidi nucleici
Semplice, automatizzabile,
applicazione universale, ottime
resine dedicate per RNA, buona
qualità dell’estratto
Più costoso, minore concentrazione
dell’estratto rispetto ai sistemi
basati su precipitazione
Purificazione Automatica di acidi nucleici
SymBiot® XVI Sample
Workstation
(Applied Biosystems)
MagNA Pure LC
Instrument
(Roche)
BioRobot EZ1
System
(BioRad)
REQUISITI PER LA PREPARAZIONE DELL’ACIDO
NUCLEICO DA AMPLIFICARE
Purezza: assenza di componenti che possono diminuire l’efficienza della PCR
es. componenti porfirinici (derivanti dal gruppo EME dei
globuli rossi), SDS, sali: inibitori della Taq polimerasi
diluizioni degli estratti del campione (saggio deve essere
molto sensibile)
Quantità: l’elevata sensibilità della PCR implica una riduzione della quantità
di campione necessario. Può essere effettuata su campioni prelevati in
modo meno invasivo rispetto ai metodi classici
es. per diagnosi di uretrite infettiva possono essere utilizzati i
sedimenti urinari al posto dei tamponi uretrali;
per diagnosi di infezioni atipiche da micobatteri può essere
utilizzato il sangue periferico al posto del midollo osseo
Nella fase di standardizzazione: coamplificazione del DNA bersaglio con
un gene presente nel DNA cellulare
(es. gene della β -globina) per
dimostrare la “competenza” del
campione
REQUISITI PER LA PREPARAZIONE DELL’ACIDO
NUCLEICO DA AMPLIFICARE
Estrazione di RNA: RNA retrotrascritto in cDNA ad opera di una
trascrittasi inversa (RT): viene definita RT/PCR
Fase di estrazione dell’RNA: eliminazione dell’RNAsi endogena, che può
inattivare la RT
Nella fase di standardizzazione: co-amplificazione del cDNA bersaglio
con il cDNA derivato da un trascritto molto presente nelle cellule (es.
gene della β -actina) per dimostrare la “competenza” del campione e la
sua avvenuta retrotrascrizione
Diagnostica molecolare in infettivologia
VANTAGGI ATTESI
Specificità
Sensibilità
Rapidità
Praticità
•Economicità
Vasta applicabilità
Diagnostica molecolare - costi
Tipologia
Reattivi
Personale
Kit commerciale
ELEVATO
RIDOTTO
Sistema in-house
RIDOTTO
MODESTO
Es. saggio di PCR
qualitativa per HIV
Totale
ELEVATO
CONTENUTO
Kit: 55 euro
In-house: 15 euro
Diagnostica molecolare in infettivologia
VANTAGGI ATTESI
Specificità
Sensibilità
Rapidità
Praticità
Economicità
•Vasta applicabilità
Diagnostica molecolare – applicabilità I
Carenze della diagnostica diretta convenzionale
Agenti di problematico isolamento (es. HIV, HTLV, EBV,
Chlamydia, Mycobacterium, Legionella)
Agenti presenti in quantità non rilevabile con metodiche
convenzionali (screening nel sangue)
Agenti non coltivabili (es. HPV, HCV, HBV, rotavirus,
enterovirus)
Agenti non più biologicamente attivi (es. campione mal
conservato)
Agenti a crescita lenta (micoplasmi, micobatteri)
Agenti difficilmente manipolabili (bioterrorismo)
Tutti i casi in cui sia necessaria una identificazione rapida
Metodi molecolari: virus ricercati
Ricerca virale in PCR
Frazioni ematiche (plasma, linfociti e leucociti)
Tampone: vaginale
HPV, HSV
cutaneo
HSV, VZV
oculare
HSV
Liquor: v. erpetici, enterovirus, TBE virus, CMV, EBV
Liquido amniotico: virus della rosolia, VZV, HCV
Urine: CMV, BK, JC
Feci: enterovirus
Biopsie: CMV, EBV, HCV, HBV, HPV
Aspirato nasale, nasofaringeo, broncoaspirato: RSV,
CMV, Rubella
Diagnostica molecolare – applicabilità II
Carenze della diagnostica sierologica
Infezione materno-fetale o perinatale (es. HIV, CMV)
Profilo sierologico ‘indeterminato’ (es. HIV, HCV)
Infezione recente (‘periodo finestra’) (es. HIV, HCV)
Estensione della diagnostica molecolare
MONITORAGGIO ANDAMENTO INFEZIONE
Quantificazione della carica virale
HIV - prognosi e monitoraggio di terapia (RNA)
HCV - prognosi e monitoraggio di terapia (RNA)
HBV - prognosi e monitoraggio di terapia (DNA)
Analisi della variabilità genetica
HIV - genotipizzazione per stima delle
farmacoresistenze (RNA, DNA)
HCV - genotipizzazione per previsione della risposta al
trattamento (RNA)
HBV - genotipizzazione per stima delle
farmacoresistenze (DNA)
Estensione della diagnostica molecolare
MONITORAGGIO ANDAMENTO INFEZIONE
Altre possibili applicazioni
Quantificazione della carica virale
CMV: prognosi e monitoraggio di terapia
EBV: prognosi e monitoraggio di terapia
Analisi della variabilità genetica
Mycobacterium: genotipizzazione per stima delle
farmacoresistenze
CMV - genotipizzazione per stima delle
farmacoresistenze
Saggi per l’analisi della variabilità
Analisi singole mutazioni
1.
2.
Individuazione di specifiche mutazioni tramite
sonde multiple in saggi di ibridazione differenziale (es.
LIPA, PCR selettiva)
Sequenziamento completo
• Dideoxy sequencing (es. VGI TruGene, PE-ABI
ViroSeq, ‘home brew’)
• Microarray (es. Affymetrix HIV GeneChip®)
• Pyrosequencing (Pyrosequencing AB)
Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Coniugando a ciascun ddNTP
un diverso marcatore fluorescente, è
possibile effettuare le quattro reazioni di
sequenziamento in un unico tubo da saggio
e caricare il tutto in un solo pozzetto di gel
ddA
ddT
ddC
ddG
Dalla cycle sequencing all’elettroforetogramma...
Dalla cycle sequencing all’elettroforetogramma...
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le
informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore
diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.
Monitoraggio farmacoresistenza nell’infezione da HIV
Al fallimento
fallimento virologico
virologico della
della terapia
terapia
Al
Nei pazienti
pazienti ‘naive’,
‘naive’, specialm.
specialm. se
se con
con infezione
infezione
Nei
acuta
acuta
In gravidanza
gravidanza
In
La farmacoresistenza è il maggiore predittore della risposta alla
terapia
Individuate specifiche mutazioni in regioni codificanti
enzimi bersaglio (trascrittasi proteasi)
Computo informatizzato del livello di
resistenza per ogni farmaco in base al
pattern relativo a oltre 100 mutazioni
implicate nei fenomeni di resistenza
Sequenziamento completo
(farmacoresistenze HIV )
Campione
Acidi nucleici
Amplificazione delle regioni
RT e PRO di HIV tramite PCR
ACGT
Reazioni di cycle
sequencing
Elettroforesi su
sequenziatore
Sequenza RT e PRO
Problematiche in diagnostica molecolare
Necessità di saggi multipli in assenza di un preciso
sospetto diagnostico
Es. meningite, febbre emorragica
Effetti del polimorfismo del bersaglio
Falsi negativi in diagnostica qualitativa
Valutazioni errate nel monitoraggio (es. carica virale HIV con
ceppi/sottotipi non comuni)
Significato del reperto qualitativo nelle infezioni ‘latenti’
Es. CMV, EBV, HHV-6
Validità dei sistemi e training del personale impiegato
Riproducibilità? Controllo di qualità? Certificazione?
CONCLUSIONI
La diagnostica molecolare ha profondamente
cambiato il ruolo del laboratorio di microbiologia
clinica
Sono disponibili test sensibili, specifici e rapidi di
grande utilità clinica
E’ necessaria un’interazione stretta e continuativa
fra clinica e laboratorio per disporre di strumenti
sempre più importanti per la gestione clinica del
paziente
I sistemi di diagnostica molecolare devono essere
accuratamente controllati su sistemi modello prima
di essere impiegati su campo
Diagnostica molecolare
PCR - applicazione per settore in microbiologia
Parassitologia
Micologia
Virologia
Batteriologia
4%
17%
7%
72%
Fonte: ‘MEDLINE search’ 1995-2001
Esami di laboratorio per la diagnosi di infezione da HIV
Ricerca anticorpi mediante saggi immunoenzimatici (con eventuale
conferma mediante western blotting) nei confronti di antigeni ricombinanti
e/o peptidi sintetici che riproducono gli epitopi antigenici più significativi
delle principali proteine strutturali di HIV-1 e HIV-2 e dei diversi sottotipi di
HIV-1
Limiti:
Nella fase iniziale (3-4 settimane) dell’infezione
Nei neonati
In modesta % di soggetti infetti che sono borderline
Ricerca di HIV
Isolamento culturale (indaginoso)
Rilevazione antigeni specifici (p24)
Rilevazione di specifiche sequenze nucleotidiche (DNA provirale,
RNA virionico)
Follow-up del paziente HIV +
Per monitorare l’efficacia della terapia antiretrovirale o per
derivare indicazioni prognostiche adeguate
Determinazione viral load
DNA-PCR
Determinazione virus infettante in circolo (infectious culture dose)
p24 plasma antigenemia
HIV-1 RNA plasmatico (RT-PCR, NASBA, bDNA, real time PCR)
Significato prognostico della ‘viremia’ nell’infezione da HIV
HIV RNA (copie/ml)
Caduta CD4/m m c per anno
% AIDS entro 6 anni
% m orte entro 6 anni
>30.000
10.001-30.000
3.001-10.000
501-3.000
<500
0
20
40
60
80
100
Mellors, 1997
HCV – monitoraggio molecolare
HCV RNA
Indicazione per l’intervento terapeutico
Livello al baseline e a 3-6 mesi dal trattamento è predittore della
risposta alla terapia (IFN-α, IFN-α+ribavirina)
Condizionamento dello schema terapeutico (es. 6 mesi con HCV
RNA <2x106 copie/ml; 12 mesi con HCV RNA >2x106 copie/ml)
Genotipo
Predittore della risposta al trattamento (es. 10-40% di responder con
genotipo 1b vs. 60-90% di responder con genotipo 2a e 2b)
Condizionamento dello schema terapeutico (es. 6 mesi con genotipo
2 o 3; 12 mesi con genotipo 1 o 4)
Condizionamento della patogenicità (es. maggiore rischio di
progressione verso cirrosi e carcinoma epatocellulare con genotipo
1b; scarso rischio con genotipo 3 e 4)
HBV – monitoraggio molecolare
HBV DNA
Indicazione per l’intervento terapeutico
Livello al baseline è predittore della risposta alla terapia (IFNα, lamivudina, adefovir)
Parametro per la valutazione della risposta al trattamento
Genotipo
L’analisi della regione codificante la trascrittasi consente di
individuare mutazioni di resistenza alla lamivudina (M552I/V)
Aumentata praticità nella diagnostica molecolare
