Presentazione standard di PowerPoint - Progetto e

WESTERN BLOOT
Dott.ssa Angelucci C.B.
Cosa e’ un Western Blot?
Una tecnica in cui le proteine sono, inizialmente, separate mediante
elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto
(membrana o filtro). Con questa tecnica una proteina viene
identificata mediante una reazione specifica con un anticorpo.
Dott.ssa Angelucci C.B.
Tecnica Immunochimica
Mediante anticorpi (immunoglobuline) è possibile
rilevare la quantità di antigene (proteine, polisaccaridi e
acidi nucleici) sfruttando il riconoscimento specifico di
un determinante antigenico (epitopo).
Dott.ssa Angelucci C.B.
Citofluorimetria
Western, Southern e
Northern Blot
Alpha Screen
FIA
Anticorpo
RIA
Immuno-microscopia
ELISA
Dott.ssa Angelucci C.B.
Gli anticorpi sono proteine prodotte dalle cellule B del
sistema immunitario.
Esistono cinque classi di anticorpi che
appartengono alla categoria delle
molecole
proteiche
dette
Immunoglobuline: A, E, G, M, D.
La loro produzione, da parte delle
cellule plasmatiche, è provocata
dall’introduzione nell’organismo di
una sostanza estranea, l’antigene (Ag),
avente determinate caratteristiche
fisico-chimiche.
L’antigene
è
riconosciuto per queste particolarità
dai
siti
di
combinazione
dell’anticorpo.
Consistono di due frammenti: il frammento Fc e il frammento Fab.
IgG
Fab= Frammento legante l’Ag
Fc= Frammento cristallizzabile
Il frammento Fc, in un dato animale, è sempre lo stesso in tutti gli anticorpi.
Il frammento Fab, invece, è variabile, riconosce e si lega ad un epitopo dell’antigene
Dott.ssa Angelucci C.B.
Forze non covalente
Forze non elettrostatiche
Legami ad idrogeno
Forze di Van der Waals
Forze idrofobiche
origine
Attrazione tra cariche opposte
Idrogeno condiviso tra atomi elettronegativi (N,O)
Oscillazioni delle nuvole elettroniche attorno alle
molecole polarizzano in modo opposto gli atomi
adiacenti
I gruppi idrofobici interagiscono sfavorevolmente con
l’acqua e tendono ad associarsi per escludere le
molecole d’acqua. L’attrazione avviene anche per le
forze di Van der Waals
Dott.ssa Angelucci C.B.
La tecnica immunochimica si basa sull’interazione
antigene-anticorpo
Primo anticorpo detto anche primario: si distingue in
policlonale e monoclonale
Secondo
anticorpo
detto
anche
generalmente marcato con un tracciante
secondario:
Anticorpi primari:
si distinguono in policlonali e monoclonali.
Anticorpi policlonali: quando un antigene viene iniettato in un animale (topo,
coniglio, capra) viene prodotta una miscela di anticorpi. Migliaia di parti diverse
(epitopi) dell’antigene sono coinvolte nell’attivazione di migliaia di cloni di cellule
B, ciascuno producente un anticorpo diverso. Questi anticorpi sono chiamati
policlonali perché hanno specificità diverse verso epitopi diversi.
Anticorpi monoclonali: gli anticorpi monoclonali sono anticorpi identici diretti
contro un epitopo specifico di una proteina. Sono prodotti da un clone derivato da
una singola cellula.
Anticorpo primario
antigene
Anticorpi secondari
Sono anticorpi marcati, diretti contro il frammento Fc, che consentono di rilevare
l’avvenuto legame all’antigene e quindi la presenza dell’anticorpo primario.
Vantaggi uso anticorpi secondari:
1. Amplificazione del segnale, aumento sensibilità del saggio.
2. Il secondario può essere usato contro tutti gli anticorpi primari prodotti nello stesso
organismo (es. contro tutti i primari prodotti in coniglio)
Amplificazione del segnale
Anticorpo secondario
Anticorpo primario
Anticorpi primario
POLICLONALI
2
1
Epitopi sull’antigene
3
Topo inoculato con
l’Ag opportuno
4
1
2
Siero contenente
l’Ab policlonale
Dott.ssa Angelucci C.B.
Produzione di anticorpi policlonali
L’anticorpo può essere prodotto contro cellule batteriche vive o
morte (uccise al calore per 30 minuti in modo da esporre le molecole
che costituiscono la parete), contro specifici prodotti batterici come
tossine o enzimi e contro frazioni cellulari specifiche (ribosomi,
oligosaccaridi, lipoproteine, glicoproteine) [Hampton et al., 1990].
Ciò può essere ottenuto in diversi modi:
- con iniezioni endovenose multiple con dosi crescenti di antigene
(con tempi brevi tra un’iniezione ed un’altra per evitare la
distruzione dell’antigene da parte del sistema immunitario).
- con iniezioni sottocutanee o intramuscolari: tale metodica
garantisce un lento rilascio dell’antigene nel sangue assicurando, con
un minor numero di iniezioni di richiamo, una presenza continua per
diverse settimane [Hampton et al., 1990].
Generalmente le procedure di immunizzazione più rapide portano ad
un minor titolo ma ad una maggior specificità dell’antisiero.
Le principali globuline ottenibili con i normali metodi sono IgM ed
IgG. La determinazione del titolo di un anticorpo è data dalla
massima diluizione del siero alla quale è ancora osservabile una
reazione anticorpo-antigene (Ab-Ag).
PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI
Immunizzazione di
animali
Raccolta del plasma
contenente gli
anticorpi
Aggiunta di stabilizzanti,
conservanti
Purificazione iniziale
(precipitazione)
Purificazione con cromatografia
(scambio ionico)
Filtrazione sterile
Prodotto liquido
Liofilizzazione
Prodotto in polvere
Anticorpi primario
MONOCLONALI
1
1
Epitopi sull’antigene
Singoli antigeni
milza
Linfociti
produttori
di anticorpi
Cellule di mieloma
1
Ibridomi selezionati e clonati
In vivo
In vitro
propagazione
Anticorpo monoclonale specifico
Dott.ssa Angelucci C.B.
Produzione di anticorpi monoclonali
Per anticorpi monoclonali si intende una popolazione omogenea di anticorpi
prodotti da un clone cellulare (ibridoma) ottenuto per fusione di cellule
immunoproduttrici con cellule di mieloma maligno, dotate di specificità verso un
solo epitopo dell’antigene immunizzante [Pelckzar et al., 1982; Eisen, 1993]. La
fusione tra i linfociti B (provenienti dalla milza e dai linfonodi di un animale
immunizzato) e il mieloma di topo, viene ottenuta per intervento di un promotore
di fusione di membrana, come il polietilenglicole. Le cellule ibride, o ibridomi,
vengono coltivate in vitro dove continueranno a produrre anticorpi monospecifici e
a moltiplicarsi. Il terreno su cui sono allevati gli ibridi è di tipo selettivo conosciuto
con il nome di HAT, che proprio per la sua composizione, inibisce la crescita sia
dei mielomi che delle cellule della milza non fuse, ma non dell’ibridoma che
completa le due linee parenterali.
Applicazione degli anticorpi monoclonali
Tipizzazione tissutale
Analisi sierologiche
Manipolazione
risposte immunitarie
Reagenti precisi
per ricerca
Trattamento malattie
autoimmuni
Applicazione
degli anticorpi monoclonali
Identificazione dei prodotti
dei geni oncogeni
Potenziamento del
rigetto tumorale
Diagnosi ed epidemiologia
agenti infettivi
Purificazione di sostanze
presenti in microquantità
(cromatografia per affinità)
Diagnostica di tumori e
metastasi in vivo
A cosa serve il Western Blot?
Qual è la proteina che mi interessa?
-
?
SDS-PAGE e Western blot
+
+
Quanta proteina di interesse c’è?
100
mg
y = -0,9386 + 1,5912x R= 0,99717
Densità ottica %
5
10
15
20
30
40
50
90
mg di proteina
8
15
20
30
50
60
80
100
Densità ottica
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
mg di proteina
Dott.ssa Angelucci C.B.
Principio del Western blotting
- SDS-PAGE
-Trasferimento blotting delle proteine dal gel ad una
membrana (nitrocellulosa o Polivinilidene Fluoruro,
PVDF) (allestire il sandwich)
-saturazione (blocking) della membrana (latte, BSA,
gelatina)
-Incubazione con il I° anticorpo
-Incubazione con il II° anticorpo, coniugato con un
tracciante
- rilevazione
Dott.ssa Angelucci C.B.
Tipologie di Blotting
• Wet Transblot system
• Semidry system
Dott.ssa Angelucci C.B.
Come preparare il sandwich
Dott.ssa Angelucci C.B.
Trasferimento su carta di nitrocellulosa
Casting
nero
Casting
bianco
Partendo dal
casting nero:
•1 spugna
• 2 fogli di carta
• Gel
• Membrana
• 2 fogli di carta
• 1 spugna
Nell’assemblaggio si colloca nero nella direzione del nero, bianco nella direzione
del rosso. Le proteine, cariche negativamente, corrono verso il polo positivo
Tampone di trasferimento (1L): 3.03 g Tris, 14.44 g glicina, 800 ml H2O, 200 ml MeOH.
Dott.ssa Angelucci C.B.
Apparato WET TransBlot
Gel
Membrana
Carta assorbente
Spugna
- Catodo
+ Anodo
Tampone di trasferimento
Dott.ssa Angelucci C.B.
Dott.ssa Angelucci C.B.
Dott.ssa Angelucci C.B.
Dott.ssa Angelucci C.B.
Semidry system
Carta assorbente
- Catodo
Spugna
Gel
Corrente
Proteine
Membrana
+ Anodo
Dott.ssa Angelucci C.B.
Dott.ssa Angelucci C.B.
Dott.ssa Angelucci C.B.
Dott.ssa Angelucci C.B.
Confronto tra i due sistemi
Spugna-cassetta
Carta da filtro
Gel
Membrana
+
Tampone
Apparato Semidry
WET Trans Blot
Vantaggi: veloce, economico (meno buffer)
Svantaggi: efficienza di trasferimento limitata (dimensione
gel, % acrilammide, peso molecolare)
Dott.ssa Angelucci C.B.
Western blotting
1. Preparazione del sandwich (scelta supporto: PVDF, nitrocellulosa)
2. Blotting (wet o semidry; 1h a 100 V oppure o/n a 30 V)
3. Immunodetection (blocking, incubazione con Ab specifico e con Ab
secondario per la detection)
Dott.ssa Angelucci C.B.
Dopo trasferimento:
Precision Plus
Protein™
Kaleidoscope™
Standards,
Bio Rad
Dott.ssa Angelucci C.B.
Rosso Ponceau
La colorazione tramite rosso di ponceau è utilizzata per rilevare e
colorare le proteine su acetato di cellulosa, PVDF e membrane di
nitrocellulosa. La procedura è reversibile e non invasiva e permette
ulteriori test di carattere immunologico sul campione. Il limite
minimo per l’identificazione è di 250 ng di proteina in gel
di poliacrilamide. Il colorante è fortemente elettronegativo e si lega
ai gruppi amminici della proteina, oltre che alle regioni non
covalenti e non polarizzate.
Preparazione:
10 ml H2O distillata
0.3 ml acido acetico glaciale
0.033 g Ponceau S
Fino a 30 ml con H2O distillata
Dott.ssa Angelucci C.B.
Versare circa 5-10 mL di soluzione di Rosso Ponceau nella
vaschetta messa su un agitatore oscillante per 5 min, recuperare il
colorante e decolorare con acqua distillata fino a quando non siano
visibili le bande.
Rosso Ponceau: a cosa serve?
Questo
passaggio
serve
per
valutare
l'efficienza del trasferimento, la presenza di
bolle, evidenziare l'area di lavoro le linee di
corsa. Queste informazioni sono utili per
tagliare la membrana e ridefinire l'area
utile, separare le varie linee o verticalmente
o orizzontalmente, destinando a trattamenti
diversi i vari pezzi.
http://www.bioinformatics.nl/
Detecting the protein specific antibodies:
-Blocking the membrane with 5-10% nonfat dried milk in PBS for 1 hour or
overnight at 4°C with shaking.
-Wash in PBS with 0.1% Tween-20, 3 X, and 10 min for each time.
-Incubate with Primary Antibody in 1% BSA in PBS for 1 hour at room temperature
or overnight at 4C by shaking.
-Wash in PBS with 0.1% Tween-20, 3 X, and 10 min of each time
-Incubate with secondary antibody (peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG,
etc.) following the manufacturer’s instruction, usually 1:200 to 1:2000; 1 hour at
room temperature
- Wash in PBS with 0.1% Tween-20, 3 X, and 10 min of each time
Il marcatore deve essere una molecola caratterizzata
da un elevato rapporto segnale/massa.
Questo permette di ottenere un segnale altamente
rivelabile anche in presenza di piccole quantità di
tracciante, abbassando il limite di rivelazione del
metodo
. Isotopi radioattivi (125I, 3H)
. Molecole fluorescenti
. Molecole chemiluminescenti
. Enzimi determinabili con substrati:
- cromogeni
- fluorescenti
- chemiluminescenti
Scelta del marcatore
Tracciante limite di rivelazione
TRACCIANTE
SEGNALE
125I
10.000 dpm
Enzima
Assorbanza
Luminescenza
Fluorescenza
Amplificazione ciclica del segnale
Molecola Fluorescente
Fluorescenza
Molecola Chemiluminescente
mV
Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come
marcatore per la sintesi di un tracciante?
L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale
analitico. Un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto.
•
S
La molecola di substrato utilizzata come
marcatore produce una sola molecola di
prodotto per ogni molecola di
tracciante
•
E
L’enzima utilizzato come marcatore
produce molte molecole di prodotto per
ogni molecola di tracciante
Traccianti enzimatici
Enzima
Perossidasi
Fosfatasi alcalina
Sistema di rivelazione
Metodologia analitica
H2O2/cromogeno
Spettrofotometria
H2O2/luminolo
Chemiluminescenza
4-nitrofenilfosfato
Spettrofotometria
4-metilumbelliferone-fosfato Fluorimetria
b-galattosidasi
AMPPD*
Chemiluminescenza
2-nitrofenolo
Spettrofotometria
4-metilumbelliferone
Fluorimetria
2-naphthyl-b-Dgalactopyranoside
Chemiluminescenza
* 3-(2′-spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3″-phosphoryloxy)-phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD or m-AMPPD) (Ling Yue and Ya-Jun Liu . J.Chem. Theory Comput., 2013, 9 (5), pp 2300–2312)
Traccianti enzimatici: un po’ di storia
• 1941 Coons:
– Anticorpi marcati con fluoresceina per localizzare antigeni in sezioni di
tessuto
• 1966 Nakane:
– Anticorpi marcati con enzimi
• 1970 Sternberger:
– Perossidasi erossidasi-Anti Perossidasi erossidasi (PAP)
• 1981 Hsu:
– Avidin Biotin Complex (ABC)
• 1984 Cordell::
– Alkaline Phosphatase Anti Alkaline Phosphatase (APAAP)
Colorazione Indiretta
Colorazione Diretta
II° anticorpo marcato
con il tracciante
I° anticorpo
antigene
• elevata sensibilità
• versatilità
• costo maggiore
• tempi più lunghi
I° anticorpo marcato
con il tracciante
antigene
• costo minore
• rapidità
• scarsa sensibilità
Dott.ssa Angelucci C.B.
1) Saturazione dei siti aspecifici con il latte non grasso
2) I° anticorpo specifico per l’albumina
3) II° anticropo coniugato con la perossidasi di rafano
4) Sviluppo del colore per aggiunta del substrato con formazione di
prodotto
Dott.ssa Angelucci C.B.
Chemiluminescenza ECL
Dott.ssa Angelucci C.B.
La Chemiluminescenza (ECL)
La chemiluminescenza è la luminescenza emessa nel corso di una reazione chimica,
generalmente un’ossidazione.
Nel caso del Luminolo la reazione di ossidazione può avvenire in presenza di
H2O2 e O2 atmosferico
hn
Dott.ssa Angelucci C.B.
Procedura di Staining con
Anticorpi
Colorazione Diretta
luminolo + H2O2
HRP
Colorazione Indiretta
luminolo + H2O2
HRP
luminolo ox
hn
luminolo ox
hn
Dott.ssa Angelucci C.B.
Biotina-streptavidina
Una procedura che sfrutta il vantaggio dell’interazione specifica ad alta affinità tra la
biotina e la streptavidina.
Prevede l’uso di un Ab biotinilato e preparazioni marcate con streptavidina
Il sistema Streptavidina-Biotina si basa sulla affinità fra la streptavidina, una
glicoproteina con PM di circa 68.000 D presente nell’albume (avidina) oppure prodotta
dallo streptomyces avidinii e la biotina, piccola molecola vitaminica. In particolare la
biotina si lega ai gruppi aminici -NH2 degli Anticorpi di modo che più molecole di
biotina corrispondono a ciascuna molecola di Ig
Streptavidin
Il complesso avidina-biotina è costituito
da una molecola di avidina che è legata a
tre molecole di biotina che a loro volta
sono legate alla perossidasi (perossidasi
di rafano).
Ogni molecola di avidina ha quattro siti
di legame per molecole di biotina. Nel
complesso avidina-biotina tre dei siti
sono occupati da altrettante molecole di
biotina, ciascuna legata ad una molecola
di perossidasi, che è l’enzima marker; il
quarto sito è disponibile per formare un
legame con una molecola di biotina
legata all’anticorpo secondario (anticorpo
secondario biotinilato). Il complesso
ABC è quindi un efficace dispositivo di
rivelazione dell’anticorpo secondario e
consente un’amplificazione del segnale:
Schematic representation of the Avidin-Biotin Complex (ABC) staining method.
tre molecole di marker per ogni molecola
di anticorpo secondario e più molecole di
secondario si possono legare ad una di
anticorpo primario.
In più ogni molecola dell’enzima marker lega più di una molecola di biotina, per cui può fare da ponte tra
il complesso che si è legato direttamente all’anticorpo secondario biotinilato ed altri complessi liberi,
amplificando ulteriormente il segnale. Lo “sviluppo” della reazione si ha aggiungendo un substrato per
l’enzima perossidasi.
Vantaggi:
• Alta affinità della streptavidina per la biotina,
• E’ possibile ottenere un elevato rapporto fluorocromo/enzima-
proteina,
• Elevata amplificazione del segnale,
• La streptavidina coniugata è molto stabile,
• Un singolo coniugato marcato può essere utilizzato in molteplici
metodiche,
• Basso costo
Western Blot (esempio)
Lipossigenasi di
Frumento
Omogenato di frumento
150
100
75
Dopo western blotting
Lipossigenasi di frumento
50
37
25
15
Lipossigenasi
di soia
Dopo western blot
Omogenato di soia
Lipossigenasi di soia
Lectina
Elettroforesi e western blotting gentilmente forniti dalla Dott.ssa M.Simonetti
Dott.ssa Angelucci C.B.
Southern Blot Analysis
.
Questa tecnica prende il nome di Southern blotting in quanto ideata
da Edwin Southern.
• Procedura:
– Isolare DNA genomico
– Digerirlo con enzima di restrizione specifico
– Elettroforesi dei frammenti di DNA su gel d’agarosio
– Denaturare il DNA per separare i filamenti complementari
– Trasferire il DNA su membrana
– Ibridazione con una sonda marcata
– Visualizzazione del segnale (autoradiografia o colorimetria)
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Capillary Transfer
1. A weigt of about 0.5 kg
2. A plate, made of glass, PVC or similar.
3. A stack of dry paper towels
4. A sheet
of
pre-wetted
nylon
blotting
membrane with a double layer of pre-wetted gel
blotting paper put on top
5. The gel
6. The wick: a double layer of pre-wetted gel
blotting paper
7. A plate similar to 2
8. Two open containers filled with 0.4M NaOH
9. An supporting empty container, upside down.
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Ibridazione
la capacità di una molecola di acido nucleico a singolo filamento di formare una
doppia elica con un'altra sequenza composta di basi a essa complementari
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Le sonde utilizzate possono essere:
Oligonucleotidi a DNA marcati terminalmente con radioattivo, DNA a doppio filamento marcati
in continuo con radioattivo, Oligonucleotidi a RNA marcati terminalmente con radioattivo
Dopo aver allestito il nostro Southern blot
http://www.bioinformatics.nl/
Un frammento di restrizione contenente una specifica sequenza di basi può essere
identificato ibridandolo con un filamento marcato di DNA complementare.
Una miscela di frammenti di restrizione viene separata tramite elettroforesi su gel di
agarosio, quindi si denatura il DNA portandolo nella forma a singola catena e lo si
trasferisce su un foglio di nitrocellulosa (“blotting”) come descritto nella figura
seguente:
Frammenti di DNA
Sonda di DNA
rilevata
Elettroforesi
Trasferimento
del DNA
mediante
blotting
Aggiunta di
una sonda di
DNA marcata (ibridazione)
Autoradiografia
Gel di agarosio
Membrana di
nitrocellulosa
Autoradiogramma
Dopo trasferimento del
DNA
mediante blotting i vari frammenti di DNA
mantengono sulla nitrocellulosa le stesse posizioni che
avevano nel gel. Le
posizioni possono essere determinate esponendo il foglio a un filamento di DNA a
singola elica di sequenza nota (detta “probe” o sonda) marcato (fluorescenti o
radioattivi).
La sonda si lega con un filamento complementare e l’autoradiografia rivela quindi
la posizione dell’insieme ibridato (cioè del complesso frammento di restrizionesonda).
In questo modo si può identificare un frammento particolare in mezzo a milioni di
altri frammenti.
Autoradiography is the use of X-ray (or occasionally photographic) film to detect
radioactive materials. It produces a permanent record of the positions and relative
intensities of radiolabeled bands in a gel or blot. Typically, biomolecules are labeled
with32P or 35S, and detected by overnight film exposure.
Radioactive Exposure of Film:
Beta particles emitted by radionuclides penetrate film emulsions to a depth proportional to
their energy. As these particles pass through the film, they activate the silver halide crystals
in the emulsion. Activated crystals are detected by reduction to black silver grains in the
development step. The activated silver halide crystals are not stable, although they can be
stabilized by further exposure to b-particles, or to light. On average, a crystal will require 5
"hits" from either radioactive emissions or light to be stably activated, and thus detected. In
order to compensate for this instability, autoradiography is often carried out at -70°C,
which stabilizes the activated crystals, enhancing sensitivity. Additional sensitivity is
gained by "preflashing" the film before use. The film is exposed to a microsecond burst of
light which is calibrated to bring the crystals in the film to a partially stabilized, activated
state. Preflashed film requires only one "hit" per grain deposited. This not only increases
sensitivity but also ensures that the film signal will be linear with the amount of
radioactivity, even at very low signal levels.
Fluorography
Sensitivity of autoradiography can be greatly
enhanced through the use of fluorography, which
converts radioactive emissions into light. Light
penetrates film more efficiently than beta particles
and is therefore more readily detected. Various
phosphor compounds are available which can be
dried into a gel, and which absorb the energy from
beta particles and re-emit it as light.
Typical autoradiographic technique involves enclosing the
gel or blot with X-ray film for at least 24 hours within an Xray cassette. Development of the film reveals the gel or blot
image. Note the use of radioactive or phosphorescent dots to
record the orientation of the film.
Autoradiography: The Procedure
1 Prepare gel or blot.
2 Wrap wet samples in plastic wrap.
3 Tape the sample to the inside face of an X-ray cassette, with enhancement screens for 32P if desired. It is
essential to fasten the sample so that it does not move, because it must later be aligned with the exposed
film.
4 Along one side, fasten a phosphorescent ruler or other orientation aid (radioactive dots). If a marker other
than a ruler is used, be sure to include enough markers to unambiguously align the developed film to the
sample.
5 In the dark or under safelight place one piece of X-ray film over the sample. For
temperature exposure is sufficient. For
32P,
35S
or
14C,
room
intensifying screens require a temperature of -70° C for
exposure.
6 Expose film. Use the tables above as a guide for length of exposure. A good rule of thumb is that bands
must be detectable on a Geiger counter for overnight exposure to be sufficient.
7 To avoid condensation on the film allow the cassette to return to room temperature before opening.
Develop the film according to manufacturer's instructions.
Utilizzata per:
Determinare la presenza o assenza di specifici frammenti genici,
E per lo studio della struttura e dell’organizzazione di un gene
Applicazioni:
Analisi forense
Diagnosi di malattie ereditarie (es. fibrosi cistica, distrofia muscolare, ecc.)
Individuazione di agenti patogeni nelle infezioni
Analisi filogenetiche
Mappatura del genoma
Controllo degli OGM
Vantaggio:
Elevata specificità
Svantaggio:
Metodologia che richiede tempo.
Richiede discrete quantità di DNA
Northern Blot Analysis
La stessa procedura di analisi può essere seguita per individuare
specifiche sequenze di RNA. La tecnica di analisi dell’RNA è stata
chiamata Northern blotting.
Applicazioni:
studi sull’espressione genica
Per determinare la dimensione e la quantità di specifici RNA
• Procedura:
– Isolare l’RNA
– Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o PAGE)
– Trasferire l’RNA su membrana
– Ibridazione con una sonda marcata
– Visualizzazione del segnale (autoradiografia o colorimetria)
Ibridazione
DNA doppio filamento
fusione
DNA singolo filamento
DNA si lega al filtro
Membrana o filtro
Incubare con la sonda marcata
Lavare il DNA marcato non ibridizzato
Autoradiografia
Tutorials:
Western Blot
https://youtu.be/VgAuZ6dBOfs
Southern blot
https://youtu.be/s2WssRwnx5M
Northern blot
https://youtu.be/I3og-WJMAi0
Buon Studio
http://www.bioinformatics.nl/