applicazioni delle tecniche di manipolazione del dna

Polymerase chain reaction
(PCR)
Lezioni d'Autore
di Paola Vinesi
PCR (I)
VIDEO
PCR (II)


Il metodo della reazione a catena
della polimerasi è stato ideato nel
1983 da Kary B. Mullis, che nel
1993 ha ricevuto il premio Nobel per
la chimica proprio per questa
invenzione.
Si tratta di una tecnica che ai pregi
della semplicità nell'applicazione,
dell'economicità nei costi e della
rapidità nel fornire risultati, abbina
anche quelli di poter lavorare su
quantità minime di campione (in linea
teorica anche una singola molecola) e
di avere una grande versatilità
nell'utilizzo.
PCR (III)



Questa tecnica biomolecolare permette di amplificare un
preciso frammento di DNA di cui si conoscono le sequenze
di inizio e di fine, oppure un filamento di RNA, partendo
anche da quantità ridottissime.
In questo modo è possibile ottenere in vitro in tempi
rapidi e in grande abbondanza il materiale genetico
necessario per ulteriori applicazioni.
Prima dell'introduzione della PCR non era possibile
selezionare oligonucleotidi direttamente dal DNA e per
ottenere una specifica sequenza era necessaria una
metodica lunga e dai risultati non sempre sicuri.
PCR (IV)


La PCR sfrutta le capacità dell'enzima DNA polimerasi,
presente in natura e la cui funzione è di permettere la
sintesi di un nuovo frammento di DNA.
Dopo che la doppia elica si è divisa in due, esponendo i
due filamenti di nucleotidi che la compongono (in questo
stato il DNA si dice denaturato), l'enzima si lega
all'estremità di un filamento e comincia ad associare in
modo complementare nuovi nucleotidi a quelli del
filamento già presente, che fa quindi da stampo. Viene
così ricostituita la sequenza di DNA.
PCR (V)



Il materiale da sottoporre a PCR consiste in una soluzione
tamponata contenente il frammento di DNA di interesse e
tutti i reagenti necessari alla sua amplificazione (ossia
DNA polimerasi, primers e una miscela di nucleotidi).
In un ciclo di PCR, la fase iniziale è rappresentata dalla
denaturazione del DNA d'interesse. Questa è effettuata a
temperature molto elevate (intorno ai 100 °C). Poiché la
DNA polimerasi umana è sensibile al calore, che la
inattiva, si usa una polimerasi ottenuta da batteri
termofili, naturalmente predisposti a sopportare
temperature molto alte.
Dopo la denaturazione si ha un raffreddamento che
permette ai primers di attaccarsi allo stampo di DNA.
PCR (VI)


I primers funzionano da innesco per la sintesi del nuovo
filamento di DNA e sono costituiti da sequenze
oligonucleotidiche complementari a quelle poste ai lati
della regione da replicare. Questa è la cosiddetta fase di
annealing (appaiamento) e vede entrare in gioco la DNA
polimerasi termostabile, poiché si ha un innalzamento
della temperatura (circa 72 °C).
Per la sintesi del nuovo filamento (fase di prolungamento)
si utilizzano i nucleotidi presenti in soluzione nel campione
su cui si sta lavorando. Il filamento si forma partendo da
un innesco e raggiungendo l'altro, e funziona come
stampo per le successive repliche di DNA, poiché la PCR
prevede più cicli e questo garantisce un raddoppiamento
del DNA a ogni ciclo. Inoltre, la velocità della reazione è
tale che in poche ore vengono sintetizzati cento miliardi di
molecole.
PCR (VII)

Nella figura lo schema dell'amplificazione di una
regione di DNA tramite PCR
PCR (VIII)

L'intera sequenza di
reazioni della PCR è
condotta in un
apparecchio specifico
chiamato
termociclatore, in
grado di eseguire
automaticamente i
cambiamenti ciclici di
temperatura necessari
ad amplificare per via
enzimatica le sequenze
di DNA.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
TERAPIA GENICA (I)



Le malattie genetiche sono dovute alla mutazione di
un gene che determina la produzione in quantità
insufficienti di una proteina vitale per l'organismo
oppure la produzione di una proteina nociva.
Il fondamento della terapia genica è che, inserendo
nel genoma di una cellula una copia normale del gene
mutato, si può ripristinare l'abituale funzionalità
genica.
D'altra parte, oltre ai geni codificanti è possibile
trasferire frammenti di DNA e di RNA dotati di attività
enzimatiche e di regolazione, e in questo modo si può
intervenire anche nelle patologie non genetiche, dove
può essere ripristinata una funzione perduta o
alterata.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
TERAPIA GENICA (II)
Questo ha ampliato il campo d'applicazione della
terapia genica, estendendolo per esempio
all'oncologia, alle patologie cardiovascolari, alle
malattie da virus, come l'AIDS.
 Nelle figure della slide successiva sono riportati
esempi, rispettivamente:
A) di come la terapia genica può essere applicata alla
cura di patologie del sangue;
B) oppure alla stimolazione immunologica.

APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
TERAPIA GENICA (III)

Esempio di terapia genica
somatica, rivolta al
trattamento delle
malattie del sangue: le
cellule staminali,
prelevate dal paziente,
sono infettate con il virus
vettore che vi introduce il
suo genoma con il gene
normale. Le cellule
modificate
successivamente sono
iniettate in vena.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
TERAPIA GENICA (IV)

Esempio di terapia
genica su base
immunologica:
nelle cellule
tumorali sono
inseriti plasmidi
contenenti geni che
codificano proteine
capaci di stimolare
la risposta
immunitaria
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
TERAPIA GENICA (V)


Il trasferimento del gene "curativo" può avvenire in vari
modi; quello che attualmente appare più efficiente
utilizza i vettori virali: nel genoma virale è inserito il
gene di interesse, successivamente trasferito in una
cellula ospite sfruttando la capacità infettiva del virus.
A questo scopo i virus più promettenti risultano essere
i retrovirus, i lentivirus, gli adenovirus, i virus
adenoassociati, gli herpesvirus.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
TERAPIA GENICA (VI)


Nel complesso, la terapia genica è un metodo molto
promettente, potenzialmente capace di aprire ampi
orizzonti alla medicina e non solo, ma presenta ancora
molte difficoltà applicative, che attualmente ne limitano
l'utilizzazione curativa a un numero ridotto (almeno
rispetto alle possibilità) di patologie.
Sarà quindi necessario proseguire con ulteriori e più
approfonditi studi per garantire la necessaria sicurezza
che permetterà a questa forma di terapia di diffondersi
nella prassi medica.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
MARCATURA GENICA


Tramite il metodo della marcatura genica, i
procedimenti alla base della terapia genica possono
essere utili anche per ottenere informazioni di tipo sia
biologico sia clinico. In questo caso, il vettore virale
contiene un gene marcatore, che è trasferito in una
popolazione cellulare specifica, successivamente
reimpiantata nel paziente.
E' così possibile seguire il destino delle cellule marcate
all'interno di un organismo vivente. Questo tipo di
approccio è ancora sperimentale, ma è già in grado di
fornire informazioni molto utili.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
VACCINI (I)



Un'altra applicazione delle tecniche di manipolazione
del DNA è rappresentata dalla creazione di vaccini. In
questo caso, il tratto genico trasferito codifica per la
proteina contro la quale si desidera stimolare la
risposta del sistema immunitario. Il gene in oggetto
può entrare nell'ospite complessato in un vettore virale
o, semplicemente iniettato, come DNA nudo.
Come esempio si può citare il vaccino contro il virus
dell'epatite B (HBV, Hepatitis B virus), disponibile da
più di 20 anni.
Attualmente si sta lavorando su vaccini diretti contro
patologie come l'AIDS e alcuni tipi di tumore.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
VACCINI (II)

La tecnologia del DNA ricombinante garantisce una
purezza del vaccino più elevata rispetto a quella che
caratterizza i vaccini ottenuti dal plasma, cosicché è
stato possibile eliminare effetti collaterali dovuti a
sostanze presenti nel preparato di vaccinazione ma che
nulla hanno a che fare con esso. Inoltre, permette di
ottenere quantità pressoché infinite dell'antigene e
anche di abbassare i costi di produzione.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
MAPPATURA DEL GENOMA (I)


Tra le applicazioni della PCR una di quelle che ha avuto
più risonanza ha riguardato i vari progetti di mappatura
del genoma, compreso quello umano. Tra le possibilità
offerte per questo tipo di indagine, c'è per esempio
quella fondata sull'utilizzazione di particolari siti genici
costruiti per funzionare come marcatori, dando la
possibilità di disporre i frammenti del genoma (ottenuti
attraverso la PCR) nell'esatto ordine che dovrebbero
avere su uno specifico cromosoma.
Il completamento del Progetto genoma umano
(2001-2004) ha permesso di conoscere l'intera
sequenza del genoma dell'uomo.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
MAPPATURA DEL GENOMA (II)



Si tratta di un progresso di particolare importanza, con
ricadute potenzialmente molto interessanti, per
esempio nel settore medico.
Infatti, la conoscenza dell'assetto genetico di un
individuo può dare informazioni molto specifiche sulla
sua predisposizione verso particolari malattie, che
inoltre potrebbero essere diagnosticate precocemente,
e sulla sua eventuale sensibilità verso determinati
farmaci.
In questo modo, attraverso la conoscenza dello stato
di salute "genomico" di un paziente, è possibile
elaborare terapie personalizzate, dotate di maggiore
efficacia rispetto ad altre più generiche.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
MAPPATURA DEL GENOMA (III)

Schema delle
ricadute del
Progetto
genoma
umano
nell'ambito
sanitario,
nella ricerca
di base e nel
campo eticofilosofico.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
DIAGNOSTICA


L'utilità della PCR nel settore della diagnostica è
ormai da tempo riconosciuta e le applicazioni sono
numerose, in particolare questa tecnica risulta molto
efficace nell'individuare le mutazioni genetiche
causa di forme tumorali o di malattie ereditarie. Per
esempio, in oncologia con la PCR è possibile
controllare la comparsa di recidive in pazienti
leucemici che siano stati sottoposti a terapia.
La PCR è anche impiegata nella diagnosi delle
infezioni batteriche e virali.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
GENETICA FORENSE


Nell'ambito giuridico, la PCR è utilizzata per
amplificare le tracce di DNA presenti in alcuni tipi di
campioni prelevati dal luogo in cui è avvenuto un
reato. Questi campioni devono naturalmente essere
di origine biologica, come sangue, capelli, saliva,
sperma, pelle.
L'amplificazione del DNA garantisce quantità
sufficienti di materiale per poter effettuare tutte le
analisi necessarie, compresi i confronti tra
l'impronta genetica dei materiali biologici e quella
dell'eventuale sospettato.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
STUDIO MOLECOLARE DELL’EVOLUZIONE (I)

La PCR è impiegata anche negli studi di evoluzione
molecolare. E' infatti possibile misurare l'omologia
tra specie diverse confrontando le differenze
esistenti fra nucleotidi dello stesso gene: tanto
maggiore è la diversità tra le sequenze
nucleotidiche, tanto più elevata è le lontananza delle
specie rispetto a un antenato comune; tanto più alto
è il grado di conservazione di queste sequenze
nucleotidiche, tanto più vicine sono le specie dal
punto di vista evolutivo.
APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI MANIPOLAZIONE DEL DNA:
STUDIO MOLECOLARE DELL’EVOLUZIONE (II)


Importante è anche l'applicazione della PCR agli
studi sull'evoluzione di popolazioni umane, in
particolare per quanto riguarda l'analisi di particolari
siti del DNA mitocondriale.
Anche l'esame del DNA di origine retrovirale può
fornire utili informazioni sui processi di speciazione.
FINE