Progetto POM A32 – Risultati di due anni di attività – Termoli (CB), 1 e 2 Marzo 2001
Distribuzione dei patogeni dell’olivo in Puglia
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Saponari M., F. Nigro1, G. Loconsole1, G. Romanazzi1, N. Vovlas2, C. Cariddi1
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Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata, Università degli Studi di Bari
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Istituto di Nematologia Agraria, CNR, Bari
1. Importanza economica e diffusione dell’olivo in Puglia
L’olivo è una delle più importanti colture arboree dell’Italia meridionale e della Puglia
in particolare. Rilevante è, infatti, il ruolo che la coltura esercita nel complesso del reddito
agricolo regionale per quanto riguarda sia la produzione di olive da olio, che per quelle da
mensa. La Puglia, per estensione della superficie investita (360.000 ha), per numero di aziende
interessate (circa 250.000), e per valore della produzione (90.500 t, di olio pari al 36% di quella
nazionale), è la più importante regione olivicola italiana (Istat, 1998). Il comparto olivicolo
incide sulla Produzione Lorda Vendibile (PLV) regionale per 1.250 miliardi di lire, pari al 41%
della PLV nazionale dello stesso comparto produttivo (Istat, 1998). È evidente, quindi,
l'importanza che l'olivicoltura occupa nel complesso del reddito agricolo regionale e nazionale.
Su tutto il territorio regionale sono state censite circa 45.000.000 di piante, molte delle quali
sono secolari e costituiscono, tra l’altro, un patrimonio di ineguagliabile valore paesaggistico
ed ambientale.
L'olivo è presente su tutto il territorio regionale in condizioni pedoclimatiche ed agroeconomiche diverse, che, inevitabilmente, comportano differenze nelle scelte varietali, nelle
tecniche di coltivazione e, di conseguenza, nei livelli di produttività. Si va dagli oliveti
tradizionali, spesso realizzati in aree marginali e in coltura asciutta, con produzioni per ettaro
piuttosto modeste, ai nuovi impianti intensivi, irrigui, capaci di produrre anche 30 t di olive per
ettaro.
Per la costituzione dei nuovi impianti e, a volte, per l’infittimento di oliveti con ampi sesti
d'impianto, sono state scelte cultivar diverse dalle tradizionali “Ogliarola barese” , “Cellina di
Nardò”, “Coratina”. Tra le cultivar di recente introduzione si ricordano “Leccino”, “Picholine”,
“Frantoio”, “Nociara”, “Carolea”. Gli oliveti tradizionali sono caratterizzati da un ampio sesto
d'impianto (10 x 10 m oppure 12 x 12 m) con una certa variabilità da zona a zona in funzione
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della fertilità dei terreni e della disponibilità idrica. Nei nuovi impianti intensivi, invece, si
adottano sesti ridotti (fino a 5-6 m tra le file e 2,5-3 m sulla fila).
La produzione vivaistica olivicola interessa il 19% dei vivai presenti in Puglia, di cui solo il
6-7%, concentra la sua produzione esclusivamente su olivo, con una produzione annuale di
oltre 1.700.000 piante. L'attività vivaistica è distribuita su tutta la regione con una superficie
totale investita di circa 400 ha, concentrati soprattutto nelle province di Taranto, Lecce e Bari.
Ogni provincia privilegia una piattaforma varietale: la Cellina di Nardò e il Cipressino nelle
province di Taranto e Lecce; Coratina e Cima di Melfi nel barese; Peranzana nel foggiano. Le
varietà di recente introduzione (Leccino, Frantoio, Picholine) sono presenti più o meno in tutte
le province.
La tipologia di produzione è per il 90.5% di piante innestate. Tra le cultivar di olivo utilizzate
come portaseme ci sono: “Oliastro”, “Cellina di Nardò”, “Ogliarola salentina”, “Frangivento”,
“Cima di Mola”, “Ogliarola barese”.
2. Informazioni sullo stato sanitario della specie
Lo stato sanitario dell’olivo in Puglia non sembra molto rassicurante, considerando sia
la recente introduzione di nuove varietà, il cui comportamento verso i patogeni normalmente
presenti nella regione non è ancora del tutto noto, sia la recrudescenza di malattie che erano
considerate quasi scomparse. Inoltre, le recenti acquisizioni sulla diffusa presenza di patogeni
virali, oltre che in piante palesemente sintomatiche anche in piante apparentemente sane,
inducono ad una considerazione molto attenta dello stato sanitario della coltura.
Tra le malattie fungine, la “Verticilliosi”, grave tracheomicosi dell'olivo e di altre piante
arboree ed erbacee, causata da “Verticillium dahliae”, risulta in preoccupante espansione.
L'aumento della diffusione della malattia è particolarmente elevato nei giovani impianti, dove
l’impiego di materiale di propagazione infetto, l’utilizzo di tecniche intensive di coltivazione
(irrigazione e concimazioni abbondanti, sesti d’impianto ridotti), la consociazione o la
coltivazione in rotazione a specie ortive molto suscettibili hanno, con ogni probabilità,
contribuito alla diffusione della malattia. Anche l’“Occhio di pavone” (Fig. 1) e la
“Cercosporiosi”
causate,
rispettivamente,
da Spilocea
oleagina e
Mycocentrospora
cladosporioides (Fig. 2) risultano molto diffuse, soprattutto nelle aree in cui si verificano le
condizioni climatiche favorevoli agli agenti di tali malattie. La
“Lebbra”, causata da
Colletotrichum gloesporioides, malattia che dopo le forti manifestazioni epidemiche tra gli
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anni '50 e '60 sembrava quasi del tutto scomparsa in Puglia, ha mostrato recentemente una
forte recrudescenza. Gravi casi di “Lebbra”, infatti, sono stati riscontrati in diversi comuni delle
province di Brindisi e Lecce, territori che già in passato erano stati gravemente interessati dalla
malattia. Inoltre, anche nella provincia di Bari sono stati osservati casi isolati di lebbra su olive
della cv. “Ogliarola”.
.
Figura 1: Sintomi di cicloconio su foglie
Figura 2: Sintomi di cercosporiosi su foglie
Per quanto riguarda invece le malattie causate da virus ed agenti virus - simili, a parte
qualche caso di ingiallimento fogliare osservato nel nord-barese e nel tarantino, non ci sono
segnalazioni di gravi e diffuse sintomatologie di campo. Non per questo la coltura si può
ritenere indenne da infezioni virali; da un monitoraggio pressoché capillare nelle principali
aree olivicole della regione, infatti, la percentuale di diffusione di infezioni virali in impianti
commerciali su piante asintomatiche, è risultata elevata.
L’olivo ospita in natura numerose specie di nematodi fitoparassiti che possono in molti
casi determinare danni più o meno gravi in particolar modo nei giovani impianti. Tra essi le
specie che nella nostra regione hanno maggiore importanza sono: Meloidogyne javanica, M.
Figura 3: Attacchi di P. vulnus su radici di olivo
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incognita e Pratylencus vulnus. Entrambe le specie sono endoparassiti e inducono specifiche
alterazioni all’apparato radicale (Fig. 3 ).
Tra le batteriosi dell’olivo, la “rogna” causata da Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi, è
quella più diffusa e dannosa in Puglia. Essa infatti è presente in tutte le aree pugliesi dove è
coltivato l’olivo ed è particolarmente dannosa nelle zone più fredde e sulle cultivar di recente
introduzione.
3. Metodologia di campionamento e tecniche di saggio utilizzate per la valutazione dello
stato sanitario.
VERTICILLIOSI
La metodologia utilizzata per il campionamento è stata scelta sulla base di alcune
caratteristiche peculiari sia del patogeno che della malattia. V. dahliae, è un patogeno tellurico
con una distribuzione dei propaguli (microsclerozi) nel terreno di tipo aggregato. Tale tipo di
distribuzione è caratterizzata da una notevole eterogeneità spaziale e richiede l’analisi di un
elevato numero di campioni per poter ottenere una stima attendibile del valore medio di
microsclerozi presenti in un dato appezzamento. Considerata l’ampiezza della superficie
regionale investita ad olivo, la stima del valore medio di microsclerozi presente in un certo
comprensorio territoriale avrebbe richiesto l’analisi di un numero di campioni di terreno tanto
elevato da non risultare compatibile con i tempi ed i mezzi delle presenti indagini. Inoltre, per
le piante arboree non sembra esistere una relazione tra numero di microsclerozi nel terreno e
intensità della malattia; infatti, così come per tutti gli agenti tracheomicotici, potrebbe essere
sufficiente l’infezione da parte di un solo propagulo
per causare la morte della pianta.
Recentemente, alle due forme classiche di “Verticilliosi” (disseccamento apoplettico e cronico)
ne è stata aggiunta una terza. Si tratta di piante asintomatiche da cui è possibile esalare il
patogeno che è comunque caratterizzato da debole virulenza. L’esistenza di patotipi di V.
dahliae con diverso grado di virulenza, denominati defoglianti o non defoglianti e la possibilità
di infezioni asintomatiche, sottolinea ulteriormente l’importanza della pianta nella valutazione
dello stato sanitario.
Pertanto, la complessa relazione tra densità di inoculo nel terreno ed espressione
sintomatologica, nonché l’esistenza di patotipi di V. dahliae con diverso grado di virulenza,
sono stati fattori che hanno indotto a semplificare la metodologia di campionamento e di
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valutazione della distribuzione della malattia, facendo considerare la pianta come obiettivo
principale e specifico delle indagini. Tale
semplificazione si è resa necessaria per poter
ottenere una mappa semplice e di immediata lettura, in grado di fornire indicazioni sulla
presenza o assenza di malattia “in atto” negli oliveti.
I sopralluoghi sono stati effettuati in impianti commerciali giovani e adulti, sia scelti a
caso nel territorio delle aree olivicole rappresentativi della regione, sia segnalati da tecnici o da
agricoltori
in quanto mostravano sintomi di disseccamento in atto. I campi sono stati
ispezionati secondo uno schema appropriato (a X, a W o a Zig-Zag), in funzione della forma
dell’appezzamento) esaminando le piante per la presenza di disseccamenti della chioma, di
imbrunimenti della corteccia o nel legno di giovani rami. Poiché la frequenza di isolamento di
V. dahliae risulta legata allo stadio vegetativo della pianta ed alla temperatura ambientale, i
campionamenti sono stati effettuati in primavera-inizio estate, periodo in cui l’olivo è in attività
vegetativa e, generalmente, le temperature sono miti. Tali condizioni, infatti, sono solitamente
associate ad una elevata frequenza d'isolamento. I campioni (porzioni di rami) sono stati
prelevati sia da piante con sintomi che senza sintomi e la diagnosi della verticilliosi è stata
effettuata mediante l’isolamento in coltura su substrato agarizzato. Gli isolati ottenuti sono stati
identificati in base alle loro caratteristiche morfologiche, anche in confronto con quelle di
isolati di V. dahliae di riferimento.
VIRUS
I saggi virologici sono stati effettuati mediante tecniche di diagnosi molecolare (analisi
di acidi nucleici a doppia catena (dsRNA), amplificazioni geniche (RT-PCR), ibridazioni
molecolari), rilevatesi ben più sensibili ed attendibili dei tradizionali saggi biologici mediante
trasmissioni meccaniche. I tessuti utilizzati come substrato per i saggi sono floema e corteccia
ricavati da 5-6 rami ben lignificati di uno o più anni, prelevati dai quattro punti cardinali della
pianta. Il tessuto ricavato è stato polverizzato in azoto liquido e sottoposto ad estrazione di
dsRNA (tecnica di diagnosi aspecifica che rileva la presenza di un’infezione virale senza
identificarne l’agente) o di acidi nucleici totali (TNA) nel caso di PCR e ibridazioni molecolari.
Il saggio mediante PCR è stato utilizzato per la diagnosi del virus OLYaV (virus
associato all’ingiallimento fogliare dell’olivo). Il TNA estratto è stato sottoposto a trascrizione
inversa, per la sintesi del cDNA, e successivamente in un apposito termociclatore alla reazione
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di amplificazione genica con l'utilizzo di coppie di sequenze innesco (primers) virus-specifiche.
Il DNA ottenuto è stato poi analizzato in gel di poliacrilammide mediante corsa elettroforetica.
L'ibridazione molecolare è stata utilizzata per la diagnosi di ArMV (Mosaico dell’
Arabis), CLRV (Accartocciamento fogliare del ciliegio), SLRV (Maculatura anulare latente
della fragola). Aliquote di TNA, dopo denaturazione in sodio idrossido sono state poste su
membrana di Nylon. Le membrane ottenute sono state incubate per una notte con una soluzione
contenente la miscela delle tre sonde virus-specifiche marcate, con digossigenina. Dopo diversi
lavaggi e un'incubazione con un anticorpo coniugato anti-digossigenina la membrana è stata
incubata con il substrato e di seguito esposta su una lastra autoradiografica e sviluppata dopo
qualche ora.
Per i Nepovirus ArMV, CLRV e SLRV è stato possibile, utilizzando, una miscela di
sonde
poter
rilevare
da
un’unica
membrana
la
presenza/assenza
dei
tre
virus
contemporaneamente.
Pertanto a un'unica estrazione del campione è seguita nel caso di OLYaV la PCR,
mentre nel caso di ArMV, CLRV, SLRV l'ibridazione molecolare, con il vantaggio di
processare il campione una sola volta. Con tali tecniche sono stati analizzati oltre 900 campioni,
raccolti in impianti commerciali di almeno 25 anni di età, distribuiti nelle principali aree
olivicole della regione, con particolare attenzione alle aree dove è più presente l’industria
vivaistica. I campioni all’interno degli impianti sono stati raccolti in maniera randomizzata.
NEMATODI
Per la realizzazione delle mappe di distribuzione di Meloidogyne javanica, M. incognita
e Pratylencus vulnus, sono stati esaminati circa 350 campioni di terreno e radici. Questi sono
stati prelevati dalla rizosfera di olivo alla profondità di 20-40 cm, conservati in sacchetti di
plastica e trasferiti in laboratorio per le analisi. L’estrazione delle forme mobili è avvenuta con
il metodo dei setacci e/o mediante centrifugazione. Analogamente le forme sedentarie (adulti)
sono state estratte dai tessuti mediante centrifugazione. L’osservazione microscopica è stata
effettuata su preparati temporanei permanenti infiltrati in glicerina. Nelle mappe (Figg. 8 e 9)
sono state evidenziate le aree regionali in cui i ritrovamenti dei nematodi sono risultati positivi.
Gli areali comunali non segnalati cromaticamente sono invece da considerarsi esenti dalle due
specie studiate. Nell’indagine, in nessun caso, sono stati rinvenuti esemplari di Xiphinema
diversicaudatum.
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ROGNA
Per quanto riguarda la “rogna”, poiché la sintomatologia è altamente specifica (Fig. 4),
in genere non si rendono necessari gli accertamenti di laboratorio. Nel periodo primaverile e
autunnale allo scopo di verificare che la presenza dei sintomi fosse sempre associata a quella
del patogeno sono stati comunque prelevati sporadicamente e in maniera non sistemica
campioni da piante di olivo con sintomi situate in diverse aree olivicole pugliesi e sottoposti ad
analisi di laboratorio. Da giovani tubercoli, dopo lavaggio e disinfezione superficiale, sono
stati effettuati isolamenti su substrati colturali specifici e le colonie pure, scelte in funzione
delle caratteristiche morfologiche, identificate sulla base dei caratteri biochimici, fisiologici e
nutrizionali.
Figura 4: Sintomi di rogna su germogli e branche
4. Conclusioni
La mappa di distribuzione della "Verticilliosi" (Fig. 5) mette in luce una situazione
preoccupante circa la presenza della malattia in Puglia. Infatti, la malattia è stata ritrovata oltre
che in impianti situati lungo le zone costiere delle province di Bari e Taranto e realizzati su
terreni che avevano ospitato in precedenza colture ortive suscettibili a V. dahliae, anche in
giovani oliveti impiantati in terreni apparentemente mai coltivati con specie ortive suscettibili.
Queste ultime, in relazione alle più intensive tecniche di coltivazione, possono determinare un
aumento della densità di inoculo del patogeno nel terreno. Al riguardo, risultati di saggi svolti
per accertare la presenza del fungo nel terreno dimostrano che in numerosi giovani impianti la
malattia è presente pur non essendoci microsclerozi di V. dahliae. Pertanto, non è escluso che la
malattia sia dovuta all'introduzione di piante infette. L’impiego di materiale di propagazione
sano e l’adozione di opportune pratiche colturali di lotta (ad es., evitare consociazioni con
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specie suscettibili, non impiantare su terreni infetti, non eccedere con le concimazioni azotate e
le irrigazioni, ecc.), rappresentano al momento strategie di estrema importanza per contrastare
la diffusione della malattia.
La realizzazione delle mappe di distribuzione dei virus (Figg. 6 e 7) si riferisce alla
presenza/assenza del virus evidenziata dai saggi di laboratorio e non alla diffusione di malattie
di origine virale, in quanto in nessuno degli impianti oggetto di monitoraggio sono state
osservate sintomi delle malattie.
In contrasto con l’assenza di chiare manifestazioni sintomatologiche di campo i metodi
molecolari di saggio adottati hanno evidenziato la diffusa presenza di infezioni virali (fino al
50%) allo stato latente da parte di agenti virali sia ubiquitari (ArMV, CLRV, SLRV) che non
ubiquitari (OLYaV). Pertanto si può concludere che i casi sporadici di malattie virali non sono
indice di scarsa percentuale di infezione ma piuttosto di una scarsa reattività sintomatica
dell’olivo a tale tipo di infezioni. La latenza di tali virus rende l’olivo un potenziale serbatoio
di virus per altre specie vegetative e, inoltre, sottolinea l'inadeguatezza di quanto previsto dal
D.M. 14/04/1997 nell’allegato II, dove in termini di requisiti fitosanitari delle fonti di
approvvigionamento si richiede l’esenza da tutti i virus. Per lo Pseudomonas savastanoi pv.
savastanoi, poiché le infezioni sono risultate costantemente presenti in tutte le aree olivicole
pugliesi, si è ritenuto di poca utilità la realizzazione di una mappa di distribuzione di tale
patogeno. L'ubiquità della malattia, la sua pericolosità e dannosità, pongono seri problemi sulla
sanità delle produzioni vivaistiche che, comunque, deve essere assicurata per limitare la
ulteriore diffusione della malattia sia delle cultivar tradizionalmente presenti nella regione sia di
quelle di recente introduzione
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Fig. 5. Mappa di distribuzione della verticillosi
Oliveti senza infezioni
a
Oliveti con infezioni
b
c
Sintomi di verticillosi a) in un giovane
impianto; b) striature necrotiche su giovane
ramo; c) settori del cilindro legnoso con
imbrunimenti.
N
W
E
S
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Fig. 6. Mappa di diffusione dei Nepovirus su olivo : Mosaico
dell’Arabis (ArMV), Accartocciamento fogliare del ciliegio (CLRV),
Maculatura latente anulare della fragola (SLRV)
Sintomi di butteratura sui frutti causati da infezioni di SLRV
N
- Positivi
- negativi
W
E
S
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Fig. 7. Mappa di diffusione del Virus associato all’ingiallimento fogliare dell’olivo
(OLYaV)
Sintomi di giallume associati alla presenza di OLYaV
N
W
Mappa di diffusione del Virus associato all’ingiallimento fogliare dell’olivo
(OLYaV)
E
S
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Fig. 8. Mappa di diffusione del nematode Pratylencus vulnus
Castelnuovo
Della Daunia
Foggia
Pratylenchus vulnus
Cerignola
BARI
Rocchetta S. A.
Bitonto
Monopoli
Spinazzola
Sintomi di attacchi di Pratylencus vulnus
Massafra
Dislocazione vivai pugliesi
Palagiano
Brindisi
Lecce
N
W
Tricase
E
S
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Fig. 9. Mappa di diffusione dei nematodi: Meloidogyne javanica, Meloidogyne
incognita
Meloidogyne javanica
Foggia
Meloidogyne incognita
Canosa
BARI
Rocchetta S. A.
Monopoli
Brindisi
Sintomi di attacchi di Meloydogine spp.
Palagiano
Dislocazione vivai pugliesi
Ginosa
Castellaneta
N
S. Pietro
Vernotico
W
E
S
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