Contributi pratici

Contributi pratici
Virus della Rinotracheite Bovina
Infettiva (BHV-1): identificazione
diretta con un metodo di
biologia molecolare (PCR)
L’herpesvirus bovino sierotipo 1
(BHV-1), colpisce i bovini manifestandosi con patologie a carico degli apparati respiratorio (IBR o Rinotracheite
Infettiva Bovina – predominante sottotipo 1.1) e genitale (IPV o Vulvovaginite Pustolosa Infettiva – predominante sottotipo 1.2). Questa infezione
è diffusa in tutto il mondo e causa
notevoli danni economici dovuti a
morte degli animali, aborto, diminuzione della produzione di latte e perdita di
peso corporeo.
La IBR è caratterizzata da diversi
gradi di coinvolgimento dei vari distretti dell’apparato respiratorio, con possibile interessamento oculare (cheratocongiuntivite). Nella bovina gravida,
all’infezione respiratoria può succedere il coinvolgimento fetale e l’aborto, al
quale talora residua una metrite. L’infezione dei genitali esterni (IPV) ad
opera di determinati stipiti di BHV-1
induce la comparsa di vulvovaginite
nella femmina e balanopostite nel maschio, entrambe a carattere pustoloso.
La trasmissione può avvenire per via respiratoria o per via genitale.
In alcuni Paesi europei (Svizzera, Austria,
Danimarca, Svezia, Norvegia, Finlandia) specifici piani di controllo hanno portato alla completa
eradicazione, mentre in
altri (Germania, Francia,
Olanda, Belgio) tali piani sono attualmente in
corso. Nel nostro Paese,
dove l’infezione, sulla base di ripetute indagini sierepidemiologiche, pare
coinvolgere oltre il 60%
degli allevamenti da latte, il controllo dell’infezione vede primeggiare
la provincia di Bolzano con il raggiungimento della qualifica di ufficialmente
indenne (Decisione CE 2000/502 del
27/07/2000), mentre ha assunto il carattere dell’ufficialità nella provincia di
Trento e nelle regioni Friuli Venezia
Giulia e Veneto, le quali hanno approvato dei piani di controllo obbligatori
della malattia. Altre regioni come la
Lombardia e il Piemonte prevedono
l’adesione da parte degli allevatori solo
su base volontaria.
Per attivare un piano di eradicazione è necessario mantenere una scrupolosa gestione dell’azienda a livello sanitario applicando misure di profilassi
diretta ed indiretta: pulizia e disinfezione dei ricoveri; isolamento o allontanamento dei capi positivi; massimo controllo per i nuovi capi introdotti in
azienda, in fiere, mercati e pascoli; evitare contatti con altri allevamenti; massima cura nella gestione aziendale; piani vaccinali adeguati allo stato sanitario e alla tipologia dell’allevamento.
Un passo fondamentale per l’azio-
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Il Progresso Veterinario 8/2004
A. L. Langellotti 1,4,5, C. Sarasso 1,5,
M.Valisi 2, M. Favilla 6,A. Stangalini 3
1 Laboratorio MTB, Novara;
2 Clonit srl, Milano;
3 Fleming Research Srl, Milano;
4 Università “Federico II”, Napoli;
5 Università “A.Avogadro”, Novara;
6 Dipartimento di Prevenzione ASL 13,
Novara.
ne di risanamento è rappresentato dall’introduzione di vaccini costituiti da
virus vivi deleti del gene che codifica
per la glicoproteina marker E (gE-).
Con questo vaccino è possibile distinguere su base sierologica gli animali
infetti da quelli vaccinati.
Per verificare lo stato sanitario dell’animale sono disponibili commercialmente dei test diagnostici in ELISA
per la rilevazione degli anticorpi specifici per le glicoproteine gB e gE. Nel
caso della rilevazione degli anticorpi
diretti alla glicoproteina gB, la rilevazione di questi risulta efficace solo
dopo 7 giorni dall’infezione. Inoltre,
per la rilevazione degli anticorpi specifici per la glicoproteina gE la rilevazione si ha solo dopo 11-17 giorni dall’infezione. Prove condotte in numerosi
laboratori hanno mostrato una notevole variabilità nella sensibilità di questi test, soprattutto in animali con un
basso titolo di anticorpi specifici.
La Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) rappresenta un eccellente
strumento per una veloce e sensibile rilevazione
di genomi virali in campioni biologici.
In questo lavoro è
stato messo a punto un
test pronto all’uso con
metodo PCR per la rilevazione diretta e specifica del genoma virale di
BHV-1 da vari materiali
biologici (sangue periferico, seme e mucosa nasale di bovini infetti).
Per garantire una
sensibilità elevata del sistema diagnostico è stata allestita una PCR nested per le regioni geniche gB e gE, una relativa al gene della glico-
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proteina B e l’altra relativa al gene
della glicoproteina E. La PCR nested
mediante due consecutive amplificazioni permette una rilevazione sensibilissima del genoma virale nei campioni
biologici, nel caso del sangue periferico
ad esempio si può arrivare a discriminare una sola copia di genoma virale in
107 leucociti. Inoltre, analizzando la
presenza di entrambe le regioni geniche (gB e gE) è possibile distinguere
gli animali infetti da quelli vaccinati
con il virus deleto.
I primer testati sono stati selezionati sulla base di dati bibliografici, controllando la loro specificità su banche
dati genomiche internazionali.
L’esecuzione del test si può sche-
mer gE1/2 e gEN1/2.
6) in caso di negatività di questa seconda analisi l’animale sarà considerato
vaccinato con il vaccino deleto, mentre
in caso di positività l’animale sarà considerato infetto.
Anche questo test, come tutti gli
altri disponibili in commercio (ELISA,
etc.), chiaramente non distingue gli
animali infetti da quelli trattati con i
vaccini tradizionali in cui il genoma
virale è completo, ma dispone di maggiore sensibilità e rapidità oltre a fornire la possibilità di rilevare DNA in
infezioni latenti e nel seme.
Nei piani di eradicazione della
malattia, dove l’impiego del vaccino
tradizionale è proibito, questo test
oggi molto usato per la fecondazione
artificiale;
3) verificare la presenza del virus negli
animali infetti distinguendoli da quelli
vaccinati con il virus marker gE negativo.
La bibliografia è disponibile sul sito:
www.ilprogressoveterinario.it
Fig. 2 Elettroforesi dei prodotti della prima e
della seconda reazione di PCR (nested) sul
gene gB. Campioni 1, 2 e 3 positivi. Campione 4 controllo negativo.
Fig. 1 Mappa genomica del virus BHV-1 con la localizzazione dei geni delle glicoproteine.
Sono indicate le regioni amplificate nelle prime reazioni di PCR e nelle PCR nested e le loro
rispettive dimensioni.
matizzare nelle seguenti fasi:
1) estrazione del DNA virale dai campioni biologici (tamponi nasali, seme,
sangue) mediante Kit di estrazione
specifici per i genomi virali;
2) esecuzione di una PCR nested sul
gene gB utilizzando le due coppie di
primer gB1/2 e gBN1/2;
3) corsa elettroforetica su gel di agarosio e rilevazione del prodotto amplificato;
4) in caso di negatività si potrà refertare
l’analisi come negativa, in questo caso
dato che il gene in questione è presente
sia nel virus di campo che nel virus deleto della regione gE contenuto nel vaccino, l’animale oltre ad essere non infetto
risulta anche non vaccinato.
5) in caso di positività come nella Fig. 2
verrà condotto un ulteriore test sul
gene gE utilizzando due coppie di pri-
potrebbe rivelarsi uno strumento sensibilissimo per:
1) accertare la presenza del virus nei
capi di nuova introduzione nelle
aziende;
2) certificare l’assenza del virus nel
seme bovino fresco e criopreservato,
Fig. 3 Elettroforesi dei prodotti della prima e
della seconda reazione di PCR (nested) sul
frammento del gene gE. Campione 1 e 3 positivi per il virus WT. Campione 2 positivo
per vaccino deleto della regione gE. Campione 4 controllo negativo.
Schema dell’interpretazione dei risultati del test in PCR
Stato sanitario dell’animale
Animale infetto
Animale non infetto, non vaccinato
Animale vaccinato con vaccino deleto
e non infetto
Animale vaccinato con vaccino
tradizionale
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Esito test PCR
Positivo 1° test (gB)
Positivo 2° test (gE)
Negativo 1° test (gB)
Positivo 1° test (gB)
Negativo 2° test (gE)
Positivo 1° test (gB)
Positivo 2° test (gE)
Dichiarazione
Positivo IBR
Negativo IBR
Negativo IBR
Vaccinato con virus deleto
Positivo IBR