Produzione di animali transgenici

Organismi geneticamente modificati: i trangenici
Modificazione genetica: introduzione stabile di un gene in un altro organismo
Modificazione genetica di:
Batteri
Eucarioti unicellulari, come i lieviti Saccharomyces
Linee cellulari, processo facile, ma finalizzato e limitato ad un determinato scopo
Organismi pluricellulari (animali, piante) processo complesso.
Introduzione del transgene clonato in:
 cellule somatiche per terapia genica
 cellule germinali per la produzione di piante ed animali transgenici
 cellule germinali consentendo la trasmissione alle generazioni successive: clonazione di piante ed animali
Introduzione di un transgene (dalla stessa specie o specie diversa):
colmate distanze evolutive (gene di pesce in una pianta di pomodoro, per la resistenza al freddo)
Specie modello utilizzate per la produzione dei trangenici
Facile manipolazione
Estensione dei risultati a specie più complesse
•
•
•
•
•
•
Muffe mucillaginose (dictyostelium discoideum), in abbondanza di nutrienti si
comporta come organismo unicellulare, ma in carenza di cibo diventa un
organismo multicellulare, strisciante e contenente un corpo fruttifero e uno
stelo
Il nematode Caenorhabditis elegans, contiene esattamente 959 cellule, facile
da mantenere in laboratorio, molto utilizzato negli esperimenti di iRNA
Drosophila elanogaster, moscerino della frutta, molti sistemi comuni all’uomo
(differenze: colonna vertebrale/esoscheletro)
Danio renio (Zebrafish), facile da usare in laboratorio, geni dello sviluppo
embrionale e del sistema immunitario correlati ai processi osservati nell’uomo.
Modello di studio anche per il ciclo circadiano e per gli effetti di farmaci
I topi: modello d’elezione, nonostante i costi e limiti etici
A livello commerciale: piante, ma anche animali usati come «bioreattori» per il
pharming
Produzione di animali trangenici
Introduzione del costrutto transgenico nella linea germinale per la
trasmissione alla progenie che ne conterrà almeno una copia in tutte le sue cellule:
• Iniezione diretta in ovociti (micromanipolazione)
• Utilizzo di vettori retrovirali
• Colture di cellule staminali embrinali
SCOPO:
inattivare un gene specifico (knock out);
oppure introdurre un gene esogeno all’interno di una cellula (knock in).
Produzione di animali transgenici: iniezione diretta
Introduzione del costrutto transgenico:
• Stimolazione e preparazione della cellula uovo fecondata in cui introdurre il costrutto
• La microiniezione può causare danni e alcune cellule uovo non sopravvivono, altre sopravvivono ma non si sviluppano, inoltre sono una
parte conterrà il transgene, quindi sarà necessario analizzare il transgene
• La cellula verrà coltivata in vitro ed impiantata in una madre pseudogravida
• Una madre pseudogravida è ottenuta facendo accoppiare una femmina con un maschio vasectomizzato, per assicurare uno stato
ormonale ricettivo)
Produzione di animali trangenici: iniezione diretta
Analisi del transgene per valutare la presenza del gene esogeno:
Screening della progenie
Iniezione diretta: metodo più utilizzato, garantisce una risposta “tutto o nienete”, se è presente il transgene
esso sarà contenuto in tutte le cellule dell’animale e può essere applicabile ad una varietà di animali
Produzione di animali trangenici: iniezione diretta
efficienza
Produzione di animali trangenici: utilizzo di vettori virali
Vantaggi:
•
•
•
•
Tecnicamente più facile, riduce la perdita
di uova a causa della non sopravvivenza
all’iniezione
Alta efficienza di trasduzione
Massimo inserto 8 kb di DNA
Ha bisogno di un virus helper per essere
infettivo
Applicazioni dell’iniezione diretta:
animali transgenici come “bioreattori”
Problematiche:
• Integrazione non mirata: gene integrato nel genoma in modo
casuale. Ciò potrebbe distruggere un altro gene o alterarne
l’espressione, se si integra in regioni regolative. A volte può essere
anche letale.
• Non tutte le regioni della cromatina saranno in grado di sostenere
la sua espressione.
• Numero di copie integrate sarà variabile da una a centinaia/cellula
• Espressione del gene dovrebbe essere ristretta a tessuti specifici
• Bassa efficienza in molte specie animali
• Possibile reinfezione, possibilità di generare nuovi virus patogeni
per ricombinazione
• Reazioni immunitarie
Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
SCOPO
Inserzione mirata:
inattivare un gene specifico (knock out); oppure introdurre un gene esogeno all’interno di una cellula (knock in).
Preparazione del costrutto, introduzione in ES cells,
selezione positiva o negativa
Infezione a 8 cellule, non tutte le
cellule potrebbero essere infettate,
possibile mosaicismo
In tal caso saranno necessari reincroci
Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
Alcune cellule isolate da animali adulti possono essere facilmente
manipolate ed mantenute in coltura per periodi limitati di tempo, ma particolari
condizioni possono essere mantenute in laboratorio per periodi di tempo
indefiniti dando origine a linee cellulari stabilizzate.
Trasfettare queste cellule è più facile dell’introduzione di materiale
genetico in una cellula fecondata. Tuttavia queste cellule non possono
essere usate per produrre un animale completo.
Mentre le cellule staminali possono essere indotte a differenziare in molti tipi
di cellule diverse a seconda del grado di differenziamento:
• Multipotenti possono differenziare in diversi tipi di cellule Pluripotenti
possono differenziare in molti tipi di cellule
• Totipotenti possono differenziare in tutti i tipi di cellule
Per la produzione di animali transgenici si utilizzano le cellule
pluripotenti, che possono originare tutti i tipi cellulari dell’embrione, ma
non gli extra-embrionali, chiamate cellule staminali embrionali (cellule
ES)
Le cellule ES sono isolate dalle cellule embrionali di una blastocisti, possono
essere coltivate in vitro per un periodo di tempo e trasfettate col
transgene. Nel costrutto è possibile inserire un marcatore per la selezione dei
ricombinanti in coltura, da impiantare poi in una nuova blastocisti in stadio
precoce di sviluppo e trasferite in una madre pseudogravida.
Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
La progenie sarà chimerica, non conterrà il transgene in
tutte le cellule, e sarà eterozigote, in genere solo uno dei
cromosomi avrà inserito il transgene.
Sarà necessario effettuare degli incroci per poter isolare
un topo mutante eterozigote. E reincrociare gli eterozigoti
per ottenere l’omozigote mutato.
A questa strategia è applicabile il gene editing per
effettuare un’inserzione mirata: Molto usata per
produrre topi transgenici.
Vantaggi del gene editing in cellule ES:
• integrazione diretta verso specifiche sequenze geniche,
• selezione rapida delle cellule ES in coltura, con il
transgene in posizione specifica, prima di impiantarle
nell’embrione (eticamente più accettabile),
Svantaggi del gene editing in cellule ES:
• Possibile mortalità degli omozigoti durante lo sviluppo
• Migliorabile se l’espressione del transgene viene resa
tempo e tessuto specifica
Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
Knock in: INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (modelli di patologie con
mutazioni puntiformi; geni reporter)
• In genere tali difetti non sono letali
• Introduzione del gene mutato per produrre un animale transgenico modello di studio
per quella patologia
• Modelli di studio per nuove applicazioni terapeutiche biotecnologiche
• Modelli per test farmacologici e di tossicità
Knock out: INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene
•
Il gene bersaglio è interrotto con l’introduzione del gene neo, che nei batteri da la
resistenza alla neomicina, ma nelle cellule animali si usa il G418 (antibiotico
aminoglicosidico, geneticina) (selezione positiva)
•
Introduzione di un secondo marcatore il gene per la timidina kinasi (TK), fuori dalla
regione di ricombinazione omologa per escludere quelle cellule dove
l’integrazione sia avvenuta fuori dalle regioni di ricombinazione omologa (selezione
negativa)
•
Distanza del promotore dal transgene, meglio utilizzare il promotore del gene di
provenienza, ma serviranno anche elementi tessuto specifici
•
I topi knock out sono cruciali per gli studi di analisi della funzione genica
Molto utilizzati anche per l’analisi della funzione di iRNA (microRNA e siRNA)
sull’espressione di un mRNA esogeno derivante dall’espressione di un transgene:
ciò permette di osservare il knock out genico mentre avviene. I limiti sono l’incompleta
inattivazione genica col siRNA ed il fatto che possa inibire più target genici.
Ricombinazione omologa sistema CRE/lox
Knock out/in condizionale:
introduzione dell’alterazione genica mediante un promotore tempo e/o tessuto specifico
Delezione tessuto specifica
Gene targeting: controllo dell’espressione del transgene
transgenesi condizionale
1)
2)
3)
Attivazione di un fattore transattivante tramite un ligando
Legame al promotore del transgene del fattore transattivante
Attivazione della trascrizione del transgene da parte del fattore
transattivante
Fattore
transattivante
Gene targeting: controllo dell’espressione del transgene
Tet-Off
1)
2)
3)
VANTAGGI
• Ben
note
proprietà
della
Tc/DOX:
farmacocinetica, buona distribuzione tissutale,
bassa tossicità, capacità di attraversare
membrane cellulari
• Grande induzione in alcuni tessuti (anche 5
ordini di grandezza)
SVANTAGGI
• Attività residua del promoter minimale tetOffCMV
• Tossicità cellulare del transattivatore
• Bassa sensitività alla DOX in alcuni tessuti
• Basse cinetiche di induzione in vivo
TeT-Repressor: repressore della trascrizione
Tc/Dox: tetraciclina/doxyciclina
TRE: tetracycline response element
Gene targeting: controllo dell’espressione del transgene
Tet-Off/Tet-On
Tet-Off
Tet-On
Aumentata velocità di espressione del transgene:
completa attivazione in 1 ora, rispetto alle basse cinetiche di
attivazione del sistema Tet-Off (fino ad una settimana)
Gene targeting: controllo dell’espressione del transgene
Tet-off/Tet-on
Tet-off system
Tet-on system
Gene targeting:
controllo dell’espressione del transgene - Tet-Off/tessuto-specifica
Ro1
(RASS based on opioid receptor n°1)
MHC-tTA/tetOn-Ro1 mice
Sono stati ottenuti per incrocio.
Una linea di topi transgenico che esprimono
recettore Ro1 (sotto il controllo di un gene Tet-Off)
inibito dal legame di tTA+doxorubicina
E
un'altra linea di topi che esprimono il gene per il
fattore tTA (sotto il controllo di un promotore
specifico MHC-cuore)
http://physiologyonline.physiology.org/content/23/6/313.full-text.pdf+html
Produzione di animali trangenici: YAC transgenic mice
Vantaggi:
Trasferire geni di grandi dimensioni 300-1000 Kb, possibile includere
nel vettore sequenze regolative, oltre a quelle codificanti, per
controllare e per modificare l’espressione genica (YAC)
Metodi per trasferire uno YAC nel topo:
•
•
•
Fusione di SFEROPLASTI (cellule Lievito senza parete) + cellule
ES (rischio di contaminazione con genoma Lievito)
Purificazione di YAC (separato per elettroforesi) + microiniezione
nel pronucleo (se YAC non ha dimensioni grandi, altrimenti si
frammenta)
Trasferimento di YAC nelle ES tramite LIPOSOMI (vescicole
lipidiche artificiali per fusione con membrana)
Esempi:
•
•
•
YAC di 670 Kb contenente il gene umano per HPRT in cellule ES
di topo (l’ipoxantina fosforibosil trasferasi regola la funzione
renale)
YAC di 400 Kb contenente il gene umano APP in cellule ES di
topo (codifica il precursore della proteina amiloide Alzheimer)
YAC contenente il gene umano per la catena leggera/pesante
IgG in topo (produzione di anticorpi)
Clonazione
Per clonazione artificiale si intende la generazione di un intero organismo a partire da una singola cellula.
Questa tecnica permette di ottenere copie geneticamente identiche dell’organismo di partenza e trova applicazioni nella zootecnia (ad
es. per riprodurre animali dalle caratteristiche eccellenti come cavalli da corsa, mucche da latte o tori da riproduzione), ma anche nella
conservazione dell’ambiente (per esempio per ripopolare specie animali in via di estinzione che non è possibile fare riprodurre
naturalmente in cattività).
Trasferimento nucleare
1. Il nucleo aploide di una cellula uovo
ricevente viene sostituito con il nucleo
contenente il genoma diploide di una
cellula somatica del donatore;
2. Lo pseudo-zigote (cellula uovo resa
diploide non per fecondazione con uno
spermatozoo) dà origine a un embrione,
anche se il suo genoma deriva da una
cellula adulta (cioè differenziata)
Clonazione
Con questa tecnica è stata generata nel 1996 la pecora Dolly, il primo animale a essere clonato da una cellula somatica
Trasferimento nucleare
3. L’embrione viene trasferito nell’utero di una femmina della specie donatrice (madre
surrogata);
4. La prole avrà il genoma identico (clone) a quello della cellula somatica donatrice.
La pecora Dolly nacque, clonata, nel 1996 e
visse per sette anni, durante i quali diede
alla luce diversi cuccioli; ora è conservata in
un museo a Edimburgo.
Le biotecnologie
sono applicazioni tecnologiche di fenomeni naturali
Tutte le tecniche esposte finora, dalle più semplici alle più avanzate, hanno una caratteristica comune: sono
derivate da processi naturali.
Le biotecnologie, infatti, sfruttano le proprietà biologiche delle molecole (DNA, RNA, proteine) e i processi fisiologici
corrispondenti (replicazione del DNA, risposta immunitaria, etc.), replicandoli in sistemi in vitro controllati e adattandoli
alle particolari esigenze dell’operatore.
Applicazioni
•
•
•
•
Produzione di animali da allevamento,
modificati per produrre razze specializzate
(crescita più veloce, produzione di più latte,
etc), prodotti commercialmente utili
Produzione di piante transgeniche OGM,
molecular pharming
Bioreattori: produzione di farmaci, vaccini
Produzione di sistemi modello murini per lo
studio di malattie umane
Terapia genica (o Clonazione terapeutica):
somatica e germinale
Produzione di animali da allevamento
Produzione di animali come bioreattori
Produzione di OGM
Produzione di OGM
Plant Molecular Pharming
A
DNA
molecule
carrying the genetic
information
for
a
pharmaceutical
substance
is
introduced into the
plant genome
Clonazione: le specie estinte
La tigre dai denti a sciabola
(Smilodon
fatalis),
vissuta
nel
Pleistocene (Corey Ford/Stocktrek
Images/Corbis)
Il dodo (Raphus cucullatus), estinto
nel XVII secolo, in un disegno di
Adriaen van de Venne del 1626
(Wikimedia Commons)
Il quagga (Equus quagga quagga),
una sottospecie di zebra estinta nel
XIX secolo (Wikimedia Commons)
La tigre della Tasmania (Thylacinus
cynocephalus), il marsupiale estinto
nel 1936 a causa della competizione
con il dingo. La foto ritrae l'ultimo
esemplare, ospitato nello zoo di
Hobart (John Carnemolla/Corbis)
L'Uro
(Bos
primigenius);
addomesticato dall'uomo, si estinse
nel 1627 (Wikimedia Commons)
Lo stambecco dei Pirenei (Capra
pyrenaica pyrenaica), una sottospecie
dello stambecco spagnolo estinta nel
2000
L'Huia (Heteralocha acutirostris),
diffuso in Nuova Zelanda, estinto nel
XIX secolo (Wikimedia Commons)
Il picchio imperatore (Campephilus
imperialis), avvistato per l'ultima volta
nel 2005 e oggi ritenuto estinto
(Wikimedia Commons)
Clonazione: la ricetta della resurrezione
Colomba migratrice
Clonazione: la de-estinzione
L'ultimo esemplare di mammut (Mammuthus primigenius) sarebbe scomparso
circa 4000 anni fa (Wikimedia Commons)
Clonazione umana
Clonazione umana - Eugenetica
Selezione del donatore,
estrazione del DNA
da una cellula somatica
clonaggio
Equality & Diversity
Tedofori della fiamma della conoscenza
non semplici prodotti di un processo evolutivo divergente