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Fattori genetici alla base della suscettibilità alla
scrapie
Il progetto pilota per la selezione genetica degli ovini in provincia di
Siena: una praticabile prospettiva strategica di prevenzione delle EST
24 febbraio 2011
Siena
Dr. Gabriele Vaccari
Istituto Superiore di Sanità
Sanità
Dipartimento di Sanità
Sanità Pubblica Veterinaria
e Sicurezza Alimentare
Suscettibilità genetica alle malattie
• Influenza del genotipo dell’ospite allo
sviluppo di malattia.
• Nelle TSE questa predisposizione è correlata
in larghissima misura con un singolo gene.
• Gli ovini e la scrapie rappresentano un caso
emblematico per la gestione di una malattia
applicando la selezione genetica.
Gli studi che hanno portato alla
definizione di resistenza
I primi studi di trasmissione hanno
evidenziato come nelle pecore
esistessero sempre dei resistenti
mentre nelle capre
erano tutte suscettibili.
9
/2
14
26
4/
2
/1
12
10
4/
6
/1
16
10
4/
0
/1
10
Pattison et al., 1959
Gli studi che hanno portato alla
definizione di resistenza
La scrapie è stata trasmessa a varie specie animali.
Tuttavia solo nelle pecore, gli ospiti naturali di questa
malattia, sono stati descritti animali che appaiono essere
resistenti….
… questa resistenza ha una base che può essere di
natura genetica o immunologica …
Dickinson et al., 1968
Gli studi che hanno portato alla
definizione di resistenza
La trasmissione
sperimentale della scrapie
nelle pecore ha evidenziò
fin dall’inizio un numero di
sopravvissuti.
I suscettibili furono divisi in
due gruppi di tempi di
incubazione Short (SIP) e
longer (LIP).
Dickinson et al., 1968
Gli studi che hanno portato alla
definizione di resistenza
Studi di genetica classica hanno evidenziato che la
percentuale di animali sensibili era
Dickinson et al., 1968
Gli studi che hanno portato alla
definizione di resistenza
Queste osservazioni, insieme al fatto che circa il 38% dei
figli SIP x resistenti, risulta SIP, ….
….sono compatibili con l’ipotesi che la scrapie sia
controllata da un gene associato a dominanza per
suscettibilità …..
che abbia una frequenza di circa il 20 % nella popolazione
fondatrice.
Dickinson et al., 1968
POLIMORFISMI DELL GENE DELLA
PROTEINA PRIONICA OVINA
Il gene che controlla la suscettibilità è stato
identificato con il gene che codifica la proteina
prionica. Una proteina che si accumula sottoforma di
fibrille negli animali malati.
Nelle pecore furono identificati 5 principali alleli
A136V R154H Q171R/H
ARQ
ARR
VRQ
AHQ
ARH
Gli studi che hanno portato alla
definizione di resistenza
Studio del rischio per genotipo nel Regno Unito dal 19982002 su 1500 casi di scrapie e 14000 controlli
Baylis et al., 2004
SUFFOLK
genotipo
ARQ/ARQ
ARQ/ARR
ARR/ARR
CHEVIOT
genotipo
VRQ/VRQ
VRQ/ARQ
VRQ/ARR
ARQ/ARQ
ARQ/ARR
ARR/ARR
Incidenza della scrapie
alta
molto bassa
resistenti
Incidenza della scrapie
molto alta
molto alta
bassa
bassa
molto bassa
resistenti
Gli studi che hanno portato alla
definizione di resistenza
•
L’influenza del genotipo alla resistenza alla scrapie si è resa
evidente, da tempo, nei primi esperimenti in cui
l’accoppiamento di animali che non sviluppavano la malattia
portava a progenie che non sviluppava malattia.
•
La scoperta del gene della proteina prionica e gli studi
patogenetici sulla scrapie hanno svelato il candidato per
spiegare l’influenza genetica a queste malattie. Il Gene che
codifica la proteina prionica.
•
Gli studi caso controllo, epidemiologici, di trasmissione
sperimentale con differenti ceppi di scrapie hanno indicato
l’allele ARR come fattore associato a resistenza alla scrapie.
GENOTIPO DELLA PrP IN PECORE DI RAZZA SARDA
SANE ED AFFETTE DA SCRAPIE
Affette da scrapie (n=33)
Sane
(n=79)
Affette da scrapie # (n=23)
100
80
%
60
40
20
0
ARQ/ARQ
ARQ/ARR
AHQ/ARQ
AHQ/ARR
# provenienti da greggi non correlati
ARR/ARR
G. Vaccari et al., Arch Virol 2001
GENOTIPO DELLA PrP IN PECORE DI RAZZA COMISANA
SANE ED AFFETTE DA SCRAPIE
100
Affette da scrapie (n=22)
Sane
(n=111)
80
%
60
40
20
0
ARQ/ARQ
ARQ/ARR ARR/ARR
VRQ/ARR AHQ/ARR AHQ/ARQ
Agrimi et al., Vet Res. Comm. 2003
Distribuzione dei Genotipi della
Proteina prionica in un focolaio di
scrapie
Elsen et al., 1999
POLIMORFISMI DELL GENE DELLA
PROTEINA PRIONICA OVINA
A136V R154H Q171R/H
P168L
R151C
M112T
ARQK
ARQK176
Q171K H180Y
H143R
G127V
A136T
L141F I142K
P241S
Q189L
N176K
R211Q
M137T
ARQ
AT137RQ
ARR
VRQ
AHQ
ARH
INFEZIONE PER VIA ORALE CON SCRAPIE
Razza Sarda
ARR/ARR
0/5
ARQ/ARR
0/14
ARQ/AK142RQ
0/1
ARQ/ARQK176
0/1
ARQ/AT137RQ
0/3
ARQ/ARH
0/3
ARQ/AHQ
5/5
ARQ/ARQ
5/5
0
500
1000
1500
2000
days post infection
Pre-clinical PrPSc
TIME POST
INFECTION
ARQ/ARQ
GALT
TISSUES
3 MONTHS
6 MONTHS
wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt
9 MONTHS
176 wt/wt wt/wt
N/K
12 MONTHS
16 MONTHS
20 MONTHS
142 wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt
I/K
137 wt/wt
M/T
+ + + + + + - + + - + + + + + + + - +
NON GALT
TISSUES
-
- - + -
-
- + + - + + + + + + + - +
CNS
-
- -
-
-
-
-
-
-
- + + + + + + + - +
G. Vaccari et al., J.Virol 2007
INFEZIONE PER VIA INTRA
CEREBRALE CON SCRAPIE
ARQK
ARQK176/ARR
ARQK
ARQK176/AHQ
ARQK
ARQK176/AT
/AT137RQ
ARR/ARR
ARH/ARR
AHQ/ARR
ARQ/ARR
AHQ/ARH
ARQ/ARH
AHQ/AHQ
ARQ/AHQ
ARQ/ARQ
0/2
0/1
0/1
0/5
0/1
0/1
1 / 13
3/3
1/1
1/1
5/5
5/5
300
800
1300
1800
2300
days post infection
G. Vaccari et al., J.Virol 2007
INFEZIONE PER VIA INTRA
CEREBRALE CON BSE E BASE
BSE
ARR/ARR
2/7
ARQ/ARR
0/5
ARQK176/AHQ
0/1
AT137RQ/AHQ
0/1
ARQ/AT137RQ
0/3
ARQ/ARQ
2/2
0
BASE
500
ARR/ARR
0/8
ARQ/ARR
4/7
AF141RQ/ARQK176
0/1
ARQ/ARQK176
0/1
ARQ/AT137RQ
0/2
ARQ/ARQ
1000
1500
1000
1500
8/8
0
500
d.p.i.
G. Vaccari et al., J.Virol 2007
GLI STUDI DI TRASMISSIONE
SPERIMENTALE
•
La via intracerebrale ha un efficienza maggiore di
quella orale.
•
Gli animali con l’allele ARR non sviluppano la malattia
dopo > 2000 gg dopo infezione Orale con scrapie ma
anche dopo infezione I.C.
•
Esiste un diveso targeting genetico a seconda del
ceppo di agente.
•
Gli alleli AT137RQ e ARQK176 conferiscono resistenza
all’infezione orale ma anche I.C. con scrapie, BSE e
BASE.
STUDI CASI CONTROLLO
•
Verificare se l’osservazione ottenuta dalla
sperimentazione si può osservare anche in condizioni
di campo.
•
Più focolai in Toscana dove la scrapie circola ormai
da tempo ed in cui la prevalenza della malattia
risultava elevata.
•
L’analisi si è concentrata sugli animali recanti il
genotipo ARQ/ARQ.
STUDI CASI CONTROLLO
Disegno dello studio
Animali
NellÕallevamento
Genotipizzati
Testati per TSE
Allevamenti
B
A
C
D
E
923 1774 570 3618 829
903 1707 566 1482 728
163 150 140 710 146
Totale
7714
5386
1309
Vaccari et al, Vet. Res.2009
STUDI CASI CONTROLLO
Disegno dello studio
60
A
50
B
C
D
E
40
30
20
10
A
A
R
R/
A
R
R
R
R/
A
RQ
AR
R
/A
R
H
AR
R/
A
H
Q
A
R
Q
/A
R
Q
AH
Q
/A
H
Q
A
RH
/A
R
Q
A
HQ
/A
RH
A
HQ
/A
RQ
AR
R/
VR
Q
A
R
Q
/V
R
Q
0
Genotipo PrP
Vaccari et al, Vet. Res.2009
STUDI CASI CONTROLLO
Risultati
Genotipo dei
Positivi
ARQ/ARQ
ARQ/AHQ
ARQ/ARR
TOTALE
A
B
Focolai
C
D
E
TOT.
23
2
32
1
50
6
10
9
25
33
56
154
20
1
175
ARQwt/ARQwt
100%
39
2
1
42
19
ARQ/ARQ con altri polimorfismi
NEGATIVI
POSITIVI
2 SCRAPIE
1 per
100%
22
3
39
75%
75%
54
49
40
50%
23
31
50%
39
48
54
7
25%
25%
59
36
18
7
0%
0%
A
B
C
D
A
E
Focolai
B
C
Focolai
D
E
Vaccari et al, Vet. Res.2009
STUDI CASI CONTROLLO
Risultati
Genotipo
ARQwt/ ARQwt
1
ARQwt /V127ARQ
ARQwt /AT137 RQ
1
2
1
1
1
7
10 14
10
13
3
8
13
16
ARQK176/XXX
4
A
0,00 [0,00; 0,94] *
0,00 [0,00; 2,38]
0,00 [0,00; 3,18]
B
0,00 [0,00; 0,33] *
0,11 [0,01; 0,82] *
0,00 [0,00; 0,29] *
C
0,00 [0,00; 0,04] *
0,06 [0,01; 0,47] *
0,00 [0,00; 0,03] *
D
0,00 [0,00; 0,56] *
0,00 [0,00; 0,46] *
0,00 [0,00; 0,22] *
E
0,00 [0,00; 0,68] *
0,26 [0,02; 1,63]
0,00 [0,00; 0,68] *
1
ARQwt /AR143RQ
6
ARQwt /ARQK 176
2
1
12 20
26
15
2
T 112ARQ/AT137 RQ
1
AT137RQ/AT137 RQ
AT137RQ/AF 141 RQ
1
AT137RQ/AR 143RQ
1
AT137RQ/ARQK 176
1
1
2
2
1
1
AF141RQ/V 127ARQ
1
1
AF141RQ/ARQK 176
1
1
ARQK176/ARQK 176
1
TOTAL
AF141RQ/XXX
1
ARQwt /AK142RQ
AF141RQ/AF 141 RQ
AT137RQ/XXX
1
ARQwt/ T112ARQ
ARQwt /AF141RQ
Odds ratio rispetto agli
ARQwt/ARQwt
Casi ARQ/ARQ
Controlli ARQ/ARQ
Allevamento
Allevamento
A B C D E A B C D E
23 31 48 39 7 54 36 7 59 18
1
1
23 32 50 39 10 76 75 47 113 67
Vaccari et al, Vet. Res.2009
STUDI CASI CONTROLLO
Conclusioni
•
L’effetto di protezione può essere osservato anche in
condizioni di campo laddove la pressione infettante è
elevata.
•
Forse non è un caso l’aver osservato queste
differenze proprio dove la scrapie è presente da più
tempo.
•
La mancanza degli omozigoti ci impedisce tuttavia di
avere informazioni del comportamento di questo
genotipo nei confronti della scrapie.
Rischio di scrapie per genotipo in Italia
755 Casi di scrapie dal 2004-2009
ARQwt/ARQwt utilizzatp come referenza.
*p<0,05; **p<0,001.
Ciaravino et al.,in preparation
Dominanza e Overdominanza
Il tempo di
incubazione è
controllato dal
genotipo al locus
PRNP e dal ceppo
dell’agente. E’ noto
che gli alleli murini si
possano comportare
come associati a
dominanza o a
overdominanza a
seconda dei ceppi di
prioni.
Dickinson and Fraser 1979
PMCA
•
Il PMCA è una tecnica che permette di trasformare la
PrPC in PrPSc utilizzando un inoculo infetto.
•
Replica PrPSc ma anche infettività
infettività.
•
Il PMCA replica fedelmente le caratteristiche di un
ceppo di TSE
•
Esperimenti relativamente veloci.
•
Meccanismo di trasformazione sconosciuto.
•
Può
Può il PMCA replicare in vitro la suscettibilità
suscettibilità genetica
degli ovini alla scrapie?
Protein Misfolding Cyclic
Amplification (PMCA)
PrPSc
+
Sonicazione
Incubazione
Sonicazione
Incubazione
PrPC
Soto et al. (2002) Trends Neurosci. 25:390-394
Disegno degli esperimenti di
PMCA
Inoculo:
Inoculo: un isolato di scrapie italiana già
già utilizzato negli studi di
trasmissione sperimentale in pecore
Substrati:
Substrati: omogenati cerebrali da pecore di
razza Sarda con i seguenti genotipi:
ARQ/ARQ
ARQ/AHQ
AHQ/ARH
ARQ/ARR
ARR/ARR
ARQ/AT
ARQ/AT137RQ
ARQ/ARQK
ARQ/ARQK176
ARQK
ARQK176/ARQK
/ARQK176
Risultati del PMCA
Fattore di
Amplificazione
9.9±
±2.8
9.9
9.9±2.8
Fattore di
Amplificazione
8.0±
±2.9
8.0
8.0±2.9
Fattore di
Amplificazione
3.6±
±2.0
3.6
3.6±2.0
Fattore di
Amplificazione
1.3±
±0.4
1.3
1.3±0.4
Risultati del PMCA
Fattore di
Amplificazione
1.3±
±0.3
1.3
1.3±0.3
Fattore di
Amplificazione
1.3±
±0.2
1.3
1.3±0.2
Fattore di
Amplificazione
1.9±
±1.3
1.9
1.9±1.3
Fattore di
Amplificazione
2.0±
±1.6
2.0
2.0±1.6
Survival time
Amplification factor
Confronto fattore di conversione in
vitro e tempi di incubazione in vivo
H
R
Q
R
6
6
RQ
AR
AH
AR AR
RQ
/
/
/
K 17
17
A
K
7
/
/
Q
Q
Q
Q
3
Q
1
R
Q
R
R
AH
AT
AR
AR
/A
AR
AR
/A
Q/
76
Q
R
1
A
AR
QK
AR
Fattore di ampliciazione dopo PMCA
(C. Bucalossi et al, in preparation)
Tempi di incubazione, trasmisisone scrapie IC (G. Vaccari et al., J. Virol 2007)
STUDI in vitro PMCA
Conclusioni
•
L’efficienza di conversione tramite PMCA sembra
essere genotipo specifica.
•
I risultati di efficienza di conversione correlano con i
dati osservati nelle infezioni sperimentali in vivo.
•
Gli animali omozigoti ARQK176/ARQK176 mostrano
efficienza di conversione paragonabile agli ARR/ARR.
POLIMORFISMI DELL GENE DELLA
PROTEINA PRIONICA CAPRINA
N146S/D
I142M
R154H
R151H
T110P
W18R
V21A G37V
L23P
G49S
R211Q
P168Q
H143R
T194P
G127S
L133Q
Q222K
I142TF
G232W
Q220H
R211G
M137I
S240P
I142M ASSOCIATO A PROTEZIONE
DA SCRAPIE
Goldmann et al., 1996
La metionina al codone (I142) è stata associata ad un
tempo di incubazione maggiore in un esperimento
trasmissione sperimentale con differenti isolati di TSE.
Vari eterozigoti un solo omozigote, tutti suscettibili
N146S/D ASSOCIATO A
PROTEZIONE DA SCRAPIE
Papasavva-Stylianou et al., 2007
Papasavva-Stylianou et al., 2010
La Serina o l’
l’acido aspartico al codone (S146, D146)
sono stati associati a protezione alla scrapie in studi
caso controllo, a Cipro in due lavori successivi, esistono
degli eterozigoti affetti da scrapie.
Nei controlli negativi molti eterozigoti, pochi omozigoti
R154H ASSOCIATO A PROTEZIONE
DA SCRAPIE
L’ Istidina al codone (H154) è stata associata in studi
caso controllo a protezione alla scrapie.
Barillet et al., 2009
Billinis et al., 2002
In altri studi tuttavia la protezione non è stata osservata e
vari casi di scrapie con 154 H/R sono stati riscontrati.
R154H, R211Q ASSOCIATO A
PROTEZIONE DA SCRAPIE
La glutammina al codone 211 (Q211) è stata
associata in uno studio caso controllo a protezione
alla scrapie.
Allele poco presente in altre razze
Studi di trasmissione sperimentale in corso
Barillet et al., 2009
Q222K ASSOCIATO A PROTEZIONE
DA SCRAPIE
La lisina al codone (K222) è stata associata in tre
indipendenti studi casi controllo a protezione alla
scrapie.
Vari eterozigoti nessun eterozigote
Studi di trasmissione sperimentale in corso
Acutis et al., 2006
In quest’ultimo lavoro un
caso di scrapie è stato
osservato in un animale
eterozigote Q/K 222
Vaccari et al., 2006
Barillet et al., 2009
Quali alleli utilizzare?
Alleli che mostrino protezione degli animali sia
eterozigoti che in omozigoti
Associati a resistenza nei confronti di differenti
ceppi di scrapie
Gli animali eterozigoti od omozigoti non
agiscano da portatori sani della malattia.
Aspetti importanti per la valutazione di
alleli candidati alla resistenza alle TSE
•
Verificare e misurare il livello di resistenza associato
con un determinato allele.
•
Accertarne l’influenza nella patogenesi e nella
distribuzione dell’agente delle TSE nell’organismo.
•
Verificare il ruolo epidemiologico degli animali recanti
l’allele nel mantenimento dell’infezione in un gregge
in condizioni naturali.
SELEZIONE GENETICA
NUOVI SCENARI E INTERROGATIVI
Pecore
L’associazione del allele ARR alla resistenza risulta ormai consolidata
La nomenclatura ai 3 codoni nasconde un’ampia variabilita del gene
della PrP ed alcuni alleli potrebbero avere una rilevante influenza
sulla suscettibilità (AT137RQ, ARQK176)
Ulteriori studi sono necessari per capire meglio il ruolo dei candidati
alleli resistenti anche nei confronti di altri ceppi in altre razze e regioni
La possibilità di avere ulteriori alleli resistenti potrebbe essere utile
nell’eventualità di emersione di nuovi ceppi di agente e mantenimento
di maggiore biodiversità
SELEZIONE GENETICA
NUOVI SCENARI E INTERROGATIVI
Capre
Nelle capre siamo agli inizi delle indagini per l’identificazione di
alleli associati alla resistenza.
Alcuni alleli sono molto rari ma la loro influenza sulla
suscettibilità può essere rilevante (K222, D146, S146)
Ulteriori studi sono necessari per capire meglio il ruolo dei
candidati alleli resistenti anche nei confronti di altri ceppi in altre
razze e regioni
L’esistenza di alleli resistenti anche nelle capre potrebbe
risolvere il problema della scrapie in questa specie e far si che i
caprini non diventino una possibile specie serbatoio per la
scrapie.
ISS (I) U. Agrimi
R. Nonno, G. Vaccari
M. Di Bari, GM Cosseddu,
G.Scavia, L. Morelli, B.
Chiappini, C.D’Agostino, L.
Pirisinu, C. Bucalossi, G.
Ciaravino, G. Antonucci,
Fazzi, E. Esposito, M.
Conte, S. Marcon, C.
Parisi, N.Palazzini, S.
Simson, P. Frassanito
Collaborations:
ISS (I) M. Pocchiari, F. Cardone
VLA (UK) O. Windl, M. Jeffrey, L. Gonzalez
LMU (D) H.A. Kretzschmar, U. Bertsch
UZH (CH) H-P. Lipp, G. Dell’Omo
IAH (UK)M. Bruce
AFSSA (F) T. Baron
INRA (F) H. Laude
INIA (E) J.M. Torres
FLI (D) M. Groschup
TSRI (USA) J. Castilla
UTMB (USA) C. Soto
CEA (I) M. Caramelli
IZSLT (I) L. De Grossi