Dosaggio CEDIA® per l’acido valproico II Per uso diagnostico in vitro 100013 (Kit da 13 mL, 11 mL) Avvertenze e precauzioni Uso previsto Il dosaggio CEDIA® per l’acido valproico II è uno strumento diagnostico in vitro previsto per la determinazione quantitativa dell’acido valproico nel siero o nel plasma umani. Sommario e spiegazione del metodo L’acido valproico (VPA; acido 2-propilpentanoico; Depakene®) è un farmaco anticonvulsivante prevalentemente usato per il trattamento delle crisi epilettiche generalizzate primarie e secondarie, efficace anche contro le crisi da assenza.1-5 Alle concentrazioni terapeutiche, più del 90% del VPA in circolo si lega alle proteine plasmatiche e in special modo all’albumina.6 Il VPA è il farmaco antiepilettico, tra quelli più comunemente usati, con il minor numero di effetti indesiderati.7,8 Gli effetti collaterali più comuni sono i disturbi gastrointestinali come la nausea e il vomito. La farmacocinetica del VPA è altamente variabile, a seconda della forma del farmaco e della via di somministrazione, nonché delle variazioni individuali per quanto riguarda il volume della distribuzione, il metabolismo e la clearance.9,10 Il monitoraggio delle concentrazioni di VPA nel corso della terapia è essenziale per fornire al medico un indicatore utile nella regolazione del dosaggio. Il dosaggio CEDIA per l’acido valproico II è un immunodosaggio enzimatico omogeneo che si avvale della tecnologia del DNA ricombinante (brevetto USA n. 4708929).11 Il dosaggio è basato sull’enzima batterico -galattosidasi, geneticamente suddiviso in due frammenti inattivi: l’accettore enzimatico (EA) e il donatore enzimatico (ED). Questi frammenti si riassociano spontaneamente per formare un enzima pienamente attivo in grado di legarsi, nel formato del dosaggio, ad un substrato, dando luogo ad una variazione cromatica misurabile spettrofotometricamente. Nel dosaggio, l’analita presente nel campione compete con l’analita coniugato al frammento inattivo di -galattosidasi per il sito di legame anticorpale. Se l’analita è presente nel campione, si lega all’anticorpo, lasciando i frammenti enzimatici inattivi liberi di formare l’enzima attivo. Se l’analita non è presente nel campione, l’anticorpo si lega all’analita coniugato sul frammento inattivo, inibendo la riassociazione dei frammenti inattivi di -galattosidasi, e quindi la formazione dell’enzima attivo. La quantità di enzima attivo formata e la risultante variazione di assorbanza sono direttamente proporzionali alla quantità di sostanza presente nel campione. Reagenti 1 Tampone di ricostituzione per EA: contiene N-[2-idrossietil] piperazina-N’-[acido 2-etanosulfonico], stabilizzante e conservante (13 mL). 1aReagente EA: contiene 0,25 g/L di accettore enzimatico, 24 mg/L di anticorpo monoclonale anti-VPA, BSA, salicilato di sodio, sali tampone e conservante. 2 Tampone di ricostituzione per ED: contiene N-[2-idrossietil] piperazina-N’-[acido 2-etanosulfonico], stabilizzanti e conservante (11 mL). 2aReagente ED: contiene 40 µg/L di donatore enzimatico coniugato con VPA, 2,4 g/L di rosso di clorofenolo- -D-galattopiranoside, 27 ml/L di anticorpi di capra anti-topo, sali tampone, stabilizzante e conservante. Ulteriori materiali necessari (venduti separatamente) 100007 Descrizione del kit CEDIA Core TDM Multi-Cal Controlli commerciali - Per consigli su quali controlli utilizzare, rivolgersi al servizio di assistenza tecnica I reagenti contengono azoturo di sodio. Evitarne il contatto con la pelle e le mucose. In caso di contatto, sciacquare le aree interessate con abbondanti quantità di acqua. In caso di contatto con gli occhi o di ingestione, rivolgersi immediatamente a un medico. L’azoturo di sodio può reagire con il rame o il piombo delle tubature di scarico generando azidi metallici potenzialmente esplosivi. Per lo smaltimento dei reagenti, usare abbondanti quantità di acqua per evitare l’accumulo di azidi metallici. Pulire le superfici metalliche esposte con idrossido di sodio al 10%. Preparazione e conservazione dei reagenti Estrarre il kit dal frigorifero appena prima della preparazione delle soluzioni. Preparare le soluzioni nel seguente ordine per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione. Soluzione R2 di donatore enzimatico: collegare il flacone 2a (reagente per ED) al flacone 2 (tampone di ricostituzione per ED) usando uno degli adattatori forniti. Mescolare capovolgendo delicatamente, assicurandosi che tutto il materiale liofilizzato del flacone 2a si trasferisca nel flacone 2. Evitare la formazione di schiuma. Staccare il flacone 2a e l’adattatore dal flacone 2 e gettarli. Tappare il flacone 2 e lasciarlo riposare per circa 5 minuti a 15-25°C. Mescolare nuovamente. Annotare la data di ricostituzione sull’etichetta del flacone. Introdurre il flacone direttamente nello scomparto dei reagenti dell’analizzatore o nel frigorifero e lasciarlo riposare per 30 minuti prima dell’uso. Soluzione R1 di accettore enzimatico: collegare il flacone 1a (reagente per EA) al flacone 1 (tampone di ricostituzione per EA) usando uno degli adattatori forniti. Mescolare capovolgendo delicatamente, assicurandosi che tutto il materiale liofilizzato del flacone 1a si trasferisca nel flacone 1. Evitare la formazione di schiuma. Staccare il flacone 1a e l’adattatore dal flacone 1 e gettarli. Tappare il flacone 1 e lasciarlo riposare per circa 5 minuti a 15-25°C. Mescolare nuovamente. Annotare la data di ricostituzione sull’etichetta del flacone. Introdurre il flacone direttamente nello scomparto dei reagenti dell’analizzatore o nel frigorifero e lasciarlo riposare per 30 minuti prima dell’uso. NOTA 1: i componenti forniti in questo kit sono previsti per l’uso concomitante. Non mescolare tra loro componenti di lotti diversi. NOTA 2: per evitare la contaminazione crociata dei reagenti, non scambiare tra loro i tappi dei diversi flaconi. La soluzione R2 (donatore enzimatico) deve essere di colore giallo arancio. La comparsa di un colore rosso o rosso porpora indica la contaminazione del reagente, che va quindi eliminato. NOTA 3: prima dell’esecuzione del dosaggio, le soluzioni R1 e R2 vanno portate alla temperatura dello scomparto dei reagenti dell’analizzatore. Per ulteriori informazioni, consultare il foglio delle applicazioni relativo all’analizzatore in dotazione. NOTA 4: per garantire la stabilità della soluzione EA ricostituita, non esporla per un periodo prolungato all’azione diretta di forti sorgenti luminose. Conservare i reagenti a 2-8°C. NON CONGELARLI. Per il periodo di stabilità dei componenti non aperti, vedere la data di scadenza sulla confezione o sulle etichette dei flaconi. Soluzione R1: 45 giorni nello scomparto refrigerato dell’analizzatore oppure in frigorifero a 2-8°C. Soluzione R2: 45 giorni nello scomparto refrigerato dell’analizzatore oppure in frigorifero a 2-8°C. Raccolta e trattamento del campione Campioni di siero o plasma (trattati con Na o Li eparina, o Na EDTA) sono idonei per l’uso con il dosaggio. Non provocare la formazione di schiuma ed evitare di congelare e scongelare ripetutamente per mantenere l’integrità del campione dal momento in cui viene prelevato fino al momento dell’analisi. Centrifugare i campioni che contengono sostanze particolate. Tappare i campioni, conservarli a 2-8°C e analizzarli entro una settimana dalla raccolta. Se l’analisi non può essere eseguita entro una settimana o se il campione va spedito, tapparlo e mantenerlo congelato. Conservare i campioni a -20°C e analizzarli entro 4 settimane. Trattare tutti i campioni dei pazienti come se fossero potenzialmente infettivi. Procedura di analisi Ai fini del presente dosaggio è possibile utilizzare gli analizzatori chimici in grado di mantenere una temperatura costante, pipettare i campioni, miscelare i reagenti, misurare i tassi enzimatici e regolare con precisione i tempi di reazione. Fogli delle applicazioni riportanti i parametri specifici per ciascun analizzatore sono disponibili presso la Microgenics, che fa parte della Thermo Fisher Scientific. NOTA: se l’analizzatore non riesce a leggere il codice a barre, la sequenza numerica dell’etichetta con codice a barre può essere immessa manualmente dalla tastiera. Controllo di qualità e calibrazione12 • • • Si consiglia di eseguire la calibrazione a due punti prima di usare nuovi flaconi di reagenti prima di usare un nuovo lotto di reagenti come necessario, in ottemperanza alle procedure di controllo della qualità Una buona prassi di laboratorio prevede l’analisi di almeno due livelli (punti di decisione medici alto e basso) di controllo della qualità ogni giorno in cui si esegue l’analisi dei campioni dei pazienti e ad ogni calibrazione. Monitorare i valori di controllo per individuare eventuali tendenze o deviazioni. Se si individuano tendenze o deviazioni, o se il controllo non recupera una quantità di farmaco entro il range specificato, esaminare tutti i parametri operativi. Per ulteriore assistenza, rivolgersi al servizio di assistenza tecnica. Tutti i requisiti di controllo della qualità vanno soddisfatti in conformità alle normative vigenti o ai requisiti per l’accreditamento. Linearità Un campione alto è stato diluito con il calibratore basso Core TDM Multi-Cal. La percentuale di recupero è stata poi determinata dividendo il valore osservato per il valore atteso. % Campione Alto Valore Atteso (μg/mL) 100,0 130,1 - - 83,3 108,3 112,7 104 66,7 86,7 87,5 101 50,0 65,0 67,4 104 33,3 43,3 43,3 100 16,7 21,7 20,9 96 0,0 0 - - Risultati e valori attesi Il dosaggio CEDIA per l’acido valproico II è indicato per la quantitazione di campioni di pazienti con valori compresi tra 3 µg/mL e il valore del calibratore alto Core TDM Multi-Cal (circa 150 µg/mL). I risultati dei campioni inferiori a 3 µg/mL vanno refertati come < 3 µg/mL. I campioni con quantitazione superiore a 150 µg/mL possono essere refertati come > 150 µg/mL; in alternativa, diluire una parte di campione con una parte di calibratore basso Core TDM MultiCal e rianalizzare. Il valore ottenuto da questa nuova analisi deve essere derivato secondo la formula seguente. Valore effettivo = (2 x valore diluito) - conc. del calibratore basso Core TDM Multi-Cal % Recupero Recupero Ad un campione di paziente basso è stato aggiunto acido valproico sotto forma di un campione di paziente alto (corretto). La percentuale di recupero è stata poi determinata dividendo il valore osservato per il valore atteso. Utilizzare il seguente fattore di conversione per convertire µg/ml in µmol/L: µg/mL x 6,93 = µmol/L µmol/L x 0,144 = µg/mL % Campione Alto L’efficacia terapeutica e gli effetti tossici sono strettamente correlati alla concentrazione sierica del farmaco. La concentrazione effettiva del VPA nel siero per il controllo delle crisi epilettiche è stata riportata nell’intervallo 50-100 µg/mL.13-15 È tuttavia possibile che una serie di fattori possa rendere più complessa l’interpretazione dei livelli sierici di VPA,3 incluso l’intervallo di tempo tra le somministrazioni del farmaco, il tipo di crisi, la concentrazione di albumina e la presenza di altri farmaci antiepilettici. Le regolazioni della dose del farmaco vanno quindi basate sia su dati clinici che di laboratorio. Limitazioni 1. L’incidenza di pazienti con anticorpi all’E. coli -galattosidasi è estremamente bassa. Tuttavia, alcuni campioni che contengono questi anticorpi possono dare risultati di procainamide artificialmente elevati che non rientrano nel profilo clinico. 2. Come con qualsiasi dosaggio che impiega anticorpi murini, esiste la possibilità che gli anticorpi umani anti-murini (HAMA) interferiscano nel campione, generando risultati falsamente elevati. Valore Atteso (μg/mL) Valore Analizzato (μg/mL) % Recupero 100,0 141,1 - - 83,3 117,7 116,0 99 66,7 94,2 93,0 99 50,0 70,7 67,3 95 33,3 47,1 44,2 94 16,7 23,6 21,6 92 0,0 0,1 - - Specificità I seguenti composti sono stati testati per reattività crociata con il dosaggio CEDIA per acido valproico II. Caratteristiche specifiche del rendimento del test Le caratteristiche di rendimento del test tipiche ottenibili mediante l’analizzatore Hitachi 911 sono riportate qui di seguito.16 I valori ottenuti nei diversi laboratori possono essere differenti da quelli riportati in questa sede. Composto Precisione Sieri di controllo e pool di sangue umano sono stati analizzati per valutare la precisione su un analizzatore Hitachi in base alle direttive della prova di replicazione NCCLS modificata. Sono stati ottenuti i seguenti risultati: Precisione all’interno della serie Valore Analizzato (μg/mL) Reattività crociata % Acido 3-idrossi-2-propilpentanoico 4,4 Acido 4-idrossi-2-propilpentanoico 4,4 Acido 5-idrossi-2-propilpentanoico 5,8 Acido 3-oxo-2-propilpentanoico 3,8 Precisione Totale 2-fenil-2-etilmalonammide (PEMA) Acido 2-propil-2,3’-pentadienoico < 0,16 14,2 n 120 120 119 120 120 119 x- (μg/mL) 24,4 95,0 136,8 24,4 95,0 136,8 Acido 2-propil-2-pentanoico 1,0 Acido 2-propil-4-pentanoico 22,3 Acido 2-propil-glutarico < 0,4 Acido 2-propilsuccinico < 0,9 SD (μg/mL) CV % 0,59 1,43 1,81 0,83 1,93 2,48 2,4 1,5 1,3 3,4 2,0 1,8 Confronto tra metodi Un confronto tra il dosaggio CEDIA per il VPA (y) e un’analisi immunologica a polarizzazione di fluorescenza (x) disponibile in commercio ha dato la seguente correlazione. Regressione lineare y = -0,61 + 1,08x r = 0,972 Sy.x = 7,042 Carbamazepina Passing e Bablok y = -3,22 + 1,10x r = 0,972 SD (md95) = 4,442 Numero di campioni misurati: 77 Le concentrazioni dei campioni erano comprese tra 2,6 e 119,8 µg/mL. < 0,04 Carbamazepina-10,11-epossido < 0,9 Clonazepam < 0,3 Diazepam < 0,3 Fenobarbitale < 0,06 Fenitoina < 0,04 Primidone < 1,0 Acido salicilico < 0,004 Non è stata rilevata alcuna interferenza nel dosaggio CEDIA per il VPA con le seguenti sostanze. Sostanza Bilirubina Emoglobina 2 Concentrazione < 60 mg/dL < 1,0 g/dL IgA < 790 mg/dL IgG < 4,3 g/dL Sostanza Concentrazione IgM < 840 mg/dL Fattore reumatoide < 200 IU/mL Proteine totali < 10 g/dL Trigliceridi < 1,0 g/dL Sensibilità La concentrazione rilevabile minima del dosaggio CEDIA per il VPA è pari a 3,0 µg/mL (20,8 µmol/L). Bibliografia 1. Chadwick D. Comparison of monotherapy with valproate and other antiepileptic drugs in the treatment of seizure disorders. Am. J. Med. 1988; 84 (Suppl 1A): 3-6. 2. Wallace SJ. Use of ethosuximide and valproate in the treatment of epilepsy. Neurol. Clin. 1986; 4: 601-616. 3. Rimmer EM, Richens A. An update on sodium valproate. Pharmacotherapy 1985; 5: 171-184. 4. Gram L, Bentsen KD. Valproate: an updated review. Acta. Neurol. Scand. 1985; 72: 129-139. 5. Clancy RR. New anticonvulsants in pediatrics: Carbamazepine and valproate. Curr. Probl. Pediatr. 1987; 17: 133-209. 6. Gugler R, Mueller G. Plasma protein binding of valproic acid in healthy subjects and in patients with renal disease. Br. J. Clin. Pharmacol. 1978; 5: 441-446. 7. Dreifuss FE, Langer DH. Side effects of valproate. Am.J. Med. 1988; 84 (Suppl 1A): 34-41. 8. Schmidt D. Adverse effects of valproate. Epilepsia 1984; 25 (Suppl. 1): S44-S49. 9. Miners JO. Drug interactions involving aspirin (acetylsalicylic acid) and salicylic acid. Clin. Pharmacokinet. 1989; 17: 327-344. 10.Zaccara G, Messori A, Moroni F. (1988) Clinical pharmacokinetics of valproic acid. Clin. Pharmacokinet. 1988; 15: 367-389. 11.Henderson DR, Friedman SB, Harris JD, Manning WB, Zoccoli MA.CEDIA, a New Homogeneous Immunoassay System. Clin. Chem. 1986; 32: 1637-1641. 12.Dati sulla tracciabilità sono disponibili presso la Microgenics Corporation, che fa parte della Thermo Fisher Scientific. 13.Schobben F, van der Kleijn E, Gabreëls FJM. Pharmacokinetics of di-N-propylacetate in epileptic patients. Europ. J. Clin. Pharmacol. 1975; 8: 97-105. 14.Cloyd JC, Leppik IE. Valproic acid: therapeutic use and serum concentration monitoring. In: Taylor WJ, Finn AL, eds. Individualizing Drug Therapy: Practical Applications of Drug Monitoring New York: Gross, Townsend, Frank, Inc., 1981: 87-108. 15.Turnbull DM, Rawlins MD, Weightman E, Chadwick DW. Plasma concentrations of sodium valproate: Their clinical value. Ann. Neurol. 1983; 14: 38-42. 16.Dati disponibili presso la Microgenics Corporation, che fa parte della Thermo Fisher Scientific. Microgenics Corporation 46360 Fremont Blvd. Fremont, CA 94538-6406 USA Assistenza tecnica e assistenza alla clientela negli USA: 1-800-232-3342 Per gli aggiornamenti del foglietto illustrativo, visitare: www.thermoscientific.com Altri Paesi: Consultare il rappresentante Thermo Fisher Scientific di zona. Depakene è un marchio depositato della Abbott Laboratories. CEDIA è un marchio registrato della Roche Diagnostics. 10003778-3 2011 01 3 Microgenics GmbH Spitalhofstrasse 94 D-94032 Passau Germany Tel: +49 (0) 851-88 68 90 Fax: +49 (0) 851-88 68 910