Dosaggio CEDIA® per l`acido valproico II

Dosaggio CEDIA® per l’acido valproico II
Per uso diagnostico in vitro
100013 (Kit da 13 mL, 11 mL)
Uso previsto
Il dosaggio CEDIA® per l’acido valproico II è uno strumento diagnostico in vitro previsto per la
determinazione quantitativa dell’acido valproico nel siero o nel plasma umani.
Sommario e spiegazione del metodo
L’acido valproico (VPA; acido 2-propilpentanoico; Depakene®) è un farmaco anticonvulsivante
prevalentemente usato per il trattamento delle crisi epilettiche generalizzate primarie e
secondarie, efficace anche contro le crisi da assenza.1-5
Alle concentrazioni terapeutiche, più del 90% del VPA in circolo si lega alle proteine plasmatiche
e in special modo all’albumina.6
Il VPA è il farmaco antiepilettico, tra quelli più comunemente usati, con il minor numero di effetti
indesiderati.7,8 Gli effetti collaterali più comuni sono i disturbi gastrointestinali come la nausea
e il vomito.
La farmacocinetica del VPA è altamente variabile, a seconda della forma del farmaco e della
via di somministrazione, nonché delle variazioni individuali per quanto riguarda il volume della
distribuzione, il metabolismo e la clearance.9,10 Il monitoraggio delle concentrazioni di VPA nel
corso della terapia è essenziale per fornire al medico un indicatore utile nella regolazione del
dosaggio.
Il dosaggio CEDIA per l’acido valproico II è un immunodosaggio enzimatico omogeneo che si
avvale della tecnologia del DNA ricombinante (brevetto USA n. 4708929).11
Il dosaggio è basato sull’enzima batterico -galattosidasi, geneticamente suddiviso in due
frammenti inattivi: l’accettore enzimatico (EA) e il donatore enzimatico (ED). Questi frammenti
si riassociano spontaneamente per formare un enzima pienamente attivo in grado di legarsi,
nel formato del dosaggio, ad un substrato, dando luogo ad una variazione cromatica misurabile
spettrofotometricamente.
Nel dosaggio, l’analita presente nel campione compete con l’analita coniugato al frammento
inattivo di -galattosidasi per il sito di legame anticorpale. Se l’analita è presente nel campione,
si lega all’anticorpo, lasciando i frammenti enzimatici inattivi liberi di formare l’enzima attivo. Se
l’analita non è presente nel campione, l’anticorpo si lega all’analita coniugato sul frammento
inattivo, inibendo la riassociazione dei frammenti inattivi di -galattosidasi, e quindi la
formazione dell’enzima attivo. La quantità di enzima attivo formata e la risultante variazione di
assorbanza sono direttamente proporzionali alla quantità di sostanza presente nel campione.
Reagenti
1 Tampone di ricostituzione per EA: contiene N-[2-idrossietil] piperazina-N’-[acido
2-etanosulfonico], stabilizzante e conservante (13 mL).
1aReagente EA: contiene 0,25 g/L di accettore enzimatico, 24 mg/L di anticorpo
monoclonale anti-VPA, BSA, salicilato di sodio, sali tampone e conservante.
2 Tampone di ricostituzione per ED: contiene N-[2-idrossietil] piperazina-N’-[acido
2-etanosulfonico], stabilizzanti e conservante (11 mL).
2aReagente ED: contiene 40 µg/L di donatore enzimatico coniugato con VPA, 2,4 g/L di
rosso di clorofenolo- -D-galattopiranoside, 27 ml/L di anticorpi di capra anti-topo, sali
tampone, stabilizzante e conservante.
Ulteriori materiali necessari (venduti separatamente)
100007
Descrizione del kit
CEDIA Core TDM Multi-Cal
Controlli commerciali
- Per consigli su quali controlli utilizzare, rivolgersi al servizio di assistenza tecnica
Avvertenze e precauzioni
I reagenti contengono azoturo di sodio. Evitarne il contatto con la pelle e le mucose. In caso di
contatto, sciacquare le aree interessate con abbondanti quantità di acqua. In caso di contatto
con gli occhi o di ingestione, rivolgersi immediatamente a un medico. L’azoturo di sodio può
reagire con il rame o il piombo delle tubature di scarico generando azidi metallici potenzialmente
esplosivi. Per lo smaltimento dei reagenti, usare abbondanti quantità di acqua per evitare
l’accumulo di azidi metallici. Pulire le superfici metalliche esposte con idrossido di sodio al 10%.
Preparazione e conservazione dei reagenti
Estrarre il kit dal frigorifero appena prima della preparazione delle soluzioni.
Preparare le soluzioni nel seguente ordine per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione.
Soluzione R2 di donatore enzimatico: collegare il flacone 2a (reagente per ED) al flacone 2
(tampone di ricostituzione per ED) usando uno degli adattatori forniti. Mescolare capovolgendo
delicatamente, assicurandosi che tutto il materiale liofilizzato del flacone 2a si trasferisca nel
flacone 2. Evitare la formazione di schiuma. Staccare il flacone 2a e l’adattatore dal flacone
2 e gettarli. Tappare il flacone 2 e lasciarlo riposare per circa 5 minuti a 15-25°C. Mescolare
nuovamente. Annotare la data di ricostituzione sull’etichetta del flacone. Introdurre il flacone
direttamente nello scomparto dei reagenti dell’analizzatore o nel frigorifero e lasciarlo riposare
per 30 minuti prima dell’uso.
Soluzione R1 di accettore enzimatico: collegare il flacone 1a (reagente per EA) al flacone 1
(tampone di ricostituzione per EA) usando uno degli adattatori forniti. Mescolare capovolgendo
delicatamente, assicurandosi che tutto il materiale liofilizzato del flacone 1a si trasferisca nel
flacone 1. Evitare la formazione di schiuma. Staccare il flacone 1a e l’adattatore dal flacone
1 e gettarli. Tappare il flacone 1 e lasciarlo riposare per circa 5 minuti a 15-25°C. Mescolare
nuovamente. Annotare la data di ricostituzione sull’etichetta del flacone. Introdurre il flacone
direttamente nello scomparto dei reagenti dell’analizzatore o nel frigorifero e lasciarlo riposare
per 30 minuti prima dell’uso.
NOTA 1: i componenti forniti in questo kit sono previsti per l’uso concomitante. Non mescolare
tra loro componenti di lotti diversi.
NOTA 2: per evitare la contaminazione crociata dei reagenti, non scambiare tra loro i tappi dei
diversi flaconi. La soluzione R2 (donatore enzimatico) deve essere di colore giallo arancio. La
comparsa di un colore rosso o rosso porpora indica la contaminazione del reagente, che va
quindi eliminato.
NOTA 3: prima dell’esecuzione del dosaggio, le soluzioni R1 e R2 vanno portate alla temperatura
dello scomparto dei reagenti dell’analizzatore. Per ulteriori informazioni, consultare il foglio delle
applicazioni relativo all’analizzatore in dotazione.
NOTA 4: per garantire la stabilità della soluzione EA ricostituita, non esporla per un periodo
prolungato all’azione diretta di forti sorgenti luminose.
Conservare i reagenti a 2-8°C. NON CONGELARLI. Per il periodo di stabilità dei componenti non
aperti, vedere la data di scadenza sulla confezione o sulle etichette dei flaconi.
Soluzione R1: 45 giorni nello scomparto refrigerato dell’analizzatore oppure in frigorifero a 2-8°C.
Soluzione R2: 45 giorni nello scomparto refrigerato dell’analizzatore oppure in frigorifero a 2-8°C.
Raccolta e trattamento del campione
Campioni di siero o plasma (trattati con Na o Li eparina, o Na EDTA) sono idonei per l’uso con
il dosaggio. Non provocare la formazione di schiuma ed evitare di congelare e scongelare
ripetutamente per mantenere l’integrità del campione dal momento in cui viene prelevato fino
al momento dell’analisi. Centrifugare i campioni che contengono sostanze particolate. Tappare
i campioni, conservarli a 2-8°C e analizzarli entro una settimana dalla raccolta. Se l’analisi non
può essere eseguita entro una settimana o se il campione va spedito, tapparlo e mantenerlo
congelato. Conservare i campioni a -20°C e analizzarli entro 4 settimane. Trattare tutti i campioni
dei pazienti come se fossero potenzialmente infettivi.
Procedura di analisi
Ai fini del presente dosaggio è possibile utilizzare gli analizzatori chimici in grado di mantenere
una temperatura costante, pipettare i campioni, miscelare i reagenti, misurare i tassi enzimatici
e regolare con precisione i tempi di reazione. Fogli delle applicazioni riportanti i parametri
specifici per ciascun analizzatore sono disponibili presso la Microgenics, che fa parte della
Thermo Fisher Scientific.
NOTA: se l’analizzatore non riesce a leggere il codice a barre, la sequenza numerica dell’etichetta
con codice a barre può essere immessa manualmente dalla tastiera.
Controllo di qualità e calibrazione12
•
•
•
Si consiglia di eseguire la calibrazione a due punti
prima di usare nuovi flaconi di reagenti
prima di usare un nuovo lotto di reagenti
come necessario, in ottemperanza alle procedure di controllo della qualità
Una buona prassi di laboratorio prevede l’analisi di almeno due livelli (punti di decisione
medici alto e basso) di controllo della qualità ogni giorno in cui si esegue l’analisi dei campioni
dei pazienti e ad ogni calibrazione. Monitorare i valori di controllo per individuare eventuali
tendenze o deviazioni. Se si individuano tendenze o deviazioni, o se il controllo non recupera
una quantità di farmaco entro il range specificato, esaminare tutti i parametri operativi. Per
ulteriore assistenza, rivolgersi al servizio di assistenza tecnica. Tutti i requisiti di controllo della
qualità vanno soddisfatti in conformità alle normative vigenti o ai requisiti per l’accreditamento.
Risultati e valori attesi
Recupero
Ad un campione di paziente basso è stato aggiunto acido valproico sotto forma di un campione
di paziente alto (corretto). La percentuale di recupero è stata poi determinata dividendo il valore
osservato per il valore atteso.
Il dosaggio CEDIA per l’acido valproico II è indicato per la quantitazione di campioni di pazienti
con valori compresi tra 3 µg/mL e il valore del calibratore alto Core TDM Multi-Cal (circa
150 µg/mL). I risultati dei campioni inferiori a 3 µg/mL vanno refertati come < 3 µg/mL. I campioni
con quantitazione superiore a 150 µg/mL possono essere refertati come > 150 µg/mL; in
alternativa, diluire una parte di campione con una parte di calibratore basso Core TDM MultiCal e rianalizzare. Il valore ottenuto da questa nuova analisi deve essere derivato secondo la
formula seguente.
% Campione Alto
Valore Atteso
(μg/mL)
Valore Analizzato
(μg/mL)
% Recupero
100,0
141,1
-
-
Valore effettivo = (2 x valore diluito) - conc. del calibratore basso Core TDM Multi-Cal
83,3
117,7
116,0
99
Utilizzare il seguente fattore di conversione per convertire µg/ml in µmol/L:
66,7
94,2
93,0
99
50,0
70,7
67,3
95
33,3
47,1
44,2
94
16,7
23,6
21,6
92
0,0
0,1
-
-
µg/mL x 6,93 = µmol/L
µmol/L x 0,144 = µg/mL
L’efficacia terapeutica e gli effetti tossici sono strettamente correlati alla concentrazione sierica
del farmaco. La concentrazione effettiva del VPA nel siero per il controllo delle crisi epilettiche è
stata riportata nell’intervallo 50-100 µg/mL.13-15 È tuttavia possibile che una serie di fattori possa
rendere più complessa l’interpretazione dei livelli sierici di VPA,3 incluso l’intervallo di tempo tra
le somministrazioni del farmaco, il tipo di crisi, la concentrazione di albumina e la presenza di
altri farmaci antiepilettici. Le regolazioni della dose del farmaco vanno quindi basate sia su dati
clinici che di laboratorio.
Specificità
I seguenti composti sono stati testati per reattività crociata con il dosaggio CEDIA per acido
valproico II.
Composto
Limitazioni
1. L’incidenza di pazienti con anticorpi all’E. coli -galattosidasi è estremamente bassa.
Tuttavia, alcuni campioni che contengono questi anticorpi possono dare risultati di
procainamide artificialmente elevati che non rientrano nel profilo clinico.
2. Come con qualsiasi dosaggio che impiega anticorpi murini, esiste la possibilità che gli
anticorpi umani anti-murini (HAMA) interferiscano nel campione, generando risultati
falsamente elevati.
Precisione
Sieri di controllo e pool di sangue umano sono stati analizzati per valutare la precisione su un
analizzatore Hitachi in base alle direttive della prova di replicazione NCCLS modificata. Sono
stati ottenuti i seguenti risultati:
Precisione all’interno della serie
120
120
119
120
120
119
x- (μg/mL)
24,4
95,0
136,8
24,4
95,0
136,8
SD (μg/mL)
0,59
1,43
1,81
0,83
1,93
2,48
1,3
Acido 5-idrossi-2-propilpentanoico
5,8
Acido 3-oxo-2-propilpentanoico
3,8
3,4
< 0,16
14,2
Acido 2-propil-2-pentanoico
1,0
Acido 2-propil-4-pentanoico
22,3
Acido 2-propil-glutarico
< 0,4
Acido 2-propilsuccinico
< 0,9
2,0
< 0,04
Carbamazepina-10,11-epossido
< 0,9
Clonazepam
< 0,3
Diazepam
1,8
Confronto tra metodi
Un confronto tra il dosaggio CEDIA per il VPA (y) e un’analisi immunologica a polarizzazione di
fluorescenza (x) disponibile in commercio ha dato la seguente correlazione.
Regressione lineare
y = -0,61 + 1,08x
r = 0,972
Sy.x = 7,042
4,4
Carbamazepina
Precisione Totale
n
1,5
4,4
Acido 4-idrossi-2-propilpentanoico
Acido 2-propil-2,3’-pentadienoico
Le caratteristiche di rendimento del test tipiche ottenibili mediante l’analizzatore Hitachi 911
sono riportate qui di seguito.16 I valori ottenuti nei diversi laboratori possono essere differenti da
quelli riportati in questa sede.
2,4
Acido 3-idrossi-2-propilpentanoico
2-fenil-2-etilmalonammide (PEMA)
Caratteristiche specifiche del rendimento del test
CV %
Reattività crociata %
< 0,3
Fenobarbitale
< 0,06
Fenitoina
< 0,04
Primidone
< 1,0
Acido salicilico
Passing e Bablok
y = -3,22 + 1,10x
r = 0,972
SD (md95) = 4,442
< 0,004
Non è stata rilevata alcuna interferenza nel dosaggio CEDIA per il VPA con le seguenti sostanze.
Sostanza
Bilirubina
Concentrazione
< 60 mg/dL
Numero di campioni misurati: 77
Le concentrazioni dei campioni erano comprese tra 2,6 e 119,8 µg/mL.
Emoglobina
Linearità
Un campione alto è stato diluito con il calibratore basso Core TDM Multi-Cal. La percentuale di
recupero è stata poi determinata dividendo il valore osservato per il valore atteso.
IgA
< 790 mg/dL
IgG
< 4,3 g/dL
% Campione Alto
Valore Atteso
(μg/mL)
Valore Analizzato
(μg/mL)
100,0
130,1
-
83,3
108,3
112,7
104
66,7
86,7
87,5
101
50,0
65,0
67,4
104
33,3
43,3
43,3
100
16,7
21,7
20,9
96
0,0
0
-
-
< 1,0 g/dL
Sostanza
Concentrazione
IgM
< 840 mg/dL
Fattore reumatoide
< 200 IU/mL
Proteine totali
< 10 g/dL
Trigliceridi
< 1,0 g/dL
Sensibilità
La concentrazione rilevabile minima del dosaggio CEDIA per il VPA è pari a 3,0 µg/mL
(20,8 µmol/L).
% Recupero
-
2
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della Thermo Fisher Scientific.
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sodium valproate: Their clinical value. Ann. Neurol. 1983; 14: 38-42.
16.Dati disponibili presso la Microgenics Corporation, che fa parte della Thermo Fisher
Scientific.
Microgenics Corporation
46500 Kato Road
Fremont, CA 94538 USA
Assistenza tecnica e assistenza
alla clientela negli USA:
1-800-232-3342
Per gli aggiornamenti del foglietto illustrativo, visitare:
www.thermoscientific.com
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Depakene è un marchio depositato della Abbott Laboratories.
CEDIA è un marchio registrato della Roche Diagnostics.
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3
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