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ITTIOPATOLOGIA, 2011, 8: 79-85
Effetto virucida di un disinfettante commerciale
contro Betanodavirus
Evaluation of in vitro virucidal activity of a commercial
disinfectant against Betanodavirus
Sara Ciulli *, Enrico Volpe, Marco Grodzki
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Facoltà di Medicina Veterinaria, Alma Mater Studiorum,
Università di Bologna, Viale Vespucci, 2 – 47042 Cesenatico (FC).
______________________________
RIASSUNTO - L’acquacoltura è a livello mondiale un settore che sta registrando un costante e continuo aumento
delle produzioni con conseguente richiesta di implementazione degli standard igienici e di efficaci prodotti e
protocolli di disinfezione al fine di ridurre i rischi sanitari legati alla diffusione delle malattie infettive. Nella
realtà europea e italiana il branzino (Dicentrarchus labrax) è una delle specie marine con più elevato interesse per
l’acquacoltura. Fra le malattie infettive che maggiormente affliggono questa produzione si registra l’Encefalo
Retinopatia Virale (ERV) da Betanodavirus. Questa patologia è responsabile di sintomatologia nervosa e
mortalità con conseguenti elevate perdite economiche. Attualmente non sono disponibili terapie e vaccini che
permettano un adeguato controllo dell’ERV, per cui la prevenzione della malattia è affidata al mantenimento di
corrette procedure igienico-sanitarie e alla corretta gestione dell’allevamento che si basa su un’approfondita
conoscenza delle caratteristiche del patogeno e sulla disponibilità di prodotti e protocolli di disinfezione per il
controllo dello stesso. Al fine di ampliare le conoscenze sull’efficacia di prodotti disinfettanti verso
Betanodavirus, sono state intraprese, in questo studio, delle prove in vitro per valutare l’attività virucida specifica
di un prodotto commerciale denominato Virkon®S già ampiamente utilizzato in ambito zootecnico. L’attività
virucida è stata valutata tenendo conto di diversi tempi di contatto, diverse temperature di incubazione ed in
presenza di sostanza interferente utilizzando il protocollo BS EN 14675:2006 riconosciuto come protocollo
standard della Comunità Europea. Le analisi effettuate hanno evidenziato una potente attività virucida del
prodotto analizzato verso Betanodavirus evidenziando l’assenza di attività virale residua dopo trattamento con
Virkon®S e suggerendo una sua possibile applicazione efficace per il controllo dell’ERV nel settore
dell’acquacoltura marina.
SUMMARY – Aquaculture is a growing industry with intensive production that requires high hygiene standards,
disinfectant compounds and protocols to control the spread of infectious diseases. In Europe and Italy sea bass
production is the most relevant with high production of juveniles. Among infectious diseases that affect this
species, Viral Encephalopathy and Retinopathy is the most important. This disease is caused by Betanodavirus
and is responsible of nervous signs and mortality, with consequent high economic losses. Presently, there is no
therapy and no vaccines that permit an adequate control of this disease. Therefore, the disease control is at the
moment based on maintaining correct hygienic-sanitary procedures and correct livestock management, these
practices rely on a deeper knowledge of characteristics of the pathogen and the availability of effective products
and disinfection protocols. In order to enlarge the knowledge on efficacy of disinfectants towards Betanodavirus,
in vitro trials were performed in this survey, to evaluate the specific virucidal activity of a commercial product
named Virkon®S that is already on sale in veterinary field. The activity of Virkon®S was inquired analysing
several contact times, temperatures of incubation and the presence of interfering substance using the
international BS EN 14675:2006 protocol acknowledged as European standard protocol. Virkon®S showed a
powerful virucidal activity against Betanodavirus under tested conditions making it a good candidate for the
direct control of ERV in marine aquaculture.
Key-words: Betanodavirus; Viral Encephalopathy and Retinopathy; Virucidal activity; Disinfectant; Peroxigen
disinfectant.
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* Corresponding Author: c/o Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Facoltà di Medicina Veterinaria,
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna, Viale Vespucci, 2 – 47042 Cesenatico, FC, Italy; Tel.
+390547338948; Fax: +390547338941; E-mail: [email protected].
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INTRODUZIONE
L’acquacoltura è a livello mondiale un settore che sta registrando un costante e continuo
aumento delle produzioni (FAO, 2010) con conseguente intensificazione dell’allevamento
ittico. Questa intensificazione richiede un’implementazione degli standard igienici al fine di
ridurre i rischi sanitari legati alla diffusione delle malattie infettive. Le pratiche di
disinfezione costituiscono l’attività fulcro dell’igiene veterinaria interessando tutti i settori
operativi dell’ittiocoltura (OIE, 2010).
Nella realtà europea e italiana il branzino (Dicentrarchus labrax) è una delle specie marine
con più elevato interesse per l’acquacoltura (FAO, 2011). L’Italia in particolare si distingue
per la produzione di novellame, immettendo gli avannotti prodotti anche sul mercato estero.
Il branzino ed in particolare gli stadi giovanili di questa specie sono molto sensibili a vari
agenti di malattie infettive che possono interferire con il processo produttivo causando
perdite economiche nell’intero ciclo di produzione. In particolare, attualmente, riveste una
notevole importanza l’Encefalo Retinopatia Virale (ERV) causata da virus del genere
Betanodavirus, responsabile di sintomatologia nervosa e mortalità (Sano et al., 2011). La
malattia è endemica in tutte le tipologie di allevamento, ma le perdite economiche maggiori
si registrano nelle avannotterie (Corbari, 2003). I Betanodavirus sono piccoli virus
icosaedrici a RNA a singolo filamento appartenenti alla famiglia Nodaviridae (Ball et al.,
2000). L’infezione da Betanodavirus si trasmette sia per via orizzontale tramite
l’introduzione di pesci infetti o indirettamente da acqua e attrezzatura contaminata, sia per
via verticale tramite la riproduzione. Attualmente non sono disponibili terapie e vaccini che
permettano un adeguato controllo dell’ERV, per questo la prevenzione della malattia è
prevalentemente basata sul mantenimento di corrette procedure igienico-sanitarie, attività di
screening e alla corretta gestione dell’allevamento con particolare attenzione alla densità
della biomassa (Sano et al., 2011). Al fine di intraprendere adeguati piani di controllo è di
fondamentale importanza avere un’approfondita conoscenza delle caratteristiche di
resistenza del patogeno e la disponibilità di prodotti e protocolli di disinfezione che siano
efficaci verso questo patogeno nei vari settori del ciclo produttivo. Precedenti studi hanno
testato la resistenza di questi virus verso alcuni agenti fisici e chimici al fine di approfondire
le conoscenze sui meccanismi di trasmissione e persistenza in natura e di stabilire adeguati
metodi di controllo (Arimoto et al., 1996; Frerichs et al., 2000). Questi studi hanno
evidenziato la resistenza del virus per estesi periodi di tempo in un ampio range di condizioni
ambientali. I disinfettanti a base di cloro e iodio si sono rivelati altamente efficaci, ma
solamente in assenza di sostanza organica (Frerichs et al., 2000).
Al fine di standardizzare le metodiche di analisi sull’attività virucida dei prodotti
disinfettanti è stato recentemente messo a punto dalla BSi-British Standards un protocollo di
analisi in vitro approvato anche dal CEN (Comité européen de normalisation): il protocollo
BS EN 14675:2006 (UNI, 2006).
Questo protocollo è stato messo a punto su virus dei mammiferi, pertanto successivamente,
sono state apportate alcune modifiche per poterlo adattare ai virus di interesse ittico e alle
condizioni più consone all’utilizzo dei disinfettanti in acquacoltura (Graham et al., 2007;
Verner-Jeffreys et al., 2009). Al momento il protocollo è stato applicato allo studio di vari
disinfettanti solo contro il virus dell’Anemia Infettiva dei salmonidi (ISA) (Verner-Jeffreys
et al., 2009) e il virus della malattia pancreatica (PD) o malattia del sonno (SD) del salmone
(Graham et al., 2007).
Al fine di ampliare le conoscenze sull’efficacia di prodotti disinfettanti verso
Betanodavirus e di implementare gli strumenti di controllo sull’ERV il protocollo BS EN
14675:2006 è stato applicato alla valutazione dell’attività virucida di un prodotto
commerciale già utilizzato in ambito veterinario denominato Virkon®S contro il virus
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dell’ERV. Questo prodotto è un disinfettante a base di perossidi e acidi organici ad ampio
spettro di efficacia; esso risulta del tutto innocuo sia per gli operatori che per gli animali ed è
velocemente degradabile con assenza di residui: queste caratteristiche ne determinano una
utilizzazione ottimale anche nell’ambiente acquatico. Questo prodotto inoltre risponde già ai
requisiti della Direttiva 98/8/CE relativa all’immissione sul mercato dei biocidi.
MATERIALI E METODI
Virus
Il virus utilizzato per questa sperimentazione è stato isolato da avannotti di branzino
Europeo (Dicentrarchus labrax) durante un focolaio naturale di ERV nel nord Adriatico
(Ciulli et al., 2006). Il virus è stato isolato utilizzando la linea cellulare SSN-1 (Frerichs et
al., 1996) e denominato IT/351/Sb. Dalla caratterizzazione genetica il virus è risultato
appartenere alla specie RGNNV, genere Betanodavirus, Famiglia Nodaviridae. Questa
specie virale è quella comunemente isolata durante i focolai di Encefalo Retinopatia Virale
in branzino Europeo e anche in altre specie ittiche in tutto il Mar Mediterraneo. Il virus
RGNNV è stato inoltre segnalato anche in molteplici specie ittiche marine selvatiche del Mar
Mediterraneo (Ciulli et al., 2007).
Protocollo di valutazione dell’attività virucida dei disinfettanti
Tutte le prove di valutazione dell’attività virucida del disinfettante sono state eseguite
seguendo il protocollo BS EN 14675:2006. Il protocollo, inizialmente allestito per un
enterovirus bovino, è stato modificato per poterlo adattare a virus ittici secondo le
indicazioni pubblicate da Verner-Jeffreys et al. nel 2009. Nel nostro studio il protocollo è
stato adattato per testare l’attività virucida del disinfettante contro Betanodavirus.
Il virus oggetto di indagine è stato replicato e titolato sulla linea cellulare snakehead-fish
(SSN-1) a 25°C. Il calcolo della dose infettante il 50% di tessuto coltura (TCID50/ml) è stato
effettuato secondo il metodo Reed & Muench (1938).
Le prove sono state condotte con volumi pari a 100 µl con un rapporto 1:1:8 di virus,
interferente (albumina bovina frazione V 3 g/100 ml), disinfettante secondo quanto
raccomandato dal protocollo BS EN 14675:2006. Ogni prova di disinfezione includeva una
prova di controllo virus dove al posto del disinfettate veniva utilizzato del diluente. In un
primo momento le prove sono state condotte utilizzando come diluente acqua dura (HW;
1,248 mM MgCl2, 3,328 mM CaCl2, 2,496 mM NaHCO3) secondo quanto raccomandato dal
protocollo BS EN 14675:2006; successivamente i saggi sono stati condotti con acqua di
mare sterile (SW) al fine di valutare l’efficacia del prodotto anche in condizioni assimilabili
a quelle tipiche dell’allevamento del branzino. La miscela è stata quindi incubata a diverse
temperature (10 e 20°C) e per diversi tempi di contatto (da 1 a 20 minuti) come indicato in
tabella 1. Ogni diluizione, tempo e temperatura è stato testato in triplicato con tre saggi
indipendenti. Trascorso il tempo di esposizione da testare, l’azione del disinfettante veniva
arrestata secondo un procedimento di diluizione. Secondo questo procedimento la miscela
virus/disinfettante e virus/diluente veniva diluita in base 10 fino all’ottava diluizione e quindi
testata, per la valutazione del titolo virale residuo, in coltura cellulare SSN-1 su piastra a 96
pozzetti utilizzando 5 pozzetti per diluizione. Su ogni piastra sono stati mantenuti pozzetti di
controllo della coltura cellulare. Dopo 7 giorni di osservazione al microscopio rovesciato e il
calcolo del titolo virale l’attività virucida veniva calcolata sottraendo il titolo virale ottenuto
dopo il trattamento al titolo virale riscontrato senza trattamento (controllo virus), ottenendo
così il valore di riduzione relativa (R). Il disinfettante è stato ritenuto efficace nei casi in cui
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R ≥ 4, cioè dove la riduzione relativa mostrava una diluizione uguale o superiore a 4
logaritmi come specificato nel protocollo BS EN 14675:2006 (UNI, 2006).
Tempo in minuti
Temperatura
in °C
Concentrazione
disinfettante
Diluente
20
10
10
5
5
1
1
1
1
10
20
10
20
10
20
10
20
20
2%
1%
1%
1%
1%
1%
1%
1%
0,5%
HW
HW
HW
HW
HW
HW
HW
SW
SW
Tabella 1 – Concentrazione, tempi e temperature di incubazione testate.
Table 1 - Concentration, time points and temperatures of incubation used in the tests.
Disinfettante
Il disinfettante utilizzato per la prova è il prodotto Virkon®S (DuPont Wilmington, DE
divisione Antec International Limited Sudbury, Suffolk, UK). Il prodotto è stato conservato e
preparato seguendo le indicazioni del produttore. In particolare sono state testate le
concentrazioni 1 e 2% diluendolo in HW o SW. Le soluzioni sono state allestite all’inizio di
ogni prova ed utilizzate entro un’ora dalla preparazione come raccomandato dal protocollo
BS EN 14675:2006.
RISULTATI
Tutte le prove effettuate hanno permesso di ottenere un’attività virale di controllo adeguata
alla lettura delle piastre. Il virus, infatti, nelle soluzioni di controllo ha evidenziato titoli
virali compresi fra 106,87 e 104,92 TCID50/ml. Dopo trattamento tutte le soluzioni virali hanno
mostrato assenza di attività virale residua mostrando l’inattivazione del virus per un ampio
range di titoli virali, sempre ≥ 4 TCID50/ml rientrando pienamente nei parametri indicati
dalla norma di riferimento (BS EN 14675 - UNI, 2006).
Alcuni test della diluizione 2% e della diluizione 1% in HW dopo 10 minuti di incubazione
hanno mostrato effetto tossico alla prima diluizione (1/10) della miscela
virus/interferente/disinfettante. Al fine di impedire che tale effetto tossico potesse
nascondere eventuali effetti citopatici specifici, la riduzione relativa è stata calcolata a partire
dalla seconda diluizione sia nel prodotto testato che nel rispettivo controllo virale.
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a
Tempo in
minuti
Temperatura
in °C
Concentrazione
disinfettante
Diluente
L’utilizzo di acqua di mare con il prodotto Virkon®S non ha generato la presenza di
precipitati a differenza di quanto precedentemente riportato (Graham et al., 2007).
In tabella 2 sono riportati in dettaglio i risultati delle prove espressi come TCID50/ml
ottenuta dopo trattamento di disinfezione con Virkon®S affiancata dal valore di TCID50/ml
ottenuta dal controllo virus e quindi la differenza dei due valori espressa come riduzione
relativa (R).
20
10
2%
HW
10
20
1%
HW
10
10
1%
HW
5
20
1%
HW
5
10
1%
HW
1
20
1%
HW
1
10
1%
HW
1
20
1%
SW
1
20
0,5%
SW
Repliche
TCID50/ml
dopo
disinfezione a
TCID50/ml
Controllo virus a
Riduzione
relativa
Test 1
Test 2
Test 3
Test 1
Test 2
Test 3
Test 1
Test 2
Test 3
Test 1
Test 2
Test 3
Test 1
Test 2
Test 3
Test 1
Test 2
Test 3
Test 1
Test 2
Test 3
Test 1
Test 2
Test 3
Test 1
Test 2
Test 3
0*
0
0*
0*
0*
0*
0
0*
0*
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5,70*
5,20
4,92*
6,07*
5,53*
5,87*
6,53
5,80*
5,06*
6,07
6,32
6,07
7,02
6,70
7,02
6,20
6,32
6,07
6,20
6,32
5,87
5,04
5,04
5,06
6.87
6.53
6.53
5,70
5,20
4,92
6,07
5,53
5,87
6,53
5,80
5,06
6,07
6,32
6,07
7,02
6,70
7,02
6,20
6,32
6,07
6,20
6,32
5,87
5,04
5,04
5,06
6.87
6.53
6.53
Tabella 2 - Risultati dei test di valutazione dell’attività virucida di Virkon®S.
in presenza di effetto tossico alla prima diluizione, i valori di TCID50/ml sono stati letti a partire dalla seconda
diluizione (*).
a
Table 2 - Results of evaluation of Virkon®S’s virucidal activity.
in presence of toxic effect at first dilution, TCID50/ml values were read starting from second dilution (*).
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DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
L’intensificazione della produzione ittica richiede un’implementazione delle tecniche
produttive con particolare attenzione agli aspetti igienico sanitari al fine di limitare i danni
derivanti dalle malattie infettive. Per quanto riguarda l’allevamento del branzino l’ERV è la
principale malattia virale responsabile di danni economici. Al momento non sono disponibili
presidi terapeutici o vaccinali capaci di limitare i danni derivanti da questa malattia e la
profilassi diretta resta lo strumento migliore per ridurre i casi di ERV.
Al fine di ampliare le conoscenze sull’efficacia di prodotti disinfettanti verso
Betanodavirus sono state intraprese, in questo studio, prove in vitro atte a valutare l’attività
virucida specifica di un prodotto commerciale denominato Virkon® già utilizzato in ambito
veterinario.
Al fine di conferire una validità internazionale ai test eseguiti e di ottenere dei risultati
comparabili con l’attività di altri disinfettanti e verso altri microorganismi è stato applicato il
protocollo BS EN 14675:2006 messo a punto dalla BSi-British Standards ed approvato dalla
CEN (Comité européen de normalisation) e quindi riconosciuto come standard della
Comunità Europea. L’utilizzo di questo protocollo ha permesso di testare il prodotto anche
in presenza di sostanza organica, uno dei fattori limitanti l’attività di molti ottimi
disinfettanti. Questa condizione peraltro è facilmente riscontrabile nelle comuni situazioni di
utilizzo dei prodotti disinfettanti in acquacoltura e quindi validare l’efficacia dei prodotti in
presenza di sostanza organica è un punto critico per il successivo successo nell’utilizzo
pratico del prodotto in questo settore.
Le prove eseguite hanno permesso di evidenziare una potente attività virucida verso
Betanodavirus del prodotto Virkon®S raggiungendo sempre valori superiori a 4 logaritmi di
riduzione relativa anche in presenza di sostanza organica. Anche la sostituzione del diluente
da HW a SW ha permesso di testare una condizione affine a quella riscontrabile
nell’allevamento del branzino. Le prove hanno evidenziato una efficacia del prodotto del
tutto paragonabile nelle due condizioni ambientali.
In conclusione con questo lavoro è stato possibile acquisire con successo il protocollo BS
EN 14675:2006 per l’analisi dell’attività virucida di disinfettanti specifica verso
Betanodavirus.
L’applicazione di tale protocollo ha permesso la valutazione dell’attività disinfettante di un
prodotto commerciale che ha mostrato un elevato potere virucida nei confronti di
Betanodavirus in molteplici condizioni ambientali suggerendo una sua possibile applicazione
sicura anche nel settore dell’acquacoltura marina.
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