Stolbur del pomodoro
in Emilia-Romagna
Risultati di uno studio triennale
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1
4
3
In
1)
2)
3)
4)
copertina:
pianta di pomodoro da mensa con portamento eretto e fusti ingrossati
fiori malformati a forma di vescica con sepali giganti
grappoli fiorali con ramificazioni dicotomiche
frutti piccoli con polpa dura e asciutta
Lavoro svolto nell’ambito del Progetto “Studi sulla fitoplasmosi dello Stolbur sul
pomodoro da industria in Emilia-Romagna” finanziato dalla Regione Emilia-Romagna (Legge Regionale 28/98) e coordinato da CRPV
Stolbur del pomodoro
in Emilia-Romagna
Risultati di uno studio triennale
INDICE
- Presentazione del progetto ................................................ 5
Maria Grazia Tommasini
- Sintomi e diffusione dello Stolbur ...................................... 7
Valentino Testi, Chiara Delvago, Roberto Zambini, Bruno Chiusa,
Ruggero Colla, Stefano Saccò
- Identificazione del fitoplasma dello Stolbur ...................... 15
Federica Terlizzi, Rino Credi
- Gli insetti vettori dello Stolbur ........................................ 21
Emanuele Mazzoni, Rinaldo Nicoli Aldini, Michela Panini
- Come prevenire la malattia .............................................. 25
Valentino Testi, Stefano Saccò, Bruno Chiusa, Rino Credi,
Emanuele Mazzoni
- Conclusioni ...................................................................... 28
Anna Rosa Babini
- Bibliografia ...................................................................... 29
3
PROGETTO “STUDI SULLA FITOPLASMOSI DELLO STOLBUR
SUL POMODORO DA INDUSTRIA IN EMILIA-ROMAGNA”
(Finanziato dalla Regione Emilia-Romagna - Legge 28/98)
COORDINAMENTO
CRPV: Maria Grazia Tommasini.
UNITÀ OPERATIVE E PERSONALE IMPEGNATO
CRPV: Stefano Saccò.
CONSORZIO FITOSANITARIO PROVINCIALE DI PARMA: Valentino
Testi, Chiara Delvago, Roberto Zambini.
CONSORZIO FITOSANITARIO PROVINCIALE DI PIACENZA: Bruno
Chiusa, Ruggero Colla.
DIPARTIMENTO DI SCIENZE E TECNOLOGIE AGROAMBIENTALI
(DISTA), ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA:
Federica Terlizzi, Rino Credi.
ISTITUTO DI ENTOMOLOGIA E PATOLOGIA VEGETALE – UNIVERSITÀ
CATTOLICA DEL SACRO CUORE - SEDE DI PIACENZA: Emanuele
Mazzoni, Rinaldo Nicoli Aldini, Michela Panini.
SERVIZIO FITOSANITARIO REGIONE EMILIA-ROMAGNA: Anna Rosa
Babini.
RINGRAZIAMENTI
Per la realizzazione del progetto “Studi sulla fitoplasmosi dello Stolbur
sul pomodoro da industria in Emilia-Romagna” si ringrazia la Regione
Emilia-Romagna per il contributo economico (L.R. 28/98), le
Organizzazioni dei produttori AINPO, ASIPO, ARP, COPADOR e CIO per
la collaborazione fornita e tutti gli Enti, tecnici e aziende agricole che,
a diverso titolo, vi hanno contribuito.
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PRESENTAZIONE DEL PROGETTO
Maria Grazia Tommasini
Premessa
Dal 2005 in diverse località emiliane, soprattutto nelle province di
Parma e Piacenza, si sono riscontrati preoccupanti danni alle coltivazioni di pomodoro causati da una malattia di origine fitoplasmatica
nota in letteratura come Virescenza ipertrofica del pomodoro o
“Stolbur”. I campioni di pomodoro sintomatici, analizzati nei primi anni
dal Laboratorio di Virologia del Servizio Fitosanitario della Regione
Emilia-Romagna e dall’Istituto di Entomologia e Patologia vegetale
dell’Università Cattolica del Sacro Cuore, sede di Piacenza, confermavano che l’agente eziologico era il fitoplasma dello Stolbur (Testi et al.,
2007).
Fino ad allora nelle coltivazioni di pomodoro da industria dell’areale
settentrionale si trovavano, sporadicamente, singole piante con sintomi ascrivibili alla fitoplasmosi, mentre la malattia era più diffusa e
conosciuta negli areali meridionali. Negli anni successivi, data la sua
potenziale pericolosità ed in considerazione del fatto che Stolbur è
riportato nella lista di allerta (A2) degli organismi fitopatogeni da quarantena da parte dell’EPPO (European and Mediterranean Plant
Protection Organization), i Consorzi Fitosanitari Provinciali di Parma e
Piacenza hanno avviato monitoraggi e investigazioni per valutare la
distribuzione e l’intensità della malattia nei rispettivi territori, con prelievi di piante di pomodoro sintomatiche e di erbe infestanti per la
caratterizzazione molecolare del fitoplasma analizzate dal CRA-PAV
Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale di Roma (Mazzoni et al.,
2008).
Progetto
A partire dal 1° settembre 2009 è iniziato il progetto “Studi sulla fitoplasmosi dello Stolbur sul pomodoro da industria in Emilia-Romagna”,
finanziato dalla Regione Emilia-Romagna (L.R. 28/98) e coordinato dal
CRPV, avente lo scopo di approfondire le conoscenze sulle particolarità eziologiche dell’avversità fitoplasmatica e sui vari fattori che contribuiscono a delinearne l’epidemiologia.
Il progetto aveva i seguenti obiettivi:
1) studiare l’areale di diffusione e l’incidenza della malattia nel territorio regionale;
2) identificare il fitoplasma dello Stolbur, attraverso la determinazione
5
degli isolati e la loro caratterizzazione genetica;
3) approfondire i rapporti tra fitoplasmi - infestanti – vettori;
4) ricercare gli insetti vettori coinvolti nell’espansione della malattia e
le piante in grado di fungere da serbatoio d’inoculo del patogeno, nonché da ospiti dell’insetto vettore.
Sono state infine provate strategie di intervento con insetticidi chimici
e valutate possibili tecniche agronomiche in grado di prevenire o contenere la diffusione del patogeno, al fine di garantire produttività e
redditività al settore pomodoricolo nell’ambito di un sistema ecocompatibile di agricoltura integrata.
I risultati ottenuti, illustrati nelle pagine seguenti, sono stati presentati nel convegno “Stolbur del pomodoro in Emilia-Romagna: risultati di
uno studio triennale” nell’ambito della manifestazione Tomato World –
Piacenza, 23 novembre 2012.
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SINTOMI E DIFFUSIONE DELLO STOLBUR
Valentino Testi, Chiara Delvago, Roberto Zambini,
Bruno Chiusa, Ruggero Colla, Stefano Saccò
Premessa
L’agente eziologico dello Stolbur è un fitoplasma incluso nel gruppo
16SrXII, sottogruppo A (Lee et al., 1998; Langer e Maixner, 2004).
I fitoplasmi sono organismi procarioti, unicellulari, appartenenti alla
classe dei Mollicutes, simili ai batteri, ma più piccoli (dimensioni variabili tra i 100 e i 1.000 nanometri) e
privi di parete cellulare (pleomorfi).
Essendo biotrofici, cioè incapaci di
vivere al di fuori di cellule vive,
necessitano di un vettore per la trasmissione e non sono coltivabili in
vitro. Sono patogeni obbligati e
vivono solo all’interno dei tessuti
floematici dei vegetali. A differenza
Foto 1 – Fitoplasmi al microscopio elet- dei virus, però, possiedono un
tronico: tali microrganismi appaiono di metabolismo proprio, anche se
forme diverse e circondati solamente da
una membrana citoplasmatica (Foto: R. molte sostanze sono acquisite diretCredi).
tamente dall’ospite.
Sintomi
Nelle malattie fitoplasmatiche gran
parte dei sintomi derivano da alterazioni a carico del sistema floematico e da squilibri ormonali. Studi
recenti hanno evidenziato che i sintomi sono da attribuire anche alla
sovraespressione o alla repressione
di geni della pianta ospite.
Nel caso dello Stolbur le profonde
modificazioni indotte dai fitoplasmi
Foto 2 – Piante di pomodoro con portainteressano,
principalmente, l’appamento eretto (Foto V. Testi).
rato vegetativo e quello riproduttivo: le piante assumono aspetto cespuglioso con portamento eretto,
fusti ingrossati, germogli con internodi corti, affastellamento della
vegetazione dovuto alla produzione di getti ascellari.
Le foglie spesso sono piccole, accartocciate, con margini arrotolati
7
verso l’alto, di colore giallo-verdognolo (clorotiche). Meno frequentemente si osservano foglie grandi di
colorazione violacea, oppure foglie
laciniate o nematofille. Le piante
colpite da Stolbur si vedono bene in
campo nella fase finale del ciclo colturale per il loro portamento eretto
e cespuglioso, a differenza di quelle
sane che si coricano sul terreno per
il peso dei frutti.
Foto 3 – Foglie di pomodoro clorotiche,
con margine arrotolato verso l’alto (Foto
V. Testi).
I grappoli fiorali presentano ramificazioni dicotomiche con fiori malformati, totalmente o parzialmente
sterili, eretti, con sepali giganti e
petali caratterizzati dalla perdita di
pigmenti naturali (virescenza), calice ingrossato e indiviso a forma di
vescica, organi fiorali trasformati in
foglie (fillodia).
Foto 4 – Ramificazioni dicotomiche e
I
frutti già formati, normalmente
massiccio aborto fiorale. (Foto R. Colla).
presenti solo sui primi palchi, si
presentano piccoli e deformi, con polpa dura e asciutta e rimangono
tenacemente attaccati alla pianta anche dopo il vaglio della macchina
raccoglitrice.
Sulle parti basali dei fusti si osserva la proliferazione di radici avventizie aeree.
In Emilia-Romagna la malattia è sempre stata osservata su varietà di
pomodoro a ciclo tardivo, a partire
dalla seconda metà del mese di
luglio. Ciò può essere dovuto al
ciclo di sviluppo dell’insetto vettore
ed al periodo in cui è in grado di trasmettere i fitoplasmi, oppure al
fatto che solo in estate l’ambiente
floematico è adatto alla loro sopravvivenza e moltiplicazione.
La distribuzione spaziale delle pianFoto 5 – Frutti piccoli e deformi (Foto V.
te sintomatiche in campo risulta Testi).
8
pressoché casuale, senza alcun gradiente specifico o aree particolarmente colpite rispetto ad altre.
Danni
Negli impianti di pomodoro maggiormente colpiti e nelle annate
nelle quali la malattia è più aggressiva, i danni produttivi sono rilevanFoto 6 – Proliferazione di radici avventi- ti in quanto viene a mancare la forzie aeree (Foto V. Testi).
mazione delle bacche degli ultimi
due palchi. Da indagini svolte nel
Parmense nel 2007 (Testi et al., 2008) si è potuto appurare che, mettendo a confronto la produzione commerciale di piante sane con quella di piante colpite da Stolbur, le piante ammalate producono dal
51,4% all’86,55% in meno, con una media del 66,62%. Inoltre si è
riscontrato un aumento della perdita produttiva con l’avvicinarsi dell’epoca di raccolta a causa del peggioramento dei sintomi e dell’aumento della marcescenza dei frutti. Infatti le bacche del primo palco di
piante infette hanno avuto un aumento, medio, di frutti marci del 78%
rispetto a quelle di piante sane. Quindi le piante di pomodoro fortemente colpite da Stolbur hanno una produzione commercializzabile
praticamente nulla perché le bacche ben formate tendono a marcire e
le altre piccole e dure sono scartate dalla fabbrica di trasformazione.
Nei diversi anni si è constatato che gli appezzamenti più infetti, con
presenza di piante di pomodoro sintomatiche fino all’80% e oltre,
erano quelli che, nella rotazione colturale, seguivano un prato stabile.
Per tale motivo, gli studi riguardanti il ruolo epidemiologico dei vettori e delle piante infestanti che li ospitano sono stati condotti preferibilmente su appezzamenti di pomodoro a ciclo tardivo realizzati in successione ad un prato stabile.
Diffusione della malattia in Emilia-Romagna
Nel triennio 2009-2011 è stato eseguito un approfondito monitoraggio
nel territorio regionale per verificare presenza e diffusione della malattia, intensità e gravità della stessa. In ciascuna annata sono stati
monitorati 100 appezzamenti di pomodoro individuati, a campione,
nelle province più importanti per la coltivazione della solanacea.
Nell’ambito del monitoraggio sono stati, inoltre, raccolti e poi saggiati
campioni prelevati da piante di pomodoro sintomatiche ed asintomatiche e campioni delle infestanti più rappresentative dei diversi areali di
coltivazione.
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Gran parte degli appezzamenti visitati sono stati georeferenziati utilizzando un computer palmare Trimble Geo XM, che ha integrato un
apparecchio GPS (Global Positioning System) per il posizionamento
mediante satelliti, e l’applicativo FitoPad, realizzato dal Servizio
Fitosanitario della Regione Emilia-Romagna per i controlli ispettivi. Le
informazioni geografiche, agronomiche e biologiche, descrittive di ogni
appezzamento, sono poi state trasferite su PC, creando una banca dati
GIS (varietà, epoca di trapianto, erbe infestanti presenti e percentuale di piante ammalate) ed elaborate con FitoMap.
Nei territori più conosciuti gli appezzamenti sono stati georefenziati
direttamente nell’applicativo FitoMap con l’utilizzo di CTR (Carte
Tecniche Regionali) e foto aeree (Ortofoto) come riferimento.
Mediante il software sono state quindi elaborate mappe regionali che
evidenziano i punti monitorati e, con diversi colori, l’intensità della
malattia: rosso con intensità di infezione superiore al 5%, arancione
intensità di infezione nell’intervallo 1-5%, giallo presenza inferiore al
1% e verde assenza di piante sintomatiche.
Monitoraggio 2009
Nel 2009 sono stati monitorati 48 appezzamenti in provincia di Parma,
28 in provincia di Piacenza, 13 in provincia di Ferrara, 8 in provincia di
Reggio Emilia e 3 in provincia di Ravenna.
I campi di pomodoro maggiormente colpiti da Stolbur erano presenti
nella provincia di Parma: n. 4 appezzamenti con intensità di infezione
superiore al 5% (15%,10%, 6%, 6% di piante sintomatiche) e n. 13
10
con intensità di infezione nell’intervallo 1-5%, e nella provincia di
Piacenza: n.1 appezzamento con intensità di infezione superiore al 5%
(15% di piante sintomatiche) e n. 8 appezzamenti con intensità di
infezione nell’intervallo 1-5%.
Nelle province di Ravenna, Ferrara, Reggio Emilia, e negli altri campi
osservati nelle province di Parma e Piacenza, la presenza di piante sintomatiche è risultata inferiore all’1% o nulla.
Monitoraggio 2010
Nel 2010 sono stati monitorati 59 appezzamenti in provincia di Parma,
25 in provincia di Piacenza, 9 in provincia di Reggio Emilia, 2 in provincia di Modena, 4 in provincia di Bologna e 1 in provincia di Ferrara.
I campi di pomodoro maggiormente colpiti da Stolbur sono ancora pre-
senti nella provincia di Parma: n. 4 appezzamenti con intensità di infezione superiore al 5% (50%, 10%, 10%, 9% di piante sintomatiche)
e n. 11 appezzamenti con l’intensità di infezione nell’intervallo 1-5%,
e nella provincia di Piacenza: n. 4 appezzamenti con intensità di infezione superiore al 5% (20%, 13%, 10%, 9% di piante sintomatiche)
e n. 1 appezzamento con intensità di infezione nell’intervallo 1-5%. In
provincia di Reggio Emilia solo un appezzamento è risultato con intensità di infezione superiore all’1% (1,5% di piante sintomatiche).
Nelle province di Modena, Bologna, Ferrara, Ravenna, e negli altri
campi osservati nelle province di Parma, Piacenza e Reggio Emilia, la
presenza di piante sintomatiche è risultata inferiore all’1% o nulla.
11
Monitoraggio 2011
Nel 2011 sono stati monitorati 46 appezzamenti in provincia di Parma,
40 in provincia di Piacenza, 11 in provincia di Reggio Emilia e 3 in provincia di Modena.
Nel 2011 la malattia è risultata molto più grave in provincia di
Piacenza: n. 9 appezzamenti con intensità di infezione superiore al 5%
(80%, 25%, 12%, 10%, 10%, 10%, 9%, 7%, 7% di piante sintomatiche) e n. 14 appezzamenti con intensità di infezione nell’intervallo 15%, che in quella di Parma: n. 1 appezzamento con intensità di infezione superiore al 5% (8% di piante sintomatiche) e n. 20 appezzamenti con intensità di infezione nell’intervallo 1-5%.
Nelle province di Reggio Emilia e Modena l’intensità di infezione è
risultata nell’intervallo 1-5% rispettivamente in n. 4 appezzamenti
(tutti 1% di piante sintomatiche) e in n. 3 appezzamenti (5%, 4%, 1%
di piante sintomatiche).
Negli altri campi osservati nelle province di Parma, Piacenza e Reggio
Emilia, la presenza di piante sintomatiche è risultata inferiore all’1% o
nulla.
Conclusioni
Il monitoraggio realizzato in Emilia-Romagna ha permesso di rilevare
scarsi o nulli danni associati a Stolbur nelle province orientali della
regione (Reggio Emilia, Modena, Bologna, Ferrara e Ravenna) dove la
12
presenza di piante infette dalla fitoplasmosi si limita a poche unità,
poste soprattutto ai bordi degli appezzamenti.
Maggiore la diffusione e la dannosità della malattia nelle province di
Parma e Piacenza, anche se l’incidenza dei danni risulta molto variabile negli anni e nei diversi areali di coltivazione. Infatti nei primi due
anni Stolbur ha maggiormente danneggiato il pomodoro nel Parmense,
mentre nel 2011 la diffusione e la dannosità della malattia è risultata
molto maggiore nella provincia di Piacenza.
Per quanto riguarda la suscettibilità delle varietà di pomodoro coltivate con ciclo tardivo, non si sono evidenziate differenze tra le diverse
varietà.
13
IDENTIFICAZIONE DEL FITOPLASMA DELLO STOLBUR
Federica Terlizzi, Rino Credi
Premessa
La malattia del pomodoro in argomento non è una novità nell’ambito
della patologia vegetale. La sindrome è infatti conosciuta da molto tempo
e per le sue peculiarità fu originariamente denominata “Virescenza ipertrofica” o “Stolbur”. In tempi più recenti si è poi scoperto che il suo agente è un fitoplasma classificato nel sottogruppo tassonomico 16SrXII-A
(Lee et al., 1998). Oltre al pomodoro, il fitoplasma dello Stolbur può infettare anche altre solanacee coltivate; nell’ambito poi di altre specie di interesse agrario è purtroppo agente di gravi affezioni come, ad esempio, il
“Legno nero” nella vite (Credi et al., 2004).
Riguardo la diffusione di questa malattia, è già stato riportato che le
più alte incidenze ricorrono in Emilia ed in particolare nelle coltivazioni di
pomodoro da industria a ciclo tardivo con danni talvolta rilevanti (Testi et
al., 2007). A seguito della sua comparsa furono attivate le prime indagini di campo e di laboratorio (Mazzoni et al., 2008; Testi et al., 2008).
Tuttavia, durante questi ultimi anni, gli studi sono continuati con l’obiettivo di esaminare in modo più approfondito il fenomeno fitopatologico. La
presente nota sintetizza i risultati che sono stati acquisiti su alcuni aspetti riguardanti la diagnosi e la caratterizzazione molecolare del fitoplasma,
nonché il suo ciclo epidemiologico.
Campionamenti
I sopralluoghi nelle varie aree prese in considerazione sono avvenuti
durante il triennio 2009-2011 ed usualmente nel periodo estivo, il più idoneo per la massima estrinsecazione sintomatologica. Svariati impianti di
pomodoro da industria, rappresentativi delle varietà maggiormente coltivate, sono stati ispezionati primariamente nelle province di Piacenza e
Parma; poi, anche in altre realtà produttive minori di Reggio Emilia,
Modena, Bologna, Ferrara e Ravenna. Per le verifiche diagnostiche di
laboratorio, nelle occasioni si campionavano numerose piante di pomodoro ammalate e, come controlli, anche alcune apparentemente sane (asintomatiche). Nei medesimi siti è stata considerata anche la flora spontanea presente all’interno degli appezzamenti o nelle vicine zone periferiche (capezzagne, fossi di scolo). Le specie più comuni e frequenti venivano classificate e da esemplari di queste prelevati gli opportuni campioni fogliari da sottoporre alle specifiche analisi. Con l’intento di verificare
una eventuale trasmissione del fitoplasma mediante il seme, sono stati
inoltre saggiati vari semenzali di pomodoro opportunamente ottenuti da
semi estratti da bacche di piante sintomatiche.
15
Analisi diagnostiche
L’effettiva presenza del fitoplasma dello Stolbur nei tessuti fogliari è
stata accertata mediante specifiche metodologie biomolecolari. La prima
fase consisteva nell’estrazione del DNA totale adottando, con alcune leggere modifiche, il protocollo di Angelini et al. (2001). I singoli estratti
erano poi sottoposti alla così detta reazione a catena della polimerasi
(PCR). La procedura consisteva in una prima PCR utilizzando una coppia
di oligonucleotidi (primers) universali (P1/P7), seguita da una seconda
amplificazione, detta “nested-PCR”, con una coppia di primers specifici
per il fitoplasma in esame (f/r STOL). Infine, gli eventuali amplificati di
DNA del fitoplasma si evidenziavano mediante corsa elettroforetica in gel
di agarosio all’1% e colorazione con bromuro di etidio. Nei casi in cui si
otteneva una risposta positiva si procedeva con ulteriori indagini al fine
di caratterizzare sotto l’aspetto genetico-molecolare i vari isolati del fitoplasma in precedenza identificati. Tutto ciò in base alle originarie indicazioni di Langer e Maixner (2004). Più in particolare, i corrispettivi estratti di acido nucleico si facevano reagire prima con la coppia di primers
f/rTuf1 e poi con quella denominata f/rTufAy. Queste amplificano una porzione variabile del gene non ribosomico tuf che codifica il fattore di allungamento Tu (Schneider et al., 1997). I prodotti della nested-PCR, previa
digestione con l’endonucleasi di restrizione HpaII (Promega), venivano
infine analizzati mediante la tecnica RFLP (restriction fragment length
polymorphism) per verificare il polimorfismo dei frammenti di restrizione.
L’identificazione dell’eventuale infezione del fitoplasma è stata anche
effettuata utilizzando un protocollo molto innovativo di “duplex real-time
RT-PCR” (Margaria et al., 2007; Terlizzi et al., 2011). Al proposito, è interessante notare che il saggio si effettua su aliquote di succo grezzo,
opportunamente estratto dai tessuti fogliari delle piante considerate,
poste su membrane di nylon (Osman e Rowhani, 2006). La duplex realtime RT-PCR permette un’amplificazione in tempo reale grazie all’impiego di marcatori fluorescenti. Nelle nostre prove sono state impiegate
sonde TaqMan® marcate con fluorofori differenti, mettendo nello stesso
tubo di reazione la combinazione primers/sonda specifica per il fitoplasma
e quella specifica per il 18S rDNA delle piante quale controllo endogeno
(da qui il termine “duplex”, essendo appunto due le reazioni che si vanno
a realizzare).
In modo analogo si è proceduto anche per la caratterizzazione genetica-molecolare degli isolati di Stolbur, utilizzando una metodologia di
“multiplex real-time RT-PCR” che prevede l’impiego di due sonde ceppospecifiche (qBN-VK1 e qBN-VK2) per il fitoplasma in esame (Berger et al.,
2009) unitamente alla sonda-controllo del DNA delle piante sopra menzionate.
16
Risultati
Negli anni in cui si è operato sono stati complessivamente collezionati, e poi sottoposti alle analisi diagnostiche, 98 campioni fogliari da piante di pomodoro che manifestavano i tipici sintomi della malattia. I semenzali di pomodoro ottenuti da semi di bacche provenienti da piante infette, e poi saggiati, erano invece 33.
Come confronti erano considerati pure diversi campioni prelevati da
piante di pomodoro asintomatiche. I risultati dei saggi diagnostici effettuati mediante la classica nested-PCR si sono dimostrati in linea con lo
status sanitario stabilito in campo al momento dei prelievi. Infatti, tutti i
campioni raccolti dai pomodori con manifestazioni evidenti di Stolbur
sono apparsi infetti dal fitoplasma omonimo; per contro, i campioni prelevati dalle piante senza sintomi reagivano negativamente (Figura 1).
Il medesimo responso si otteneva anche dai test analitici effettuati sui
campioni dei semenzali.
Oltre un centinaio di piante spontanee, rappresentative di 14 specie
diverse, sono state campionate nelle varie località oggetto dell’indagine.
A seguito delle verifiche analitiche intraprese, solo fra le popolazioni di
due comunissime erbe infestanti si è dimostrata, però, la presenza del
fitoplasma. Queste erano Calystegia sepium (Vilucchione), 10 piante
infette su 35 saggiate, e Convolvulus arvensis (Vilucchio comune), 12
piante infette su 35 saggiate (Figura 1).
Figura 1 – Diagnosi del fitoplasma dello Stolbur: corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1% degli amplificati ottenuti mediante nested-PCR, usando prima una coppia di
primers universali (P1/P7), poi una coppia di primers specifici (fStol/rStol). M = DNA
marker (1 Kb, Invitrogen); 1 = pianta di pervinca riconosciuta infetta (controllo positivo); 2 e 4 = piante di pomodoro asintomatiche; 3, 5 e 6 = piante di pomodoro ammalate e risultate infette dal fitoplasma; 7 e 8 = piante di C. arvensis infetta e sana, rispettivamente.
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Risultati del tutto similari a quelli precedentemente sintetizzati venivano ottenuti allorché si utilizzava la tecnica duplex real-time RT-PCR
(dati non riportati).
Tutti gli isolati dell’agente patogeno reperiti nei tre anni, 98 da
pomodoro, 10 provenienti da C. sepium e 12 da C. arvensis, sono stati
caratterizzati sotto il profilo genetico mediante le citate analisi di
nested-PCR e RFLP. I profili dei frammenti di restrizione, ottenuti dopo
digestione degli amplificati con l’enzima HpaII, sono apparsi tutti dello
stesso tipo, cioè con solo due frammenti di 600 e 300 paia di basi (pb),
e più precisamente riferibili al ceppo epidemiologico denominato tuf-b
(Figura 2). Risultati analoghi si sono registrati anche con l’uso della
tecnica multiplex real-time PCR (dati non riportati).
Figura 2 – Caratterizzazione del fitoplasma dello Stolbur (RFLP): corsa elettroforetica
su gel di agarosio all’1% dei prodotti di nested-PCR, ottenuti utilizzando prima la coppia
di primers f/r Tuf1 e poi la coppia di primes f/r TufAy, dopo digestione con l’enzina di
restrizione HpaII. 1, 2, 3 e 4 = isolati da pomodori sintomatici; 5 = isolato da C. sepium;
6 = isolato da C. arvensis; tuf-b = ceppo di riferimento associabile alle due convolvulcee; tuf-a = ceppo di riferimento associabile invece ad U. dioica; M =100 bp DNA Ladder
(Promega).
Conclusioni
Come previsto, tutte le piante di pomodoro con le caratteristiche
anomalie morfologiche sono risultate infette dal fitoplasma dello
Stolbur. Riguardo invece i controlli effettuati sui semenzali ottenuti da
semi di bacche di pomodori colpiti, il responso dei saggi è stato sempre negativo. Ciò a dimostrazione che l’agente patogeno non passa al
seme o comunque non si trasmette alla progenie mediante questa via.
Gli isolati del fitoplasma collezionati sono stati inoltre caratterizzati,
risultando tutti appartenere al ceppo denominato tuf-b. Le acquisizioni della presente indagine confermano e ampliano quelle delle precedenti osservazioni (Mazzoni et al., 2008; Panini et al., 2011). La caratteristica di tale ceppo è di essere strettamente associato alle due convolvulacee C. sepium e C. arvensis, piante spontanee che usualmente
infestano i nostri ambienti agrari. Queste, infatti, in natura fungono sia
da sorgenti d’inoculo del fitoplasma che da ospiti per il principale inset-
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to vettore, il cixiide Hyalesthes obsoletus (Maixner, 1994; Langer e
Maixner, 2004; Credi et al., 2004; Credi et al., 2009).
Altri due ceppi epidemiologici del fitoplasma dello Stolbur sono stati
riportati in letteratura (Langer e Maixner, 2004). Fra questi si segnala
il tuf-a che, in molte realtà ecologiche-ambientali, si ritrova invece
strettamente associato a Urtica dioica. Il profilo RFLP di tale ceppo è
facilmente distinguibile essendo caratterizzato da tre frammenti polimorfici di 410, 300 e 170 paia di basi (Figura 2). Al proposito è interessante riportare che delle 13 piante di ortica campionate in alcuni
appezzamenti di pomodoro con alte incidenze della malattia, nessuna
è risultata infetta. Quindi, questo dato indicherebbe che la pianta non
riveste un ruolo epidemiologico significativo nelle realtà agricole che
sono state oggetto della presente indagine, contrariamente a quanto
verificato, sempre in Emilia-Romagna, per il Legno nero della vite,
dove U. dioica è risultata la specie più importante nel ciclo fitoplasmavettore-ospite (Credi et al., 2004; Credi et al., 2009).
In conclusione, da quanto succintamente esposto, si evince che il
fitoplasma dello Stolbur presenta
un’epidemiologia molto complessa,
in cui, oltre alle piante ospiti d’importanza agraria, sono pure coinvolte alcune piante spontanee quali
serbatoi d’inoculo del patogeno,
nonché ospiti dell’insetto vettore.
La pluriennale attività condotta nell’ambito del nostro programma di
ricerca ha evidenziato che, nei siti
considerati, le due specie potenzialmente importanti sotto l’aspetto
epidemiologico sarebbero solo C.
sepium e C. arvensis (Foto 7).
Quindi, al fine di limitare l’incidenza
di questa importante malattia del Foto 7 - C. arvensis con arrossamenti da
pomodoro nei nostri comprensori, probabile infezione fitoplasmatica (Foto
ciò è indubbiamente da tenere in V. Testi).
alta considerazione come base
conoscitiva per sviluppare potenziali modalità di intervento. Al riguardo, si ritiene che tali modalità dovranno essere principalmente di tipo
agronomico, come ad esempio il diserbo controllato, nei modi e nei
tempi più opportuni, delle suddette infestanti.
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GLI INSETTI VETTORI DELLO STOLBUR
Emanuele Mazzoni, Rinaldo Nicoli Aldini, Michela Panini
Premessa
Allo stato attuale delle conoscenze si ritiene che solo insetti appartenenti all’ordine dei Rincoti siano responsabili della trasmissione della
virescenza ipertrofica al pomodoro (Stolbur). Gli agenti causali di questa malattia sono fitoplasmi che si localizzano nel floema e quindi solo
gli insetti che si nutrono a carico di questo tessuto sono potenzialmente capaci di acquisire e successivamente trasmettere questi patogeni.
Varie ricerche hanno consentito di identificare numerose specie,
appartenenti a varie famiglie, in grado di trasmettere il fitoplasma
agente dello Stolbur (Weintraub e Beanland, 2006).
Gli insetti che si alimentano su piante infette possono acquisire passivamente il fitoplasma in un periodo di
tempo che generalmente dura almeno
alcune ore. Segue un periodo di “latenza” o “incubazione” che può durare
anche varie settimane, durante il quale
il fitoplasma si moltiplica nel corpo dell’insetto vettore e arriva a invaderne le
ghiandole salivari. Con le successive
punture di alimentazione l’insetto sarà
così in grado di infettare nuove piante
(inoculazione).
Attualmente si ritiene che il vettore
del fitoplasma su pomodoro sia
Hyalesthes
obsoletus,
Rincote
Omottero appartenente alla famiglia
Cixiidae (Foto 8). Questo insetto è già
da lunga data segnalato come vettore
dello Stolbur delle solanacee e di altre Foto 8 – Adulto di H. obsoletus
(Foto: Istituto di Entomologia e
colture da reddito (Fos et al., 1992).
Patologia
vegetale,
Università
Cattolica del Sacro Cuore).
Hyalesthes obsoletus
H. obsoletus è una specie polifaga, diffusa in tutta Italia. Gli adulti
sono lunghi circa 4-5 mm (i maschi sono leggermente più piccoli delle
femmine). Il corpo è di colore nero lucente, mentre il capo è ornato
con linee bianco–avorio che circondano anche gli occhi rossastri (Foto
8). Le forme giovanili (neanidi e ninfe) sono di colore bianco-crema e
21
presentano la parte terminale dell’addome provvisto di ciuffi di cera
biancastra (Foto 9 e 10).
Foto 9-10 – Stadi preimmaginali di H. obsoletus rinvenuti su radici di convolvulacee
(Foto: Istituto di Entomologia e Patologia vegetale, Università Cattolica del Sacro
Cuore).
Nell’areale europeo questa specie compie una sola generazione all’anno. Le forme giovanili svernano a svariati centimetri di profondità sulle
radici di piante spontanee, prevalentemente allo stadio di ninfa di terza
età, caratterizzata da una spiccata resistenza nei confronti del freddo. Tra
le piante ospiti preferite ritroviamo l’ortica (Urtica dioica), il convolvolo
(Convolvulus arvensis), il vilucchio (Calystegia sepium) e anche il ranuncolo (Ranunculus sp.). In Italia l’ortica, il convolvolo e la calistegia sono
risultati ospiti naturali del fitoplasma dello Stolbur. Lo sfarfallamento dell’adulto si verifica nel terreno, ad una profondità compresa tra 1 e 5 cm.
La ricerca si è svolta su appezzamenti di pomodoro in provincia di
Parma e Piacenza. In tutti i campi sotto indagine, le catture degli adulti,
con retino entomologico, sono iniziate a giugno, hanno mostrato un picco
in corrispondenza della prima decade di luglio e si sono poi azzerate
entro la prima decade di agosto. Gli adulti della cicalina sono stati trovati comunemente su convolvolo; nel maggio 2011 alcune forme giovanili
sono state trovate anche sulle radici
di questa pianta.
La specie è stata individuata prevalentemente sui bordi degli appezzamenti, dove nel corso dei tre anni
di indagine sono stati catturati, con
retino entomologico, oltre 400 individui di H. obsoletus. Le catture effettuate con sfalci diretti su pomodoro
sono state invece molto più rare.
Infine, le trappole cromotropiche Foto 11 – Sfalci con retino entomologico
(Foto 12) collocate negli appezza- (Foto V. Testi).
22
menti non hanno di fatto catturato
esemplari di questa cicalina.
Per identificare l’infezione, i singoli individui sono stati trattati per
estrarne il DNA, successivamente
sottoposto ad analisi tramite PCR.
Una prima amplificazione è stata
fatta utilizzando primers universali
(P1/P7) situati sulla sequenza codificante per la subunità ribosomale
Foto 12 – Trappola cromotropica (Foto 16S (Schneider et al., 1995; Deng e
Istituto di Entomologia e Patologia vegetale, Università Cattolica del Sacro Hiruki, 1991). I prodotti di amplificazione sono poi stati diluiti e sottoCuore).
posti a una seconda PCR (nestedPCR) utilizzando la coppia di primers R16(I)F1/R1, specifici per i fitoplasmi di gruppo I e XII (Lee et al., 1998).
Sui campioni positivi è stata effettuata un’ulteriore reazione di PCR,
impiegando i primers fTufAY/rTufAY specifici per il fitoplasma in esame
(Schneider et al., 1997) e i prodotti di amplificazione sono stati infine
digeriti con l’enzima di restrizione HpaII per caratterizzare i vari isolati (tipi “tuf”) secondo Langer e Maixner (2004).
Ogni anno, circa il 10-15% degli esemplari analizzati sono risultati
positivi alla presenza del patogeno. La caratterizzazione molecolare dei
sottogruppi tuf ha mostrato in tutti i casi una concordanza tra i fitoplasmi trovati negli insetti raccolti (tuf tipo “b”) e i fitoplasmi individuati
nelle piante di pomodoro con sintomi di Stolbur e in quelle di convolvolo presenti negli stessi ambienti.
Altre specie
Mediante sfalci con retino entomologico sono state catturate numerose altre specie di Rincoti. Il loro elenco e il numero di esemplari catturati è mostrato in figura 3.
Svariati esemplari sono stati analizzati insieme a quelli di H. obsoletus per ricercare la presenza di fitoplasmi, ed in particolare di quelli
del sottogruppo dello Stolbur (16SrXII-A). Tuttavia nessun esemplare
è mai risultato positivo all’analisi.
Conclusioni
In base ai dati raccolti nel corso del progetto, le analisi svolte sugli
insetti raccolti da appezzamenti di pomodoro nel Piacentino e nel
Parmense hanno confermato il probabile coinvolgimento di H. obsoletus nella trasmissione del fitoplasma dello Stolbur.
23
Solo esemplari appartenenti a questa specie sono, infatti, risultati
portatori del patogeno. Le analisi hanno dimostrato l’appartenenza di
tali fitoplasmi al sottogruppo tuf di tipo “b”, lo stesso che fino ad ora è
sempre stato identificato sia nelle piante di pomodoro, con chiari sintomi della malattia, sia in quelle di convolvolo e calistegia presenti
negli stessi ambienti (Mazzoni et al., 2008; Panini et al., 2011).
Infine, allo stato attuale delle conoscenze, non sarebbero coinvolte
altre specie di Rincoti nella trasmissione dello Stolbur dalle convolvulacee (C. arvensis e C. sepium) al pomodoro, non essendo stati trovati insetti diversi da H. obsoletus portatori del fitoplasma.
Figura 3 – Elenco dei Rincoti catturati nel corso del progetto (anni 2010-2012).
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COME PREVENIRE LA MALATTIA
Valentino Testi, Stefano Saccò, Bruno Chiusa,
Rino Credi, Emanuele Mazzoni
Premessa
Lo Stolbur del pomodoro, come gran parte delle malattie di origine
fitoplasmatica, è una patologia complessa la cui espressione epidemiologica, ed il relativo quadro sintomatologico, dipendono da molteplici
interazioni tra più soggetti (piante ospiti – fitoplasmi - piante serbatoio – vettori) a loro volta influenzate da altre variabili quali andamento
meteorologico, tecniche colturali e agronomiche, composizione della
flora infestante e dell’habitat circostante.
Questa complessità rende la fitopatia estremamente variabile, difficile da prevedere e quindi difficile da studiare, soprattutto su una coltivazione come il pomodoro che ha un ciclo relativamente breve e si
rinnova di anno in anno su terreni e ambienti diversi.
Negli ultimi anni la malattia si è manifestata in misura maggiore
nelle province di Parma e Piacenza, ma l’intensità e la localizzazione
delle infezioni è stata sempre diversa. Infatti, fino al 2010 la fitopatia
è risultata maggiormente dannosa in provincia di Parma, poi nel 2011
si è avuta una inversione di tendenza e nel 2012 la fitoplasmosi si è
manifestata poco in entrambi i territori, risentendo, presumibilmente,
delle eccezionali condizioni di caldo e siccità.
Prevenzione
Vista l’aleatorietà di questa avversità fitoplasmatica, il migliore
sistema di contenimento rimane la prevenzione. Pertanto, negli areali
più infetti dove la malattia si manifesta con maggiore frequenza, si
raccomanda di non coltivare pomodoro a ciclo tardivo nei terreni in
successione a prati stabili, nei quali la percentuale di piante infette può
arrivare fino all’80% del totale, ed in quelli posti nelle vicinanze di zone
incolte e canali.
Utile anche l’eliminazione delle piante di pomodoro alla comparsa
dei primi sintomi della malattia, al fine di abbassare la presenza di
focolai infettivi.
Fondamentale è l’attenta gestione del territorio, attraverso il contenimento delle piante spontanee e delle malerbe, soprattutto
Convolvulus arvensis e Calystegia sepium, che fungono da serbatoio
d’inoculo del patogeno e da ospiti degli stadi giovanili del vettore
25
Hyalesthes obsoletus. Risulta particolarmente efficace il controllo delle
suddette convolvulacee nelle coltivazioni di cereali che rientrano nella
rotazione aziendale.
Una lotta diretta contro i fitoplasmi non è possibile, per cui è importante ricorrere ad una gestione integrata dell’agroecosistema. Il materiale di propagazione deve essere sano. A questo riguardo si ribadisce
che l’analisi delle piantine, ottenute da seme prelevato da bacche
infette, evidenzia che il fitoplasma non si trasmette attraverso il seme.
Difesa
La lotta chimica ai vettori è efficace solo quando il vettore è infeudato alla coltura da difendere, come avviene per Scaphoideus titanus,
vettore della Flavescenza dorata della vite.
H. obsoletus, invece, è notevolmente polifago e visita occasionalmente le coltivazioni di pomodoro prediligendo la flora erbacea spontanea all’interno ed attorno ai campi coltivati. Inoltre, la malattia si
manifesta in modo improvviso e con situazioni epidemiologiche difficili da prevedere.
Ciò nonostante, si è voluto verificare con sperimentazioni di campo,
in areali frequentemente infetti, se uno o due trattamenti insetticidi
potessero influire sulla dinamica delle popolazioni dei vettori e sulla
trasmissione della malattia. Gli interventi sono stati posizionati nel
mese di giugno, mese che, nei vari monitoraggi effettuati, ha evidenziato il volo degli adulti di H. obsoletus.
Nel 2011 l’applicazione di uno o due trattamenti con insetticida neonicotinoide, eseguiti a metà e fine giugno, ha consentito di ridurre
significativamente l’incidenza della malattia nella tesi con il doppio
trattamento (1,5% di piante di pomodoro sintomatiche), mentre nella
tesi con un solo trattamento le piante colpite erano inferiori rispetto al
testimone non trattato (rispettivamente 2,6% e 3,9%), ma non in
modo statisticamente significativo.
Foto 13 e 14 – Campi di pomodoro in successione a prato stabile distrutti da Stolbur
nel 2010 a Parma e nel 2011 a Piacenza (Foto V. Testi).
26
Nel 2012 alle tesi “1 o 2 interventi con neonicotinoide”, eseguiti
nelle stesse epoche dell’anno precedente, si sono aggiunte le tesi “1 o
2 trattamenti con piretroide", ma la scarsa presenza della malattia non
ha consentito di ottenere differenze significative tra le diverse tesi e
solo il doppio intervento con neonicotinoide ha mostrato un’efficace
riduzione della malattia (1% di piante di pomodoro sintomatiche)
rispetto al testimone (4%).
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CONCLUSIONI
Anna Rosa Babini
L’attività di sperimentazione, oggetto del presente lavoro, ha permesso di approfondire le conoscenze sulla eziologia e sulla epidemiologia dell’avversità fitoplasmatica Stolbur che danneggia le coltivazioni di pomodoro a ciclo tardivo nelle province di Parma e Piacenza. Le
tecniche di diagnosi a base molecolare, oggi disponibili, rendono possibile l’accertamento dell’effettiva presenza del fitoplasma dello
Stolbur nelle piante con i caratteristici sintomi di nanismo, virescenza,
clorosi e accartocciamento fogliare. Tale agente infettivo è stato ritrovato e caratterizzato anche nelle infestanti convolvulacee Calystegia
sepium e Convolvulus arvensis che, in natura, fungono sia da sorgenti d’inoculo del fitoplasma che da ospiti per il principale insetto vettore, il cixiide Hyalesthes obsoletus. Le analisi molecolari hanno confermato la positività di questo insetto e, quindi, il suo probabile coinvolgimento nella trasmissione del fitoplasma dello Stolbur, a differenza di
esemplari di altre specie di Rincoti reperiti nelle stesse aree, ma risultati tutti negativi.
Il progetto finanziato dalla Regione Emilia Romagna (L.R. 28/98) ha
quindi consentito di individuare alcuni accorgimenti per prevenire la
diffusione della stessa: eliminazione delle convolvulacee infestanti;
appropriate rotazioni colturali; scelta di varietà a maturazione precoce
e media, evitando di coltivare le varietà tardive in successione a prati
stabili e/o nelle aree a maggior diffusione della patologia. Da approfondire ulteriormente l’utilità e l’eventuale efficacia degli interventi
insetticidi contro il vettore della malattia.
28
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Finito di stampare
nel mese di novembre 2012
Grafiche Lama - Piacenza
