Il rapido sviluppo della genetica molecolare registratosi negli ultimi

La Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR)
Fiorentino F.1,2
1 GENOMA - Laboratorio di Genetica Molecolare - via Po, 102 00198
ROMA
2 EmbryoGen – Centro di Diagnosi Genetica Preimpianto - via Po, 102
00198 ROMA
Il rapido sviluppo della genetica molecolare registratosi negli ultimi anni ha
determinato una vera e propria rivoluzione in campo diagnostico. La
scoperta della reazione polimerasica a catena o Polymerase Chain
Reaction (PCR), la procedura di amplificazione del DNA in vitro che
permette moltiplicare virtualmente all'infinito una sequenza specifica di
DNA, ha fornito un notevole contributo nella diagnosi di un numero
sempre maggiore di malattie genetiche. Soprattutto nel campo dei
disordini monofattoriali, cioè nelle sindromi causate dall'alterazione di un
singolo gene, come le talassemie, la fibrosi cistica, la distrofia muscolare e
le emoglobinopatie, le tecniche della biologia molecolare si sono rivelate
vincenti.
Il fattore più importante, rispetto alle tecniche tradizionali, è legato alla
possibilità di eseguire test di laboratorio precisi, affidabili e soprattutto
rapidi partendo da una minima quantità di materiale, a volte anche da una
singola cellula, come ad esempio avviene nella diagnosi genetica
preimpianto (PGD) a seguito di fecondazione assistita.
L’innovazione tecnologica apportata dall’introduzione delle strumentazioni
automatiche a tecnologia fluorescente ha ulteriormente incrementato la
sensibilità e la precisione della PCR (PCR Fluorescente) e di
conseguenza dei test genetici eseguiti con tale metodica, ma soprattutto
ha permesso di automatizzare l’intero processo analitico.
La PCR fluorescente è oggi applicata nella diagnosi della maggior parte
delle malattie genetiche, sia in fase prenatale che post-natale, che in
diagnosi genetica preimpianto.
La Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) in
diagnosi prenatale
La PCR fluorescente sta iniziando ad
affiancarsi alle tecniche
citogenetiche tradizionali come ausilio diagnostico rapido e mirato delle
più importanti aneuploidie fetali (cromosomi 21, 13, 18, X e Y), in
sostituzione della tecnica di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH)
(Cirigliano et al. 2001; Adinolfi et al. 2001). La metodica è basata
sull’amplificazione fluorescente (QF-PCR) di sequenze di DNA ripetute
altamente polimorfiche (Short Tandem Repeat - STR) localizzate sui
cromosomi oggetto di studio e successiva elettroforesi capillare. La QFPCR, eseguita su DNA estratto da cellule del liquido amniotico, villi coriali
e sangue fetale, permette di definire l’esatto assetto numerico dei
cromosomi presi in considerazione.
L’elettroforesi capillare viene eseguita mediante sequenziatore automatico
a tecnologia fluorescente, a seguito della quale per ciascun prodotto di
PCR vengono calcolate le dimensioni, l’altezza e l’area di ciascun picco
fluorescente. La verifica in termini qualitativi e quantitativi della
segregazione degli alleli parentali permette di poter evidenziare nel feto la
presenta di eventuali trisomie.
I tracciati che si ottengono, per ogni STR, in caso di un assetto
cromosomico normale sono 2 picchi di uguale area ed altezza. In caso di
trisomia si possono verificare 2 differenti situazioni: presenza di 3 picchi
per la trisomia triallelica o 2 picchi con rapporto aree 1:2 per la trisomia
diallelica. Per quanto riguarda i cromosomi sessuali viene impiegata una
sequenza relativa al gene dell’amelogenina. In questo caso un amplificato
con un solo picco indica un assetto cromosomico femminile (XX), mentre
uno con 2 picchi di differente dimensione un assetto maschile (XY).
L’impiego di più marcatori con un alto indice di eterozigosità per ciascun
cromosoma porta ad una frequenza molto bassa del pattern allelico non
informativo (unico picco) per tutti i loci investigati.
B
A
Figura 1: Tracciato elettroforetico di un feto con trisomia 21 (A) e un feto
normale per lo stesso cromosoma (B)
La valutazione molecolare delle aneuploidie rappresenta un utile supporto
diagnostico nei casi di fallimento della coltura cellulare, referti ecografici
dubbi
in
gravidanze
inoltrate,
riscontro
immediato
di
sindromi
polimalformative (es. triplodie), conferma di ITG per trisomie 13, 18, e 21.
Inoltre, i costi analitici contenuti della procedura permettono di poter offrire
ai pazienti un test diagnostico altrettanto affidabile come la FISH, ma
rispetto a quest’ultima molto meno costoso e, soprattutto, completamente
automatizzato.
Applicazione della PCR fluorescente in medicina della riproduzione
Il rapido sviluppo della genetica molecolare registratosi negli ultimi anni ha
interessato tutti i settori della biologia, compresa la Medicina della
Riproduzione. Con l'evolversi delle tecniche di fertilizzazione in vitro (IVF),
la Diagnosi Genetica Preimpianto (PGD) si è proposta come una nuova
metodologia intesa ad identificare, prima dell'impianto in utero, la
presenza
di
malattie
genetiche
o
di
alterazione
cromosomiche
nell'embrione generato in vitro da coppie ad elevato rischio riproduttivo. La
possibilità di diagnosticare una malattia genetica nell’embrione, prima
dell’impianto, evita così il ricorso all’interruzione di gravidanza terapeutica,
spesso devastante dal punto di vista psicologico e non sempre accettata
dal punto di vista etico/ morale.
Un'applicazione della PCR fluorescente che, già allo stato attuale,
annovera una buona casistica riguarda la PGD delle aneuploidie. Lo
studio dell'assetto cromosomico dell'embrione ha una duplice finalità:
ridurre il rischio di trasferimento di embrioni con alterazioni cromosomiche
e aumentare le possibilità di gravidanza in gruppi di pazienti caratterizzati
da una performance riproduttiva ridotta. La PCR fluorescente è stata
inoltre applicata alla diagnosi genetica preimpianto di malattie ereditarie
quali Beta-Talassemia, Anemia Falciforme, Emofilia A e B, Distrofia
Muscolare di Duchenne-Becker, Distrofia Miotonica, Fibrosi Cistica, Atrofia
Muscolare Spinale (SMA), Sindrome di Lesch-Nyhan, Malattia di CharcotMarie-Tooth (Fiorentino et al. 2003). Recenti applicazioni della PCR
fluorescente in PGD prevedono la diagnosi di mutazioni associate alla
predisposizione ereditaria a malattie ad insorgenza tardiva,
quali per
esempio la malattia di Huntington o l’Alzheimer (Kuliev A and Verlinsky Y.
2002).
Applicazione
della
PCR
fluorescente
nella
diagnosi
genetica
preimpianto di malattie genetiche in combinazione con tipizzazione
dell’HLA
La tipizzazione dell’HLA in fase preimpianto, si è recentemente proposta
quale strumento per coppie con un figlio malato di una malattia genetica,
la cui cura necessita il trapianto di cellule staminali da un soggetto
compatibile (Verlinsky et al. 2001). In questi casi la PGD rappresenta una
strategia che consente di individuare e trasferire embrioni che saranno,
contemporaneamente, privi di mutazioni e HLA compatibili con il figlio
malato. La genotipizzazione dell’HLA viene effettuata mediante una
specifica amplificazione da singola cellula delle regioni di Classe I e II del
complesso HLA. Inoltre si effettua una PCR fluorescente multipla di
regioni STR altamente polimorfiche, distribuite lungo l’intera regione HLA,
per la determinazione dell’aplotipo dell’embrione in esame, nonché per la
D6S625
D6S510
STR Haplotyping
D6S276
A
Child
B
HLA Identical
Blastomere
C
HLA not identical
Blastomere
Figura 2: Comparazione degli aplotipi STR ottenuti dal soggetto
affetto e due blastomeri prelevati a due embrioni differenti, uno
risultato HLA identico (B) e l’altro HLA non-identico (C).
valutazione di eventuali eventi di ricombinazione e di allele drop-out
(ADO). La determinazione dell’identità della regione HLA tra il soggetto
affetto e gli embrioni viene effettuata operando un doppio confronto tra gli
aplotipi STR e tra gli specifici genotipi delle regioni di classe I e II.
E' prevedibile che nei prossimi anni sia dato un impulso sempre maggiore
a questa tecnologia, sia in ambito della diagnosi diagnosi prenatale che
della medicina della riproduzione.
Bibliografia
Adinolfi M, Sherlock J. Prenatal detection of chromosome disorders by
QF-PCR. Lancet 2001; 358:1030-1031
Cirigliano V, Ejarque M, Canadas MP, Lloveras E, Plaja A, Perez MM,
Fuster C, Egozcue J. Clinical application of multiplex quantitative
fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) for the rapid prenatal
detection of common chromosome aneuploidies. Mol Hum Reprod. 2001
7:1001-1006.
Fiorentino F, Magli MC, Podini D, Ferraretti AP, Nuccitelli A, Vitale N, Baldi
M, Gianaroli L. The minisequencing method: an alternative strategy for
preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders. Mol Hum
Reprod. 2003 9:399-410.
Kuliev A and Verlinsky Y. 2002 Current features of preimplantation genetic
diagnosis. Reprod Biomed Online. 5, 294-299
Verlinsky
Y,
Rechitsky
S,
Schoolcraft
W,
Strom
C,
Kuliev
A.
Preimplantation diagnosis for Fanconi anemia combined with HLA
matching. JAMA. 2001 285:3130-3133.