La Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) Fiorentino F.1,2 1 GENOMA - Laboratorio di Genetica Molecolare - via Po, 102 00198 ROMA 2 EmbryoGen – Centro di Diagnosi Genetica Preimpianto - via Po, 102 00198 ROMA Il rapido sviluppo della genetica molecolare registratosi negli ultimi anni ha determinato una vera e propria rivoluzione in campo diagnostico. La scoperta della reazione polimerasica a catena o Polymerase Chain Reaction (PCR), la procedura di amplificazione del DNA in vitro che permette moltiplicare virtualmente all'infinito una sequenza specifica di DNA, ha fornito un notevole contributo nella diagnosi di un numero sempre maggiore di malattie genetiche. Soprattutto nel campo dei disordini monofattoriali, cioè nelle sindromi causate dall'alterazione di un singolo gene, come le talassemie, la fibrosi cistica, la distrofia muscolare e le emoglobinopatie, le tecniche della biologia molecolare si sono rivelate vincenti. Il fattore più importante, rispetto alle tecniche tradizionali, è legato alla possibilità di eseguire test di laboratorio precisi, affidabili e soprattutto rapidi partendo da una minima quantità di materiale, a volte anche da una singola cellula, come ad esempio avviene nella diagnosi genetica preimpianto (PGD) a seguito di fecondazione assistita. L’innovazione tecnologica apportata dall’introduzione delle strumentazioni automatiche a tecnologia fluorescente ha ulteriormente incrementato la sensibilità e la precisione della PCR (PCR Fluorescente) e di conseguenza dei test genetici eseguiti con tale metodica, ma soprattutto ha permesso di automatizzare l’intero processo analitico. La PCR fluorescente è oggi applicata nella diagnosi della maggior parte delle malattie genetiche, sia in fase prenatale che post-natale, che in diagnosi genetica preimpianto. La Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) in diagnosi prenatale La PCR fluorescente sta iniziando ad affiancarsi alle tecniche citogenetiche tradizionali come ausilio diagnostico rapido e mirato delle più importanti aneuploidie fetali (cromosomi 21, 13, 18, X e Y), in sostituzione della tecnica di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH) (Cirigliano et al. 2001; Adinolfi et al. 2001). La metodica è basata sull’amplificazione fluorescente (QF-PCR) di sequenze di DNA ripetute altamente polimorfiche (Short Tandem Repeat - STR) localizzate sui cromosomi oggetto di studio e successiva elettroforesi capillare. La QFPCR, eseguita su DNA estratto da cellule del liquido amniotico, villi coriali e sangue fetale, permette di definire l’esatto assetto numerico dei cromosomi presi in considerazione. L’elettroforesi capillare viene eseguita mediante sequenziatore automatico a tecnologia fluorescente, a seguito della quale per ciascun prodotto di PCR vengono calcolate le dimensioni, l’altezza e l’area di ciascun picco fluorescente. La verifica in termini qualitativi e quantitativi della segregazione degli alleli parentali permette di poter evidenziare nel feto la presenta di eventuali trisomie. I tracciati che si ottengono, per ogni STR, in caso di un assetto cromosomico normale sono 2 picchi di uguale area ed altezza. In caso di trisomia si possono verificare 2 differenti situazioni: presenza di 3 picchi per la trisomia triallelica o 2 picchi con rapporto aree 1:2 per la trisomia diallelica. Per quanto riguarda i cromosomi sessuali viene impiegata una sequenza relativa al gene dell’amelogenina. In questo caso un amplificato con un solo picco indica un assetto cromosomico femminile (XX), mentre uno con 2 picchi di differente dimensione un assetto maschile (XY). L’impiego di più marcatori con un alto indice di eterozigosità per ciascun cromosoma porta ad una frequenza molto bassa del pattern allelico non informativo (unico picco) per tutti i loci investigati. B A Figura 1: Tracciato elettroforetico di un feto con trisomia 21 (A) e un feto normale per lo stesso cromosoma (B) La valutazione molecolare delle aneuploidie rappresenta un utile supporto diagnostico nei casi di fallimento della coltura cellulare, referti ecografici dubbi in gravidanze inoltrate, riscontro immediato di sindromi polimalformative (es. triplodie), conferma di ITG per trisomie 13, 18, e 21. Inoltre, i costi analitici contenuti della procedura permettono di poter offrire ai pazienti un test diagnostico altrettanto affidabile come la FISH, ma rispetto a quest’ultima molto meno costoso e, soprattutto, completamente automatizzato. Applicazione della PCR fluorescente in medicina della riproduzione Il rapido sviluppo della genetica molecolare registratosi negli ultimi anni ha interessato tutti i settori della biologia, compresa la Medicina della Riproduzione. Con l'evolversi delle tecniche di fertilizzazione in vitro (IVF), la Diagnosi Genetica Preimpianto (PGD) si è proposta come una nuova metodologia intesa ad identificare, prima dell'impianto in utero, la presenza di malattie genetiche o di alterazione cromosomiche nell'embrione generato in vitro da coppie ad elevato rischio riproduttivo. La possibilità di diagnosticare una malattia genetica nell’embrione, prima dell’impianto, evita così il ricorso all’interruzione di gravidanza terapeutica, spesso devastante dal punto di vista psicologico e non sempre accettata dal punto di vista etico/ morale. Un'applicazione della PCR fluorescente che, già allo stato attuale, annovera una buona casistica riguarda la PGD delle aneuploidie. Lo studio dell'assetto cromosomico dell'embrione ha una duplice finalità: ridurre il rischio di trasferimento di embrioni con alterazioni cromosomiche e aumentare le possibilità di gravidanza in gruppi di pazienti caratterizzati da una performance riproduttiva ridotta. La PCR fluorescente è stata inoltre applicata alla diagnosi genetica preimpianto di malattie ereditarie quali Beta-Talassemia, Anemia Falciforme, Emofilia A e B, Distrofia Muscolare di Duchenne-Becker, Distrofia Miotonica, Fibrosi Cistica, Atrofia Muscolare Spinale (SMA), Sindrome di Lesch-Nyhan, Malattia di CharcotMarie-Tooth (Fiorentino et al. 2003). Recenti applicazioni della PCR fluorescente in PGD prevedono la diagnosi di mutazioni associate alla predisposizione ereditaria a malattie ad insorgenza tardiva, quali per esempio la malattia di Huntington o l’Alzheimer (Kuliev A and Verlinsky Y. 2002). Applicazione della PCR fluorescente nella diagnosi genetica preimpianto di malattie genetiche in combinazione con tipizzazione dell’HLA La tipizzazione dell’HLA in fase preimpianto, si è recentemente proposta quale strumento per coppie con un figlio malato di una malattia genetica, la cui cura necessita il trapianto di cellule staminali da un soggetto compatibile (Verlinsky et al. 2001). In questi casi la PGD rappresenta una strategia che consente di individuare e trasferire embrioni che saranno, contemporaneamente, privi di mutazioni e HLA compatibili con il figlio malato. La genotipizzazione dell’HLA viene effettuata mediante una specifica amplificazione da singola cellula delle regioni di Classe I e II del complesso HLA. Inoltre si effettua una PCR fluorescente multipla di regioni STR altamente polimorfiche, distribuite lungo l’intera regione HLA, per la determinazione dell’aplotipo dell’embrione in esame, nonché per la D6S625 D6S510 STR Haplotyping D6S276 A Child B HLA Identical Blastomere C HLA not identical Blastomere Figura 2: Comparazione degli aplotipi STR ottenuti dal soggetto affetto e due blastomeri prelevati a due embrioni differenti, uno risultato HLA identico (B) e l’altro HLA non-identico (C). valutazione di eventuali eventi di ricombinazione e di allele drop-out (ADO). La determinazione dell’identità della regione HLA tra il soggetto affetto e gli embrioni viene effettuata operando un doppio confronto tra gli aplotipi STR e tra gli specifici genotipi delle regioni di classe I e II. E' prevedibile che nei prossimi anni sia dato un impulso sempre maggiore a questa tecnologia, sia in ambito della diagnosi diagnosi prenatale che della medicina della riproduzione. Bibliografia Adinolfi M, Sherlock J. Prenatal detection of chromosome disorders by QF-PCR. Lancet 2001; 358:1030-1031 Cirigliano V, Ejarque M, Canadas MP, Lloveras E, Plaja A, Perez MM, Fuster C, Egozcue J. Clinical application of multiplex quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) for the rapid prenatal detection of common chromosome aneuploidies. Mol Hum Reprod. 2001 7:1001-1006. Fiorentino F, Magli MC, Podini D, Ferraretti AP, Nuccitelli A, Vitale N, Baldi M, Gianaroli L. The minisequencing method: an alternative strategy for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders. Mol Hum Reprod. 2003 9:399-410. Kuliev A and Verlinsky Y. 2002 Current features of preimplantation genetic diagnosis. Reprod Biomed Online. 5, 294-299 Verlinsky Y, Rechitsky S, Schoolcraft W, Strom C, Kuliev A. Preimplantation diagnosis for Fanconi anemia combined with HLA matching. JAMA. 2001 285:3130-3133.