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Studi di safety non sono necessari per:
- prodotti per uso topico (cutanea, oculare) quando la farmacologia del principio attivo è ben
caratterizzata e la esposizione sistemica o la distribuzione negli altri organi sia bassa;
- prodotti citotossici per pazienti terminali; ad eccezione di quelle con nuovo meccanismo
d’azione in cui è opportuno fare studi di safety;
- prodotti biotecnologici con elevata specificità recettoriale come gli anticorpi (è sufficiente
la valutazione farmacodinamica e tossicologica);
- prodotti biotecnologici con bassa specificità recettoriale e/o rappresentanti una nuova
classe terapeutica: considerare studi di safety;
- nuove formulazioni di sali con farmacocinetica e farmacodinamica similari.
172
173
Test dei canali hERG
hERG è una proteina che costituisce i canali ionici per lo ione K+, nelle cellule miocardiche, i
quali sono critici nella fase di ripolarizzazione delle membrane cellullari miocardiche.
Disfunzioni
di
questa
proteina
inducono
un’allungamento
del
segmento
QT
dell’elettrocardiogramma e danno luogo alla sindrome del QT lungo caratterizzata da una
ritardata ripolarizzazione delle cellule miocardiche che induce anomalia cardiaca associata a
fibrillazione ventricolare, sincope e morte improvvisa. Alcuni farmaci possono indurre come
effetto collaterale questa sindrome letale come per esempio gli antiarrhythmici della Classe
IA e III. Nuove molecole che potrebbero diventare futuri farmaci potrebbe dar luogo ad
effetti collaterali letali come la sindrome del QT, quindi si effettua il test hERG.
174
Metodica del test dei canali di hERG.
175
Gli studi tossicologici hanno lo scopo di evidenziare i limiti di tossicità del farmaco e di
prevedere i suoi eventuali effetti dannosi o indesiderabili alle condizioni di impiego previste
nell’uomo.
Principali risposte che la tossicologia deve fornire:
1) Definire
• la minima dose tossica
• la massima dose non tossica
• la relazione tra dose terapeutica e dose tossica
•le caratteristiche degli effetti tossici del farmaco e dei suoi metaboliti
2) Individuare
• la struttura cellulare, l’organo o il sistema bersaglio
3) Stabilire
• la reversibilità o meno degli effetti tossici
• le differenze legate al sesso
Studi di tossicita’ acuta
DEFINIZIONE: “Effetti collaterali insorgenti dopo “breve” tempo dall’assunzione di una dose
singola di sostanza assunta nell’arco di 24 ore”
Somministrazione unica (acuta) del principio attivo su due o più specie di mammiferi.
Dosi somministrate:
- ci si riferisce a parametri già noti quando possibile
- se si tratta di una sostanza non nota o complessa si procede per tentativi
Vie di somministrazione: due diverse vie di somministrazione una delle quali identica o simile a
quella proposta nell’uomo, mentre l’altra deve garantire il completo assorbimento sistemico del
farmaco (e.v).
Range di dosi: che assicuri la comparsa di effetti tossici.
Periodo di osservazione: 14 giorni o fino a quando persistono i segni di tossicità.
Durata dello studio: è circa 14 gg e comunque mai inferiore a 7 gg e può proseguire per tutto il
tempo in cui persistono gli effetti tossici.
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Il periodo di osservazione deve essere adeguato a mettere in luce i danni ai tessuti e agli
organi, oppure il ritorno alla norma delle condizioni dell’animale.
Determinazioni:
- segni clinici di tossicità
- mortalità a determinati intervalli
- esame autoptico degli animali deceduti e di quelli sacrificati
- esame istopatologico degli organi
Finalità del test: ottenere dati su relazione dose/effetto e dose/mortalità per la valutazione
quantitativa della:
DOSE LETALE 10 (DL10) o MASSIMA DOSE TOLLERATA (MTD)
DL10 = quantità di farmaco, in unità di peso o volume per unità di peso corporeo (es mg/Kg),
che somministrata ad un gruppo di animali per una determinata via ed in definite condizioni
sperimentali, produce la morte del 10% degli animali. E’ definita anche come la massima dose
tollerata (maximum tolerated dose).
Quest’ultima è usata negli studi antitumorali, per calcolare la Mouse Equivalent Lethal Dose
utilizzata per trovare la prima dose da usare negli studi clinici di fase I degli antitumorali.
Per motivi etici la determinazione della Dose Letale 50% è stata sostituita da MTD (maximum
tollerable dose).
Studi di tossicita’ ripetuta
DEFINIZIONE: “Effetti collaterali insorgenti dopo l’assunzione di almeno 3 dosi della
sostanza (SUBACUTA) o dopo somministrazioni ripetute (CRONICA)”.
Subacuta: fino a 3 mesi
• Subcronica: fino a 6 mesi
• Cronica: oltre 6 mesi
• Valuta le alterazioni funzionali e/o anatomo-patologiche conseguenti alla somministrazione
ripetuta del farmaco, le eventuali differenze dovute al sesso/specie e la tendenza o meno ad
un accumulo.
• Il grado di purezza del farmaco non deve essere maggiore di quello che sarà
commercializzato.
• Due specie di mammiferi, entrambi i sessi, stessa numerosità, selezionate sulla base della
somiglianza all’uomo per gli aspetti farmacodinamici e metabolici relativi al composto da
saggiare.
• La via di somministrazione è quella prevista in terapia.
• Trattamento per 28 giorni che serve ad individuare le dosi da utilizzare.
• Tre livelli di dose: la dose bassa deve essere sufficiente a produrre un effetto
farmacodinamico, la dose alta deve provocare effetti tossici (a non più del 10% degli animali),
la dose intermedia è la media geometrica tra le due. Poi si aggiunge un gruppo di controllo
(animali non trattati).
• Le prove di tossicità per somministrazioni ripetute devono mettere in evidenza le soglie di
tossicità, le alterazioni funzionali e/o anatomo-patologiche conseguenti alla somministrazione
ripetuta del farmaco o dell’associazione e stabilire le condizioni della comparsa di tali
alterazioni in funzione della posologia.
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• La valutazione degli effetti tossici viene effettuata in base al rilievo della mortalità,
all’esame del comportamento, dell’accrescimento, della crasi ematica e di prove funzionali a
carico di diversi organi (cuore, fegato, rene, milza etc.) nonché in base a reperti autoptici con
relativi esami istologici.
VIE DI SOMMINISTRAZIONE: quella che sarà usata nell’uomo
• Orale
• Inalatoria
• Dermica
DETERMINAZIONI:
• Comportamento e stato di salute dell’animale (peso corporeo, consumo di cibo, test
comportamentali)
• Parametri ematologici, biochimici ed urinari
• Peso degli organi e valutazioni istopatologici
FINALITA’ DEI TEST SUBCRONICI O CRONICI:
• stabilire il NOAEL o no-observed-adverse-effect level ovvero la dose che non induce
nessun effetto nella specie animale presa in esame per poi calcolare la dose iniziale per la
prima somministrazione clinica negli studi di fase I (escluso antitumorali che richiedono
MTD).
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Calcolo della prima dose per studi clinici nell’uomo
NOAEL
= HED (human equivalent dose)
fattore di conversione (BSA)
HED/fattore di sicurezza = starting dose o prima dose per studi clinici
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Tests di mutagenesi
Altri studi da effettuare sono quelli di mutagenesi che riguardano gli effetti indotti
dall’impatto di un composto nuovo sul patrimonio genetico.
• Con il test di Ames si evidenziano mutazioni puntiformi in procarioti (ceppi di Salmonella
thyphimurium e di Escherichia coli).
• Con il test di aberrazioni cromosomiche su linfociti umani si valuta l’effetto clastogeno
(addizione, riarrangiamento di cromosomi) della molecola in studio sui cromosomi.
• Il test del mouse lymphoma (preferito in USA) ha due end points: valutazione
dell’induzione di mutazioni geniche + effetto clastogeno (= mutazioni più estese o rotture del
DNA). Una sostanza mutagena è potenzialmente responsabile dell’induzione di cancerogenesi
e/o di malformazioni fetali.
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Tests di mutagenesi indicati dalle guideline dell’EMEA
Test di Ames
E’ un test di mutagenesi in vitro ampiamente utilizzato per determinare se un composto è
carcinogeno o mutante ovvero in grado di indurre una mutazione revertente in un
microrganismo come ceppi mutati di Salmonella thiphymurium. La mutazione impedisce loro di
poter sintetizzare l'amminoacido istidina che è uno dei 20 amminoacidi utilizzati dalle cellule
per costruire le proteine. I microorganismi vengono fatti crescere in un terreno di coltura
dove l'istidina è presente in quantità limitanti (vi è abbastanza istidina da permettere solo un
certo numero di divisioni cellulari). Quindi lo scopo del test è di appurare se un composto con
sospetta attività mutagena possa indurre mutazioni in grado di invertire la mutazione che
rende impossibile al microrganismo di sintetizzare l'istidina. Quindi se la sostanza che si
ritiene cancerogena, rende il microorganismo capace di poter sintetizzare nuovamente
l'istidina (proliferazione esponenziale della colonia), viene considerata mutagena.
Si prepara una coltura per ogni mutageno che si vuole analizzare e si effettua anche un
controllo con una sostanza neutra. Inoltre viene introdotto nel terreno di coltura un estratto
di fegato di ratto in modo tale da poter favorire la metabolizzazione e la trasformazione, ad
opera degli enzimi del fegato, di sostanze pro-carcinogene in carcinogene. Ci sono proprietà
aggiuntive nei batteri utilizzati per il test di Ames: hanno una mutazione aggiuntiva che rende
la membrana esterna facilmente permeabile alle grandi molecole da saggiare e hanno una
mutazione che elimina alcuni meccanismi di riparazione del DNA.
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Proliferazione delle colonie poiché l’agente saggiato è mutageno ed
ha invertito la mutazione dei ceppi batterici
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Mouse lymphoma assay
The mouse lymphoma TK assay is part of an in vitro battery of tests designed to predict risk
assessment prior to in vivo testing.
The test has the potential to detect mutagenic and clastogenic events at the thymidine
kinase (tk) locus of L5178Y mouse lymphoma tk (+/-) cells by measuring resistance to the
lethal nucleoside analogue triflurothymidine (TFT).
Cells may be plated for viability and mutation in semi-solid agar (agar assay) or in 96-well
microtitre plates. When added to selective medium containing TFT, wild-type tk (+/-) cells
die, but TFT cannot be incorporated into the DNA of mutant tk (-/-) cells, which survive to
form colonies that may be large (indicative of gene mutation) or small (indicative of
chromosomal mutation) in nature. Mutant frequency is expressed as the number of mutants
per 106 viable cells.
Test dei micronuclei (procedura OECD N. 474)
E’ un test di mutagenesi che consente di osservare eventuali errori che avvengono durante la
mitosi, causati da agenti mutageni, sia in vitro che in vivo. In questo caso descriviamo la
metodica in vivo.
Consiste nel prelevare, 24-36h dopo il trattamento con sostanza mutagena in esame, da un
organismo (topo o ratto), cellule (eritrociti) durante la mitosi, e osservarne un discreto
numero (almeno un centinaio) al microscopio, dopo aver effettuato una colorazione
differenziale che evidenzi il materiale genetico: in caso di errori (provocati dal mutageno),
sono visibili, oltre al nucleo, frammenti di DNA sparsi per il citoplasma (chiamati micronuclei)
che non sono stati incorporati nel nucleo principale durante le ultime fasi della divisione
cellulare.
Tali alterazioni sono morfologicamente identici a quelli normali ma di dimensioni notevolmente
ridotte che non superano un terzo delle dimensioni del nucleo principale. Effettuando
un'analisi statistica sui risultati ottenuti (confrontandoli con un controllo costituito da un
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organismo non sottoposto al mutageno) è possibile determinare l'effetto della sostanza
mutagena, quindi dedurre se la sostanza in oggetto di studio, è una sostanza clastogena.
Nelle cellule del midollo osseo si evidenzia la formazione di micronuclei sparsi nel citoplasma.
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Studi tossicologici sulla riproduzione
OBIETTIVI: valutazione dell’effetto tossico della sostanza in esame sulle varie fasi della
riproduzione.
Mettere in rilievo le modifiche della fertilità o procreazione anomala dovuta a danni dei
gameti maschili e o femminili
Interferenze con le fasi di impianto del feto e del suo sviluppo
Effetti tossici sull’embrione
Effetti tossici sul feto (teratogenesi)
Interferenze con il parto
Effetti sullo sviluppo postnatale
Effetti tardivi sulla discendenza
ANIMALI UTILIZZATI: 2 specie animali
MODALITA’: somministrazione del composto a maschi e femmine prima dell’accoppiamento,
durante la gravidanza e l’allattamento. Viene seguito lo sviluppo dei nuovi nati fino al loro
nuovo accoppiamento per giungere ad una successiva generazione
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Studi di cancerogenicità
OBIETTIVI:
- Registrare l’incidenza dei tumori soprattutto quelli che colpiscono determinati tessuti.
- Registrare il periodo di latenza prima della loro manifestazione
DURATA DEGLI STUDI:
dai 18 mesi (per il topo) ai 24 mesi (per il ratto).
ANIMALI UTILIZZATI:
• due specie animali somministrando il farmaco per la stessa via proposta per l’uomo.
• gruppi sperimentali di almeno 100 animali per livello di dose e gruppo di controllo
(sacrificio di animali ai diversi end points) oppure studi con microPET con esiguo numero di
animali.
SCELTA DELLE DOSI:
La dose massima deve esercitare un minimo effetto tossico (riduzione del peso corporeo del
10% o dose massima tollerata o MTD) oppure una tossicità minima a livello di un organo
bersaglio.
La dose minima deve produrre un effetto farmacologico ma non tossico nell’animale.
La dose intermedia è la media tra la massima e la minima
Analisi con MicroPET
Limiti delle prove precliniche
Tempi e costi: l’impiego di animali è costoso e richiede tempo.
Animali: l’utilizzo di animali purtroppo è indispensabile poiché i studi in vitro non
rappresentano la realtà e quindi sono indicati per capire i meccanismi d’azione dei farmaci ma
non sono sufficienti per stabilire il profilo farmacologico e tossicologico di una nuova
molecola.
Dati di tossicita’ non completamente attendibili: a volte si possono presentare effetti
avversi in una specie animale che non trova conferma negli studi sull’uomo. Comunque
considerando che tra uomo e ratto c’è 80% di omologia dei geni, gli studi di tossicità negli
animali riproducono in maniera piuttosto attendibile quello che può avvenire nell’uomo.
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