Scuola di Scienze del Farmaco e dei Prodotti della Salute Materiale

Scuola di Scienze del Farmaco e dei Prodotti della Salute
Materiale Didattico di:
Metodi Fisici in Chimica Organica
Risonanza Magnetica Nucleare Protonica (1H NMR)
(prof. Adriano Pizzabiocca*)
* Via S. Agostino 1, 62032 Camerino, MC, Italy
Tel. Studio 0737 402281, Cellulare 3204281986, Fax 0737 4281986
e.mail: [email protected]
1. INTRODUZIONE
Il fenomeno della NMR (Nuclear Magnetic Resonance) trae origine dal fatto che certi
nuclei posti in un campo magnetico sono in grado di assorbire radiazioni
elettromagnetiche che cadono nella regione delle onde radio dello spettro.
Tutti i tipi di spettroscopia danno spettri che possono essere descritti in funzione
della:
- frequenza
- intensità
- forma delle linee spettrali o bande
Queste proprietà osservabili dipendono dai parametri molecolari del sistema che per
l’NMR sono:
 Le costanti di schermo (chemical shift o spostamento chimico)
 Le costanti di accoppiamento dei nuclei
 I tempi di vita dei livelli energetici
Cenni Storici
Scoperta indipendentemente nel 1946 dai fisici Felix Bloch (1905-1983) ed Edward
Purcell (1912-1997), per cui ricevettero il Premio Nobel per la fisica nel 1952, tra il
1950 e il 1970 venne utilizzata primariamente nell'analisi della chimica molecolare e
della struttura dei materiali.
Nel 1971 Raymond Vahan Damadian descrive come tumori e tessuti sani si
comportino in maniera differente all'RMN. Egli suggerì che queste differenze potessero
venire utilizzate per la diagnosi del cancro.
Nel 1972, sfruttando i progressi matematici per la ricostruzione delle immagini, basati
sulla trasformata di Fourier, Lauterbur associò lo studio di risonanza, fino ad allora
utilizzato nell’osservazione di macromolecole chimiche, a distretti anatomici.
E’ evidente, che noi chimici, utilizzeremo principalmente questa tecnica per la
determinazione della struttura dei composti organici.
Infatti, la spettroscopia NMR serve per individuare lo scheletro carbonio-idrogeno dei
composti organici.
Rispetto alle tecniche strumentali quali IR, UV e Massa la spettroscopia NMR è
sicuramente più valida in quanto essa non solo rende possibile identificare le funzioni su
uno specifico carbonio, ma fornisce anche informazioni sui carboni vicini. In molti casi
la spettroscopia NMR permette di determinare completamente la struttura della
molecola.
2
Nessun corso universitario, quindi, può definirsi completo se non include una
trattazione dei principi fondamentali della risonanza magnetica nucleare.
La nostra attenzione sarà dedicata esclusivamente alla risonanza magnetica nucleare
di sistemi liquidi o in soluzione.
Per descrivere correttamente tutti i fenomeni NMR dovrebbe essere utilizzato il
formalismo della meccanica quantistica, ma per quanto riguarda sistemi microscopici a
spin 1/2 tutte le predizioni del modello classico sono in accordo con quelle della teoria
quantistica, permettendo una trattazione più semplice del soggetto.
Abbiamo visto che gli elettroni sono particelle cariche in rotazione, con due stati di
spin permessi: +1/2 e -1/2. Alcuni nuclei hanno anch’essi stati di spin permessi +1/2 e
-1/2, e questa proprietà rende possibile il loro studio NMR.
Nonostante, come abbiamo detto, cercheremo di semplificare i possibili trattamenti
matematici alcune considerazioni di meccanica quantistica sono d’obbligo.
2. Quantizzazione del momento angolare
Nel modo classico di rappresentare un atomo il nucleo viene raffigurato come una
sfera in rotazione lungo un asse. Questo comporta che i nuclei posseggono un momento
angolare P.
Il momento angolare è un’importante grandezza fisica, legata alle rotazioni spaziali, è
infatti la quantità che si conserva se un sistema fisico è invariante sotto rotazioni. In altri
termini costituisce l’equivalente per le rotazioni spaziali della quantità di moto per le
traslazioni.
In parole povere il momento angolare misura la tendenza di un corpo che ruota a
persistere nel suo moto circolare. Esso dipende dalla massa e dalla velocità.
Uno dei postulati fondamentali della moderna chimica-fisica afferma che il momento
angolare totale di una qualsiasi particella isolata non può assumere valori arbitrari, ma
soltanto certi valori discreti, per questo si dice quantizzato e la sua grandezza, P, può
essere espressa in funzione di un numero quantico I per mezzo dell’equazione:
3
I (I+1)
P=
h/2
(Eq. 1)
Dove h è la costante di Planck ed I è il numero quantico del momento angolare,
solitamente indicato come spin nucleare. Il momento angolare è una vera e propria
grandezza vettoriale e per descriverlo completamente bisogna specificarne sia la
direzione che il modulo.
In termini quantomeccanici ciò si ottiene ricorrendo ad un altro numero quantico M,
tale che la grandezza della componente del momento angolare, Pz, lungo la direzione
considerata (z) sia data dall’equazione seguente:
Pz = M h/2
Naturalmente i numeri quantici che specificano un modulo di un vettore devono
essere positivi. Invece poiché la componente di un vettore non può essere più grande del
vettore stesso, IM I deve essere uguale o minore di I, ma M può essere positivo o
negativo. Infatti la meccanica quantistica dimostra che i valori permessi di M sono:
M = I, I-1, I-2,……-I
cioè 2I +1 valori possibili di M, questo significa che il momento angolare P, non può
orientarsi in una qualsiasi direzione, ma solo in quelle definite con i numeri quantici M
da +I a -I in step di 1.
z
(A)
z
(B)
M=0
[I (

M = -1
P=
2
h
Pz = M . h/2
I+
1)] 1
/2
M = +1
cos  = M/ h [I (I+1)]1/2
Vettori momento angolare
(A) caso generale in cui si illustra l'uso dei numeri quantici I ed M
(B) orientamenti possibili di un vettore momento angolare di numero quantico I =1
Si noti che I ed M non specificano affatto la direzione nel piano xy
4
3. Spin nucleare ed elettronico
Le transizioni tra i livelli energetici di spin nucleare danno origine al fenomeno della
risonanza magnetica nucleare, la corrispondente proprietà dello spin degli elettroni dà
luogo alla risonanza di spin elettronico [Electron Spin Resonance (ESR)]
Il concetto di spin dell’elettrone è familiare agli studenti di chimica dei primi anni,
dato che la struttura della tavola periodica può essere spiegata sulla base di quattro
numeri quantici elettronici: n, l, ml e ms, dove l’ultimo è il numero quantico
direzionale di spin.
L’ipotesi che gli elettroni possiedono un momento angolare dovuto ad un moto di
rotazione su se stessi fu avanzata per la prima volta nel 1925 per spiegare sia la struttura
fine delle bande osservate negli spettri atomici sia l’effetto di un campo magnetico su
tali spettri (effetto Zeeman anomalo). Lo spin dell’elettrone, inoltre, deriva come una
conseguenza naturale dei principi della meccanica ondulatoria relativistica.
Il numero quantico di spin di un singolo elettrone è s = 1/2 ed il momento angolare
associato è (3/4)1/2 h/2 (vedi Eq. 1). I valori possibili del numero quantico direzionale,
ms, sono pertanto +1/2 e -1/2. Questa conclusione è contenuta nel principio di
esclusione di Pauli che dice, secondo uno dei modi di esprimerlo, che soltanto
due
elettroni
(ms = +1/2 e -1/2) possono occupare un orbitale elettronico
caratterizzato dai numeri quantici n, l e ml.
Lo spin nucleare fu introdotto per la prima volta da Pauli nel 1924, un anno prima che
venisse avanzata l’idea dello spin elettronico, per spiegare la presenza di ulteriori
separazioni negli spettri atomico (struttura iperfine).
Questa separazioni dimostrano che nuclei di elementi differenti (e isotopi dello stesso
elemento) differiscono per il momento angolare di spin. Questo fatto si può far risalire
alle proprietà della struttura interna dei nuclei. Il protone ed il neutrone hanno numero
quantico di spin, I, di 1/2. Nei nuclei diversi di 1H i momenti angolari di spin dei singoli
nucleoni si accoppiano (insieme con i loro momenti angolari di tipo orbitale) per dare il
momento totale che è quello che si osserva. Quest’ultimo è caratterizzato da un numero
quantico I che può essere intero, semiintero o nullo.
Se consideriamo un particolare nucleo esso sarà composto da p protoni (che definisce
il numero atomico e la carica totale) ed n neutroni, la sua massa totale è p+n (massa
atomica), il suo spin totale sarà la combinazione vettoriale di p+n spin ciascuno con
grandezza 1/2.
Ciascun isotopo nucleare essendo composto di un numero differente di protoni e
neutroni ha un suo proprio valore di spin totale. Purtroppo non sono note le leggi di
combinazione vettoriale di spin nucleari e quindi in generale non può essere predetto lo
spin di un particolare nucleo.
Però gli spin osservati possono essere razionalizzati da un certo numero di regole
empiriche, infatti si possono individuare alcune proprietà sistematiche quali
- Nuclei con numero di massa dispari hanno spin semiintero (1/2 o multipli)
- Nuclei con numero di massa pari e numero atomico dispari hanno spin intero
- Nuclei con numero di massa pari e numero atomico pari hanno spin nullo
5
Questo spin nucleare può assumere i valori di 0, 1/2, 1, 3/2, 2....fino a 6. Quindi il
valore di I, non quello di P, può essere predetto teoricamente sulla base di quanto
riassunto nella seguente tabella:
Esempi di numeri di spin nucleare, I,
con diverse combinazioni di massa atomica e numero atomico
I
Massa
Atomica
Numero
Atomico
Semi-intero
Dispari
Dispari
Esempio di Nuclei
1
1
H(1/2)
19
9
H(1/2)
15
7
N(1/2)
F(1/2)
31
15
P(1/2)
35
17
C(1/2)
29
14
Si(1/2)
17
8
Dispari
Pari
13
6
Intero
Pari
Dispari
2
1
Zero
Pari
Pari
Semi-intero
3
1
H(1)
12
6
C(0)
Cl(3/2)
O(5/2)
14
7
10
5
N(1)
16
8
O(0)
32
16
B(3)
S(0)
Per I = 0 il nucleo non ha momento magnetico dipolare (concetto che vedremo a
breve), quando I = 1/2 il nucleo ha una distribuzione sferica di carica e momento
magnetico non nullo, ma quando I > 1/2 il nucleo ha una distribuzione di carica oblata
o prolata.
nucleo sferico
nucleo oblato
nucleo prolato
Possibili distribuzioni della carica positiva nei nuclei
6
In quest’ultimo caso il nucleo non solo è dotato di momento magnetico ma a anche un
momento elettrico di quadrupolo che tiene conto della distribuzione asimmetrica della
cariche e quindi della non perfetta radicalità del campo elettrico creato dalla carica
stessa intorno al nucleo. Si può concludere che tutti i nuclei che hanno lo stesso valore
del numero quantico di spin (come 1H, 19F, 31P dove I = 1/2) hanno lo stesso valore del
momento angolare di spin, P, malgrado le differenti masse. Essi però avranno, come
vedremo, valore diverso del momento magnetico poiché avranno un valore diverso del
rapporto giromagnetico . Nella tabella seguente sono elencati i valori del numero
quantico di spin nucleare di alcuni degli elementi più comuni.
Spin (I) e rapporti giromagnetici,  per alcuni isotopi nucleari comuni
isotope
natural
abundance
spin
gyromagnetic
ratio /rad s–1 T-1
1
99.98%
1/2
267.5  106
2
0.015%
1
41.1  106
10
19.9%
3
28.7  106
12
98.9%
0
-
13
C
1.1%
1/2
67.2  106
14
N
99.6%
1
19.3  106
15
0.37%
1/2
-27.1  106
16
99.96%
0
-
17
0.04%
5/2
-36.3  106
F
100%
1/2
251.8  106
Na
100%
3/2
70.8  106
100%
5/2
69.8  106
100%
1/2
108.4  106
H
H
B
C
N
O
O
19
23
27
Al
31
P
Poiché la risonanza magnetica nucleare dipende dall’esistenza dello spin nucleare, i
nuclei con I = 0 non danno luogo a nessun fenomeno di risonanza e quindi possono
essere ignorati. Dalla tabella si può osservare che fra questi nuclei ci sono il 12C e l’16O.
7
Poiché questi isotopi costituiscono la quasi totalità del carbonio e dell’ossigeno
esistenti in natura, gli spettri NMR di molti composti organici assai complessi sono
notevolmente semplici e facili da interpretare, essendo attribuibili ai soli nuclei di
idrogeno (protoni).
Abbiamo già accennato che i nuclei con numero quantico di spin maggiore di 1/2
possiedono anche un momento elettrico quadrupolare, che influisce sul tempo di vita
degli stati magnetici di questi nuclei, il quale normalmente è assai più breve di quello
dei nuclei a spin 1/2.
Pertanto le bande NMR di assorbimento dei nuclei con spin > 1/2 sono larghe (in virtù
del principio di indeterminazione) e piuttosto difficili da interpretare. In pratica questi
nuclei si possono considerare non magnetici a tutti gli effetti.
In questo corso si prendono in considerazione prevalentemente nuclei con spin 1/2,
anche se la maggior parte di concetti sono ugualmente applicabili ai nuclei con spin >
1/2.
4. Momenti magnetici nucleari
Ad ogni particella carica in moto è associato un campo magnetico; su scala
macroscopica la corrente elettrica, che è dovuta al moto degli elettroni lungo un
conduttore, produce un campo magnetico e, ad una corrente che percorre un circuito è
associato un momento magnetico dipolare. Questo fenomeno si verifica anche su scala
atomica, perché tutte le volte che un elettrone o un nucleo possiede un momento
angolare, possiede anche un momento magnetico, e poiché nell’ambito delle dimensioni
atomiche i momenti angolari sono quantizzati, lo sono anche quelli magnetici.

P

i
Relazione tra il momento magnetico di spin di un nucleo con
distribuzione sferica di carica e quello di una spira percorsa da corrente
8
La grandezza di questi momenti si può ricavare con estrema facilità da un punto di
vista classico considerando il moto orbitale degli elettroni.
Però quando si prende in considerazione il moto di spin, questo semplice calcolo non
riproduce in maniera quantitativa l’espressione quantomeccanica che mette in relazione
il momento magnetico ed il momento angolare.
L’espressione che mette in relazione entrambi i momenti (grandezze vettoriali)
introduce un fattore di proporzionalità detto rapporto giromagnetico,  (tale rapporto è
noto anche come rapporto magnetogirico), quindi avremo:
 =  I h / 2
dato che I h / 2P (in una data direzione di riferimento Pz = Mh/2 dove M = -I...+ I)
.P
Il rapporto giromagnetico  determina il rapporto tra il momento magnetico nucleare
ed il momento angolare (tenendo conto esplicitamente del segno). Quindi il momento
magnetico (vettore) ci dà la direzione e l’ampiezza (o intensità) del ‘magnete nucleare’.
Il rapporto giromagnetico () è una proprietà fondamentale di ogni isotopo nucleare,
questo comporta che nuclei differenti hanno momenti magnetici differenti.
Quindi possiamo affermare che nel modello classico lo spin del nucleo viene descritto
come un momento magnetico rappresentato da un vettore.
9
5. Nuclei in un campo magnetico
Anche il momento magnetico , appena definito, ammetterà delle componenti lungo
una direzione di riferimento ad esempio un campo magnetico esterno, B [spesso nei testi
più vecchi troverete scritto H a posto di B il significato concettuale non cambia], coincidente
con l’asse z. E’ evidente che il momento magnetico interagirà in modo differente con il
campo magnetico esterno (interzione Zeeman) a seconda del valore della grandezza
della componente.
z
B

y
x
Ora quando si applica un campo magnetico di intensità B0 lungo l’asse z, il momento
magnetico  assume, in termini classici, una energia data da E =  B0
L’energia per ogni stato (per ogni valore di M) è data da
EM = -zB0 = -PzB0 = -M(h/2)B0
Nel caso di I = 1/2, M = ±1/2 per cui ci sono due stati di energia:
E = ½ B0h/2 e E = -½ B0h/2
La differenza di energia è:
Ricordando che
E = B0h/2
E = h. si ha:
E/h =  = I/2IB0
(Eq. 2)
10
In questa equazione sta la base della tecnica spettroscopica: una transizione di spin
nucleare tra livelli energetici diversi può essere associata con l’emissione o
l’assorbimento di energia sotto forma di radiazione con frequenza data dall’equazione
precedente. Poiché la frequenza di risonanza è proporzionale al campo magnetico, per
raggiungere le condizioni di risonanza si può variare sia  che B0.
Se è necessario passare dall’osservazione di un nucleo X a quello di un nucleo A, in
cui quest’ultimo ha un rapporto giromagnetico più grande, l’equazione 2 stabilisce che
si può aumentare  o diminuire B0 come mostrato nella figura seguente.
MA =  1/2
E
MX =  1/2
------------------------3
1
B0
-------------------------
MX = + 1/2
2
MA = + 1/2
Diagramma energetico di due nuclei differenti ed isolati, A ed X, di spin 1/2, in cui
vengono illustrate le condizioni di risonanza a frequenza costante ed a campo costante
Il diagramma è stato costruito supponendo A > X (entrambi positivi)
Se le condizioni di risonanza sono tali da provocare la transizione 1 di X, per raggiungere
la risonanza del nucleo A si può aumentare la frequenza mantenendo costante il campo
(transizione 2) sia diminuire il campo mantenendo costante la frequenza (transizione 3)
È difficile infatti che nuclei di diverso tipo rispondano a sollecitazioni in frequenze
proprie di un determinato nucleo: le costanti giromagnetiche variano infatti
grandemente da elemento ad elemento, comportando regioni di eccitabilità totalmente
separate.
11
Contrariamente al caso appena considerato, dove campo e frequenza hanno effetti
opposti finché non sono state raggiunte le condizioni desiderate, un aumento di B0 per
un dato tipo di nucleo (cioè per  costante) corrisponde ad un aumento di  se si
vogliono mantenere le condizioni di risonanza.
Intensità del campo magnetico = 1.41 Tesla
Isotope
Magnetogyric
Ratio
 (radians/Tesla)
(Spin Number)
&
n° of Spin States
Resonance
Frequency
 (MHz)
1H
267.53
(1/2) 2
60.0
2H
41.1
(1) 3
9.2
13C
67.28
(1/2) 2
15.1
(1) 3
4.3
14N
17O
- 36,28
(5/2) 6
8.1
19F
251.7
(1/2) 2
56.4
31P
108.3
(1/2) 2
24.3
35Cl
26,24
(3/2) 4
5.9
Il simbolo B (induzione magnetica o densità di flusso) sostituisce H (intensità
magnetica)
L’unità di misura di B nel SI: tesla [T (Kg s2 A1)] sostituisce il gauss (G), 1T = 104 G
L’hertz (Hz) unità di misura della frequenza, sostituisce i cicli per secondo (cps)
MHz sta per megahertz (106 Hz)
Valori tipici di  e B0 in strumenti di risonanza magnetica del protone (1H)
 (MHz)
B0 (tesla)
60
100
200
360
500
1,4092
2,3487
4,6974
8,4553
11,7434
Normalmente tutti gli spettrometri lavorano nelle condizioni in cui il campo magnetico
applicato è costante (per motivi di omogeneità del campo stesso), mentre si varia la
frequenza per raggiungere le condizioni di risonanza esperimento a scansione di
frequenza [spettrometri ad onda continua (continuous-wave, CW)].
12
Il rapporto giromagnetico  determina la velocità con cui lo Zeeman splitting (energia
Zeeman) aumenta all’aumentare dell’intensità del campo magnetico: E = B0h/2

energy
I = 1/2
1
H
energy
M = - 1/2
15
energy 27Al
N
I = 1/2
I = 5/2
M = - 5/2
M = - 3/2
M = + 1/2
M = - 1/2
M = - 1/2
M = + 1/2
M = + 3/2
M = + 1/2
field
Nota l’ordinamento
dei livelli energetici
( è positivo per 1H)
M = + 5/2
field
field
Nota l’ordinamento
dei livelli
energetici ( è
negativo per 15N)
6. Popolazione dei livelli energetici
(Gli atomi di Idrogeno sono piccoli magneti)
Se consideriamo l’ago di una bussola questo normalmente si allinea con il campo
magnetico terrestre indicando il nord. Se non è chiuso in un contenitore si può girare
l’ago con le dita per dirigerlo verso sud allineandolo in opposizione al campo magnetico
terrestre. Questa è una posizione molto instabile e non appena è libero di muoversi
ritorna alla posizione più stabile.
13
In condizioni normali l’orientazione dei momenti magnetici dei singoli nuclei ha una
distribuzione casuale, si dice che i nuclei sono degeneri (posseggono cioè la stessa
energia). L’applicazione di un campo magnetico esterno, impone al sistema un ordine
che porta la popolazione nucleare a distribuirsi su due o più livelli energetici. Tali livelli
sono associati a diverse orientazioni dei momenti magnetici nucleari rispetto al campo
magnetico applicato.
Per fare un esempio pratico è come se considerassimo i singoli nuclei come dei piccoli
aghi magnetizzati, in condizioni normali questi aghi sono orientati in maniera
random
quando applichiamo un campo magnetico essi inizieranno a disporsi secondo le linee di
forza del campo stesso assumendo posizioni a bassa energia (allineati parallelamente al
campo magnetico) o ad alta energia (allineati antiparallelamente al campo magnetico).
Bo
Come vedremo vi è sempre un piccolo eccesso di nuclei allineati nella stessa direzione
del campo rispetto a quelli allineati in senso inverso.
Quindi a seguito dell’applicazione del campo magnetico esterno noi creiamo una
differenza di energia tra i nuclei allineati o no con B0

E = h 
Bo > 0
Bo = 0

14
La popolazione di nuclei con spin parallelo N, cioè orientata secondo il verso di B0,
possiede energia potenziale minore E1 e si trova in soprannumero rispetto alla
popolazione N con spin antiparalleli e con energia potenziale maggiore E2.
La distribuzione della popolazione nei due livelli energetici E ed E è data dalla
legge di distribuzione di Boltzmann:
N / N = eΔE / K °T
dove K è la costante di Boltzmann, °T è la temperatura assoluta e ΔE = E2 - E1 è la
differenza di energia tra i due livelli, etichettati  o  oppure 1/2 e -1/2.
Il E per 1H a 400 MHz (Bo = 9.5 T) è 3.8 x 10  5 Kcal/mol:
N/N = 1.000064
Questo rapporto, molto vicino all’unità, ci dice che i due livelli sono egualmente
popolati. Per essere più precisi, per ogni milione di nuclei presenti nello stato energetico
superiore vi sono un milione e qualche decina di nuclei nello stato inferiore.
Sebbene tale eccesso (eccesso di Boltzmann) sia piccolo, esso è sufficiente per
permettere l’osservazione di un assorbimento della radiazione elettromagnetica poiché
la probabilità di una transizione verso l’alto è lievemente maggiore di quella verso il
basso.
Nella spettroscopia NMR, la radiazione elettromagnetica viene usata per invertire
l’allineamento dello spin nucleare dallo stato a più bassa energia a quello, allineato in
direzione opposta, a più alta energia. L’energia richiesta per questa transizione dipende
dalla forza del campo magnetico applicato, ma è piccola e corrisponde al campo delle
radiofrequenze dello spettro elettromagnetico.
Il piccolo valore dell’eccesso di Boltzmann fa sì che il metodo non è molto sensibile,
ne consegue che in uno spettrometro NMR è necessario usare una sofisticata
amplificazione del segnale e ciò comporta complicate soluzioni tecniche cioè gli
spettrometri NMR ad alta risoluzione sono strumenti complessi e costosi.
15
Inoltre appare evidente, ora, una delle ragioni per le quali si debbano usare campi
magnetici molto alti, l’equazione  = I/2IB0 mostra che campi magnetici alti
richiedono alte frequenze di risonanza, questo a sua volta, aumenta la differenza di
energia tra gli stati di spin, E = h (energia Zeeman), e di conseguenza, l’eccesso di
Boltzmann e la sensibilità dell’esperimento.
Per 1H nei normali magneti (2.35-18.6 T) questa frequenza è nell’intervallo
100-800 MHz
raggi-
raggi-x
10-10
10-8
UV VIS
IR
10-6 10-4
10-2
m-onde
100
radio
102
lunghezza d’onda (cm)
Un’altra considerazione da fare è che nuclei con  più grande assorbono più energia e
sono pertanto più sensibili.
 13C = 6,728 rad/G (oppure 67,28 radianti/T)
 1H = 26,753 rad/G (oppure 267,53 radianti/T)
H è ~ 64 volte più sensibile di 13C proprio a causa di 
1
16