Aspergillus flavus
Embryo lipids «attract» A. flavus
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Mature B73 kernels naturally infected with
Aspergillus flavus. A sagittal (1) and frontal
(2) and transversal (3) section of healthy
B73 kernels (left) were compared to disease
kernels (right) to discern any physical
changes that occurred as a result of A.
flavus.
a—crown;
b—pericarp;
c—aleurone;
d—starchy endosperm;
e—hard endosperm;
f—scutellar tissue;
g—leaf primordia (plumule);
h—primary root;
i—transfer cells;
j—pedicel;
k—embryo; and l—germ.
Dolezal et al. doi: 10.3389/fmicb.2014.00384
Invasione dei tessuti delle
cariossidi di mais
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Histology of the developing maize kernel 4 days
after Aspergillus flavus pin-bar inoculation. The
schematic drawing of the kernel (a) depicts the
location of pin-bar inoculation (black arrow)
and the kernel region (black box, ) from which
the histology panels originate.
Aspergillus flavus was observed (b) in the
endosperm (EN) surrounding a cavity created
by the inoculation pin and outside the germ
(GM) in a unique A. flavus mat-like (A.f mat)
structure. Hyphae were also found growing
between the pericarp (PC) and aleurone (AL) (c)
in which the AL cells in contact with A. flavus
appear to be altered compared with cells in the
noninoculated control (d). (e) Endosperm–germ
interface (IF) in a noninoculated kernel.
In the infected kernel, the A.f mat structure
developed at the IF (f) and covered the germ
tip. Hyphae within the A.f mat were
morphologically distinct from A. flavus
vegetative hyphae (g) and were highly
branched, tightly intertwined and extended into
the GM (h). Colonization of the GM by A. flavus
was observed in highly infected kernels (i).
Aflatoxins:
presentation
Discovered in 1962
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
Composed of:
• Coumarin group
• Bisfuran ring
• Pentan group
AFB
• Furan group
AFG
PhD defence
2D structures of aflatoxin B1 (AFB1), aflatoxin B2 (AFB2),
aflatoxin G1 (AFG1) and aflatoxin G2 (AFG2)
11/25/2014
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Aflatoxins: abiotic parameters
Growth
AFB1 production
• Water activity: aw
– 0.94 - 0.99
– 0.96 - 0.99
• Temperature
– 30 - 35°C
– 25 - 30°C
Other parameters:
Gas composition, Medium, pH, Light, Chemical compounds
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Aflatoxins: Biosynthesis
• 1 AcetylCOA & 9 MalonylCOA
Norsolorinic Acid (NOR)
Versicolorin B
1
2
Sterigmatocystin
AflU
(NadA,
AflF)
(Yu et al., 2004)
AFG1 AFG2
AFB1
11/25/2014
AFB2
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Aflatoxins: Regulation
• AflR and AflS: specific regulators
( )
AflR:
• Zinc Finger
transcription factor
• Specific binding
5’- WCGSNNNSCGA-3’
(W: A ou T, S: C ou G, R: A ou G)
AflS: AflR coactivator?
(Alkhayyat & Yu, 2014)
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Regolazione della
biosintesi delle AF
• Quando FadA è attivato in
seguito alla percezione di uno
stimolo esterno inibisce sia
direttamente che
indirettamente, i.e. attraverso la
cAMP-dependent PkaA,
l’attivazione di LaeA e quindi
di AflR
• FlbA, la cui attivazione
dipende da FluG, sopprime
FadA e consente l’attivazione
di AflR tramite LaeA
(Georgianna and Payne, 2009).
Controllo dell’espressione genica tramite modifiche della
cromatina
•
•
•
Il substrato naturale per il meccanismo di
trascrizione e delle proteine regolatrici
coinvolte nella segregazione dei
cromosomi, la replicazione e riparazione
del DNA nel nucleo degli eucarioti non è il
DNA stesso, ma la cromatina.
La cromatina si compone di
proteine nucleari strutturali come istoni e
proteine non-istoniche che sono
strettamente associate con il DNA e che
condensano la lunga molecola di DNA in
un piccolo volume
Sebbene l’imballaggio è essenziale e
l'eliminazione di alcuni fattori modificanti
la cromatina è letale, la cromatina
rappresenta anche un notevole ostacolo
per i fattori che legano il DNA per
accedere alle proprie sequenze affini.
•
L’accessibilità alla cromatina è regolata
principalmente a livello di modificazioni
post-traduzionali (PTM) di proteine istoniche
che definisce il grado di compattazione da
aperto (eucromatina ) a chiuso
(eterocromatina)
•
Le modificazioni delle proteine mediante
acetilazione, metilazione, ubiquitinazione e
fosforilazione rappresentano le principali
modifiche dei diversi amminoacidi presenti
nel N -terminale e nei domini globulari degli
istoni H2B , H3 , e H4 .
•
Durante un ciclo di regolazione, queste
modifiche possono essere rimosse da
deacetilasi , demetilasi e fosfatasi, o una
modifica può essere sostituita da un’altra
sullo stesso residuo da parte di enzimi.
•
Questi sono parte di complessi specializzati
histone -modifying, come ad esempio le
acetiltrasferasi saga/Ada o NuA4, SET metiltransferasi o le istone deacetilasi
• Le attività dinamiche di «scrittura e cancellazione» che modificano gli
istoni risultano in combinazioni che cambiano spazialmente e
temporalmente i diversi histones marks presenti in regioni codificanti
geni regolativi e anche in zone di DNA non codificante.
• Queste combinazioni sono ritenute generare un "codice" che è
riconosciuto da proteine "lettrici".
• Il loro ruolo è quello di reclutare attivatori trascrizionali o repressori in
queste posizioni codificate e di modificare la struttura della cromatina
e la sua compattazione interagendo con fattori responsabili della
formazione di eterocromatina .
• Poiché tali histones marks, proprio come la metilazione del DNA ,
possono essere trasmessi in modo stabile durante la meiosi alle cellule
figlie, il codice istonico è diventato un componente integrato della
regolazione epigenetica.
• Tuttavia, anche se la regolazione epigenetica impiega questi histones
marks, la regolazione a livello della cromatina non fa necessariamente
attivare un evento epigenetico.
• In contrasto con l’acetilazione, che viene letto sostanzialmente sempre
come un segno di attivazione cromatinica, la metilazione dell'istone
rappresenta un linguaggio molto più complesso.
• La metilazione del H3K9, H3k27 e H4K20 è più frequentemente associata
con l’eterocromatina e il silenziamento trascrizionale mentre la
metilazione H3K4, H3K36 e H3K79 è più spesso - insieme con
l’iperacetilazione di H3K9 – associata all’eucromatina attivamente
trascritta.
• L’acetilazione e la metilazione avvengono esclusivamente sulle lisine e
non possono mai coesistere contemporaneamente sullo stesso residuo.
• Ma questa è solo una parte della verità, a seconda del:
– grado di metilazione (mono-, di-, o trimethylation) di una data lisina,
– se il mark viene posto su un istone residente in una regione del promotore o
nella sequenza codificante,
– La localizzazione cromosomica
un dato mark di metilazione può essere letto come un segnale di attivazione
o di repressione
The chromatin code of fungal
secondary metabolite gene clusters
•
Il metabolismo secondario non è immediatamente essenziale per l'organismo, ma,
tramite la produzione di metaboliti specifici, può influenzare la competitività in
ambienti naturali e quindi sopravvivenza a lungo termine e la fecondità della specie.
•
I geni coinvolti nella biosintesi di un certo metabolita di solito sono fisicamente
collegati nel cromosoma (cluster) e co-regolati trascrizionalmente.
•
L’ arrangiamento dei geni legati agli SM in cluster può essere state mantenuto
anche perché la vicinanza dei geni consentirebbe un controllo coordinato
trascrizionale mediante meccanismi chromatin-based
LaeA and the crosstalk to histone
methylation
• Una piccola finestra in questa enorme complessità è stata aperta
dalla constatazione che in A. nidulans, LaeA influenza notevolmente
lo stato di metilazione di H3K9 e l’occupazione successiva di questo
locus da parte di HEPA.
• Il legame di HepA sulla cromatina richiede la di- e tri- metilazione di
H3K9.
• Il fatto che la perdita della funzione LaeA risulti in una elevata
H3K9me3 e di livelli di HepA nel cluster ST, e che la delezione di
HepA parzialmente by-passi il ruolo di LaeA per la trascrizione di
diversi Cluster SM, suggerisce un ruolo di questo regolatore nella
formazione dell’eterocromatina e nella repressione trascrizionale .
• l'esatto meccanismo del funzionamento di LaeA in questo processo
resta ignoto ma potrebbe essere direttamente o indirettamente
coinvolto nel blocco della formazione eterocromatina.
Regolazione della biosintesi delle AF
• Un complesso trimerico, chiamato il
velvet complex (VelB-VeA-LaeA),
è responsabile della
sincronizzazione dello sviluppo con
i cambiamenti metabolici in
assenza della luce
• VelB è una proteina conservata nel
regno fungino che ha un’identità
aminoacidica del 18% con VeA ma
non ha nessun NLS tipico (nuclear
localization signal).
• VeA forma un complesso con VelB
ed incrementa il trasporto di VelB
nel nucleo. Poi, VeA collega VelB
con il nuclear master regulator del
metabolismo secondario, LaeA.
(Bayram et al. 2008).
Lo stress ossidativo regola la
produzione di diverse micotossine
• Diversi oxidant stressors aggiunti esogenamente
quali perossido d'idrogeno, PUFA ossidati, epossidi,
aldeidi, chetoni, ergosterolo perossidato, tetracloruro
di carbonio e altri alogenometani inducono la
biosintesi di alcune micotossine tra cui:
• Aflatossine (Fabbri et al., 1983)
• Deossinivalenolo (Ponts et al., 2004)
• Patulina (Castoria et al., 2005)
• Ocratossina A (Reverberi et al., 2010)
Un caso di studio: le aflatossine
• L'invecchiamento cellulare (cell ageing) induce uno
stato iperossidante nella cellula fungina che porta al
differenziamento e all'attivazione del metabolismo
secondario (Aguirre et al., 2007)
• La diminuzione delle difese antiossidanti nella
cellula fungina genera un ambiente ossidativo che
favorisce la produzione di aflatossine (Reverberi et al.,
2007)
• Questo è stato verificato mediante la delezione del
gene ApyapA che in A. parasiticus codifica un fattore
di trascrizione capace di controllare la risposta
antiossidativa (Reverberi et al., 2008)
Lavoro yap1
• Il gene ApYapA codifica per
un fattore di trascrizione
correlato allo stress ossidativo
• ApYapA possiede diversi
residui di cisteina che qualora
ossidati, portano ad un cambio
del suo folding che induce la
sua migrazione nel nucleo
• ApYapA riconosce degli
elementi risposta simili agli
ARE (YRE-TGACTCA)
presenti nel promotore di molti
geni codificanti per enzimi
antiossidanti quali superossido
dismutasi e catalasi
Lavoro yap1
• Il mutante ApyapA- presenta
una forte alterazione nello
sviluppo (produce molti più
conidi del WT) e nel
metabolismo secondario (la
produzione di AF è
anticipata e raggiunge prima
il plateau)
• Uno YRE è stato trovato
anche nel promotore di AflR
il main regulator della
sintesi di AF
ACUTE-OXIDATIVE STRESS
CHRONIC-OXIDATIVE STRESS
O2-·
LOO·
OH·
yap1 CRM1
SH yap1
aflR
SH
Hsf2
Nucleo
TGACTCA
TGACTCA
Skn7
nGAAn
Cu, Zn-Sod,
Mn-Sod, Cat,
Gst, Gpx
aflR box
AFTX gene
cluster
