CLONAGGIO POSIZIONALE
CLONAGGIO FUNZIONALE
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Identificazione
di geni-malattia
attraverso la
strategia del
clonaggio
posizionale
Oggi per molte regioni di genoma è
possibile passare direttamente dalla fase
1) alla fase 4)
Geni presenti in una regione di 500 kb del
cromosoma 6 umano (6p21.1)
I geni presenti all’interno della regione identificata con
l’analisi di linkage vengono valutati e si stila un elenco
di geni ‘candidati’
Come si stabilisce l’ordine di priorità dei geni candidati?
Funzione appropriata
esempi rodopsina per la retinite pigmentosa; fibrillina per
la sindrome di Marfan
Espressione spazio-temporale appropriata
esempio i geni le cui mutazioni determinano difetti del
tubo neurale devono essere espressi in questa struttura
prima della sua chiusura
Omologie e relazioni funzionali con geni noti e di cui si
conoscono mutazioni patologiche
esempio ligando e suo recettore; componenti di una stessa
via metabolica
Omologie con fenotipi simili in organismi modello
Clonaggio posizionale in epoca presequenziamento genoma umano
L’identificazione del gene della DMD
Due gruppi sono arrivati in maniera
indipendente a questo risultato
1) attraverso un paziente che aveva una
delezione citologicamente rilevabile di una
regione in Xp21
2) attraverso una delle rarissime donne
(una ventina in tutto il mondo) che presentano
la malattia
Kunkel et al. 1985
PNAS 82: 4778-4782
1) hanno utilizzato il clonaggio per
sottrazione (concettualmente semplice
ma tecnicamente molto complesso)
Clonaggio per sottrazione
1. DNA di una linea
cellulare 49, XXXXY
digerito con MboI
(frammenti con
estremità adesive)
Il DNA 2. è in grande
eccesso rispetto all’1:
si favorisce la formazione
di eteroduplex (1)-(2)
rispetto a quella di
omoduplex (1)-(1)
2. DNA del paziente
DMD con la
delezione
(frammentato con
sonicazione)
I 2 DNA denaturati vengono mischiati e fatti rinaturare
(A) Omoduplex (1)-(1), hanno
estremità adesive: possono
essere clonati in un vettore
con estremità adesive
complementari
(B) eteroduplex (1)-(2),
un filamento è privo
di estremità adesive:
non possono essere
clonati
(C) omoduplex (2)-(2),
non hanno estremità
adesive: non possono
essere clonati
Questi frammenti sono arricchiti per le sequenze che non sono presenti nel DNA
2, vengono utilizzati per la costruzione di una libreria
Le sequenze clonate sono state testate per
individuare quelle realmente non presenti nel
paziente con la delezione
Le sequenze così ottenute sona state usate come
sonde di ibridazione su Southern blot di
DNA di malati DMD e di controlli normali
Worton et al. 1987
Donna affetta da DMD portatrice di una traslocazione
bilanciata X-21
Il punto di rottura sul cromosoma X è dentro il gene
DMD
Il tratto di cromosoma 21 traslocato porta geni per
l’rRNA sul cromosoma X
1.Costruzione di una libreria di DNA genomico della
donna affetta
2.Identificazione dei cloni contenenti sia sequenze del
cromosoma X che sequenze per l’rRNA
Clonaggio funzionale si arriva al
clonaggio del gene malattia attraverso
inferenze sulla funzione la cui
alterazione provoca la patologia
Pochi esempi clonaggio del gene
implicato in una grave forma di
emofilia
Gene del fattore VIII della coagulazione – suo
isolamento da una banca di cDNA di maiale
Isolamento del DNA genomico (di maiale) e suo uso come
sonda per isolare il corrispondente gene umano
OMIM = Online Mendelian Inheritance in Man
Versione online del catalogo dei fenotipi
mendeliani umani (la ‘Bibbia’ dei genetisti
medici) edito in versione cartacea fin dal 1966 a
cura di Victor McKusick (sei edizioni: la prima
nel 1966, l’ultima nel 1998)
E’ un compendio dei geni e dei fenotipi umani
Contiene informazioni su > 13 000 geni e su tutte
le malattie e i fenotipi mendeliani noti
Ogni voce (‘entry’) è contrassegnata da un
numero a sei cifre preceduto da un simbolo
il significato della prima cifra:
1..... e 2..... ‘entries’ create prima del 15/05/1994
riguardanti loci o fenotipi autosomici
3.....
‘entries’ riguardanti loci o fenotipi Xlinked
4.....
‘entries’ di loci o fenotipi Y-linked
5.....
‘entries’ di loci o fenotipi mitocondriali
6.....
‘entries’ di loci o fenotipi autosomici
creati dopo il 15/05/1994
il significato del simbolo che precede il numero:
*
gene
#
fenotipo
+
gene a sequenza nota + fenotipo
%
fenotipo mendeliano a base molecolare nota
no simbolo
fenotipo a sospetta (ma non confermata)
eredità mendeliana
Esempi relativi alla CF (= Cystic Fibrosis)
Il gene
*602421
La malattia 1 (CF)
#219700
La malattia 2 (CBAVD)
#277180
Per ogni gene il database fornisce
numerose informazioni cliniche,
genetico-molecolari , popolazionistiche,
una serie di ‘link’ ad altri siti e
un’ampia bibliografia
