1
TUTTI GLI ENZIMI POSSONO ESSERE ANALIZZATI IN MODO DA
POTER QUANTIFICARE SIA LA VELOCITA’ DI REAZIONE CHE LA
LORO
EFFICIENZA ENZIMATICA
Lo studio della cinetica enzimatica inizia nel 1909 con
ADRIAN BROWN e i sui studi sulla velocità di IDROLISI del
SACCAROSIO catalizzata dall’enzima -fruttofuranosidasi
SACCAROSIO + H2O
GLUCOSIO + FRUTTOSIO
Quando la concentrazione del saccarosio è molto più
elevata di quella dell’enzima, la velocità di reazione
diventa indipendente dalla concentrazione del
saccarosio
2
[E]
0
V0 = NUMERO
NUMERO DI DI
DI
MOLIMOLI
DI
PRODOTTO CHE
IN
SUBSTRATO
CHE SI
SI FORMANO
CONSUMANO
UNUN SECONDO
SECONDOAD UNA
AD
UNA
IN
CONCENTRAZIONE FISSA
FISSA
DI
CONCENTRAZIONE
DI
ENZIMA
ENZIMA
1
2
3
4
Leonor Michaelis e
Maud Menten nel 1913
proposero un semplice
modello matematico
per spiegare queste
caratteristiche
cinetiche
3
Velocità a differenti
concentrazioni di S
Il punto focale dell ’ ipotesi di
Michaelis e Menten sta nella
formazione di un
COMPLESSO ES SPECIFICO
come intermedio essenziale per
la catalisi
Michaelis e Menten
proposero che la
REAZIONE
ENZIMATICA
COMPLESSIVA
fosse costituita da
due REAZIONI
ELEMENTARI
COMPLESSO
ENZIMA-SUBSTRATO
E+S
La reazione
raggiunge
velocemente
4
l’equilibrio
K1
K3
ES
K2
P+E
Questi scienziati attraverso una serie di assunzioni
logiche vogliono determinare un equazione della velocità
che metta in relazione la velocità di reazione alla
concentrazione del substrato in una reazione catalizzata
da un enzima.
Vogliono cioè ricavare
l’equazione della velocità
che sia valida per una
qualsiasi reazione
catalizzata da un
qualsiasi enzima
5
LA PRIMA ASSUNZIONE ( assunzione dell' "equilibrio
rapido")
dice che il complesso ES è in equilibrio con l’E libero e il S
e che questa situazione di equilibrio non è disturbata dalla
formazione del P. In altre parole la velocità di formazione
del prodotto a partire da ES è molto piccola rispetto alla
velocità con cui ES si scinde per dare E+S ( k3 << k2 ).
La velocità di
catalisi è data
dalla formazione
del prodotto
(reazione più lenta)
d[P]
V=
dt
6
= K3[ES]
LA SECONDA ASSUNZIONE (assunzione della velocità
iniziale V0 )
la velocità della reazione viene valutata per un periodo di
tempo durante il quale la reazione inversa è fisicamente
trascurabile in quanto poco è il prodotto formatosi: la
velocità iniziale che può così essere determinata sarà la
massima velocità ottenibile.
In condizioni di velocità iniziale la reazione è di fatto
irreversibile (k4=0) e deve essere scritta nel seguente
modo:
7
LA TERZA ASSUNZIONE (assunzione dello "stato
stazionario“)
Dice che il complesso ES si mantiene in uno
stato stazionario durante tutto il periodo di tempo
in cui si possono misurare le velocità iniziali.
[ES] rimane costante per cui la
velocità con cui il complesso
ES si forma a partire da E+S
è uguale alla somma delle
velocità con cui si scinde per
dare E+P ed E+S.
8
*
9
*
10
ASSUNZIONE DELLO
STATO STAZIONARIO
[S] >> [E]
Velocità di sintesi di ES
rimane COSTANTE
equazione di conservazione
di massa per l'enzima:
11
v di SINTESI = v di CONSUMO
COME SI ARRIVA
ALL’EQUAZIONE
DELLA VELOCITA’
V0 =K3[ES]
La concentrazione di ES deve essere scritta in
termini di concentrazioni note
12
Velocità di
formazione
di ES
=
Velocità di formazione di ES
Velocità di scissione di ES
d[ES]
dt
=0
Velocità di
scissione di
ES
[ES]= K1[E] [S]
[ES]= (K2+K3) [ES]
K1 [E] [S] = K3 [ES] + K2 [ES]
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Svolgiamo l’equazione
portando le costanti tutte dalla
stessa parte
[E] [S]
=
[ES]
K1 [E] [S] = K3 [ES] + K2 [ES]
(K3 + K2)
K1
(K3 + K2)
K1
COSTANTE DI
MICHAELIS
= KM
KM =
[E] [S]
[ES]
Per poter essere utilizzate le espressioni CINETICHE
devono essere formulate in quantità note
Poiché [E]T = [E] + [ES]
sostituendo
KM =
[E] = [E]T - [ES]
([E]T – [ES])[S]
[ES]
14
KM =
([E]T – [ES])[S]
Risolvendo rispetto a ES
[ES]
[ES] KM = [E]T [S]– [ES][S]
[ES] KM + [ES][S] = [E]T [S]
[E]T[S]
[ES] =
KM + [S]
[ES] (KM + [S]) = [E]T [S]
Poiché la velocità iniziale è data da
d[P]
V0 =
dt
= K3[ES]
[ES] = V0 / K3
Sostituendo a [ES]
l’equazione diventa:
15
K3[E]T[S]
V0 =
KM + [S]
K3[E]T[S]
V0 =
KM + [S]
v0 =
QUANDO
[S]>> [E] TUTTO L’ENZIMA E’ SATURATO
[ES]
[ET]
VMAX [S]
V0= K3[ES]
KM + [S]
VMAX = K3[ET]
V0= K3[ET]
Equazione di una iperbole
16
Equazione di
Michaelis-Menten
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
VMAX diventa l’ asintoto
a cui tende l’iperbole
17
e KM ?
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
V0 = VMAX/2
quando
VMAX
2
Se VMAX è il valore dell’asintoto a cui
tende l’iperbole, a che valore
corrisponde la KM ?
=
VMAX [S]
KM + [S]
VMAX (KM + [S]) = 2 VMAX [S]
KM + [S] = 2 [S]
KM = [S]
La KM equivale alla concentrazione del substrato
18
quando la velocità è uguale a VMAX/2
Per concentrazioni di substrato
basse [S]<<Km
l'equazione di Michaelis-Menten
diviene l'equazione della retta:
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
Per concentrazioni di substrato
[S]>>Km
l'equazione di Míchaelis-Menten
si semplifica nella relazione:
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ANALISI DEI DATI CINETICI
L' equazione di Michaelis-Menten può
però essere manipolata per ottenere l'
equazione di una retta in cui Vmax e
Km siano delle intercette e non più
degli asintoti.
Grafico di Lineweaver e Burk o Grafico dei doppi reciproci
Trasforma l’equazione di un iperbole nell’equazione di una retta
v0 =
1
V0
=
VMAX [S]
1
KM + [S]
V0
KM
VMAX [S]
+
=
KM + [S]
VMAX [S]
1
1 = KM 1 +
VMAX
VMAX S
V0
[S]
VMAX [S]
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Equazione lineare rispetto a 1/v0 e 1/S
Y=mX+c
Equazione
di una retta
SVANTAGGI:
1) la maggior parte delle misure sperimentali di
sono concentrate nella parte sinistra del grafico.
2) piccoli valori di [S]
piccoli errori in v0
Grandi errori in
KM e VMAX
Grandi
errori 1/v0
21
[S]
La KM ha un valore
unico per ciascuna
coppia ENZIMASUBSTRATO
CORRISPONDE ALLA CONCENTRAZIONE DI
SUBSTRATO IN CUI LA VELOCITA’ DI REAZIONE E’
22
META’ DELLA VELOCITA’ MASSIMA
quando
KM =
(K3 + K2)
K1
K3 << K1
K2
KM =
K1
= KS
Capacità di incontrare
Costante di
EQUILIBRIO
il substrato
KM = KS
Quando K1> K2
KM bassa
alta affinità
Quando K1<K2
23
KM alta
bassa affinità
Rappresenta la
capacità
dell’enzima di
legare il
substrato
A più alta (Km2) o
più bassa (Km1)
concentrazione di
substrato ottengo la
stessa V0 = VMAX/2
24
La KM ha un valore unico per
ciascuna coppia enzimasubstrato
Significato pratico della Km.
Il valore della Km è importante per varie ragioni:
La Km rappresenta approssimativamente il valore
della concentrazione intracellulare del substrato.
25
La Km è una costante specifica per ogni enzima, il suo
valore numerico ci fornisce un mezzo per comparare
enzimi provenienti da organismi diversi, da differenti
tessuti dello stesso organismo o dallo stesso tessuto a
differenti stadi di sviluppo: se due enzimi hanno valori
differenti di Km è probabile che siano due ISOENZIMI.
Spesso ligandi differenti dal substrato provocano
modificazioni del valore della Km. Se la Km determinata in
vitro sembra essere troppo alta, allora è pensabile che in
vivo sia presente un inibitore che ne abbassi il valore ad
una livello 'fisiologico'.
Se si conosce il valore della Km di un enzima, allora è
possibile misurarne la velocità di reazione in condizioni di
[S] di saturanti.
26
In realtà il valore della VMAX non è
una costante ma dipende dalla
quantità di enzima che è stata
messa per calcolare l’equazione
di Michaelis-Menten. MA poichè:
VMAX = K3[E]T
K 3=
KM
è anche chiamata:
Vmax
ET
= K cat
moli/sec
moli
Misura la velocità di un processo
catalitico ( a carico di una molecola
enzimatica) ed ha le dimensioni: sec-1
NUMERO DI TURNOVER
Numero di molecole di substrato trasformate da una
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molecola enzimatica in un secondo
Nella cellula la maggior parte degli enzimi non si trova mai a
concentrazione di substrato saturante ma a concentrazioni che
determinano una velocità che varia tra il 10-50% di quella massima
Quando
V0 =
[S] << KM
Vmax [S]
V0 =
KM + [S]
Vmax
Kcat =
ET
[ES]molto piccolo
Vmax [S]
KM
Vmax = Kcat [ET]
[E] [E]T
La velocità diventa la
probabilità dell’enzima
di trovare il substrato e
il valore
V0 =
Kcat [E][S]
KM
Misura l’efficienza catalitica
di un enzima
28
Kcat
KM
/
A bassa
concentrazione di
substrato
V0 =
Kcat
KM
[E][S]
La TEORIA DELLA DIFFUSIONE dice che esiste un
valore teorico della capacità di incontro di due
molecole e questo valore è di 108 - 109 (moli/l)-1 s-1
La trioso isomerasi che catalizza la reazione di
isomerizzazione della G3P a DHAP possiede un valore di
Kcat/KM = 2,4 x 108 (mol/L)-1 sec-1.
29
Efficienza che si avvicina
a quella massima
La maggior parte delle reazioni enzimatiche ha più substrati
per ognuno possiamo calcolare la l’efficienza catalitica
Da questi dati è abbastanza evidente che la
chimotripsina ha una predilezione ad operare
l ’ idrolisi in prossimità dei residui maggiormente
30
idrofobici
La velocità di reazione è limitata solo dalla velocità
con cui riescono ad incontrare il substrato in
soluzione.
I limiti imposti dalla
velocità di diffusione
possono
essere
superati
mediante
strutture
polienzimatiche
Complesso
multienzimatico
31
Gli studi di
CINETICA STAZIONARIA non danno
informazioni sulla velocità di formazione o quella di
scissione né sulla natura del complesso ES né se
esistano uno o più complessi.
E + S ES EX EP E + P
OPPURE
EX
E + S ES
EP E + P
EY
Tuttavia se i DATI CINETICI non sono compatibili con un
certo meccanismo molecolare allora
quel meccanismo deve essere scartato
32
Unità di attività enzimatica e dosaggi
degli Enzimi
Catal (kat): è la quantità di enzima che converte 1
mole di reagente nel prodotto in 1 secondo nelle
condizioni di reazione standard (ottimali).
L’Unità internazionale (U): corrisponde alla quantità
di enzima che converte 1 mole di reagente nel
prodotto in 1 minuto. Poiché 1 mole /min = 1.67
10-8 moli /s quindi U = 1.67 10-8 kat.
L’attività specifica: è il rapporto tra il numero di U o
di Kcat e la quantità totale di proteina espressa in
milligrammi.
33
L’attività specifica è una misura del grado di purificazione
dell’enzima e il suo valore tende a raggiungere un massimo
e rimane poi costante quando tutte le molecole del
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campione in esame sono molecole
di enzima attivo.
Effetto del pH
L’attività enzimatica è influenzata dal pH. Ciò può derivare dai valori di pKa del
substrato e/o dell’enzima. Perciò il pH scelto e la selezione di un tampone
appropriato sono fondamentali per i saggi di attività enzimatica.
35
Effetto della temperatura
temperatura
enzimatiche,
come le reazioni chimiche, dipendono
Le reazioni
dalla
temperatura, inoltre se la temperatura diventa troppo alta l’enzima può
denaturarsi e si avrà perdita di attività.
36
Ogni sostanza che riduca la
velocità di una reazione
enzimatica è da considerarsi un
inibitore.
La formazione reversibile di un legame non covalente con
una molecola diversa dal substrato porta alla formazione di
complessi anomali, che non fanno parte del normale
processo catalitico.
Nella trattazione cinetica della inibizione enzimatica si
applicano le assunzioni
di Michaelis-Menten anche
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all'inibitore. Ci sono almeno tre tipi principali di inibizione.
Le sostanze che alterano l’attività di un enzima
legandosi ad esso, sono chiamate INIBITORI
INIBIZIONE
REVERSIBILE
Legame non covalente tra
inibitore e enzima
IRREVERSIBILE
Legame covalente
tra inibitore e enzima
Azione di tossine e veleni INATTIVATORI
specifici, molti dei quali
38
provocano la morte inattivando degli enzimi chiave.
INIBIZIONE
COMPETITIVA
Sostanza che compete
con il substrato per il
SITO ATTIVO
INIBIZIONE
NON COMPETITIVA
INIBIZIONE
INCOMPETITIVA
Sostanza che si lega ad un SITO
DIVERSO dal sito attivo
INIBITORE
COMPETITIVO
39
INIBITORE
NON COMPETITIVO
INIBITORE
INCOMPETITIVO
L’inibitore che somiglia al substrato lega l’enzima nel
SITO ATTIVO, ma diversamente dal substrato non è
capace di reagire per dare un prodotto di reazione.
K1
K3
KI
E + S KES E + P
2
+
I
In presenza dell’INIBITORE l’enzima
non può legare il substrato come di
consueto.
L’Enzima opera come se la sua KM per
il substrato fosse aumentata
[E]t = [E] + [ES] + [EI]
EI
Enzima
totale
Enzima
libero
Enzima legato
40
al substrato
Enzima legato
all’inibitore
STESSA Vmax
DIVERSA KM
41
UN
INIBITORE
COMPETITIVO RIDUCE LA
CONCENTRAZIONE
DI
ENZIMA
LIBERO
DISPONIBILE PER LEGARE
IL SUBSTRATO
aumenta la KM
Per tutto il tempo che
l ’ inibitore occupa il sito
attivo,
l
’
enzima
non
è
42
disponibile per la catalisi
Un inibítore competitivo è una sostanza che si lega
all'enzíma libero, impedendo così la formazione del
complesso enzima-substrato. Esso può essere un
analogo non metabolizzabile del substrato, un substrato
alternativo per l'enzima o un prodotto di reazione.
L'inibizione della succinico deidrogenasi da parte dell'acido
maloníco è un classico esempio di inibizione competitiva da
analogo non metabolízzabile:
43
44
Quando
l’inibitore si
lega ad un
SECONDO SITO
sulla superficie
dell’enzima
diverso dal SITO
ATTIVO
modificando la
Kcat
INIBITORE NON COMPETITIVO molecola che non
somiglia al substrato
45
L’inibitore si lega tanto ad E che
a ES e che S si lega sia ad E che a
EI. La presenza di uno di essi
non ha alcun effetto sulla
costante di dissociazione
dell'altro, ma il complesso ESI è inattivo, non è in grado
cioè di liberare il prodotto.
L’inibitore non competitivo si comporta come se
determinasse una rimozione di molecole enzimatiche attive
dalla soluzione
KM uguale
VMAX VARIA
46
47
L’inibitore si lega direttamente al complesso ES ma
non all’enzima libero K
K
1
2
E + S K ES E + P
+
L’inibitore incompetitivo, che non
I
deve necessariamente somigliare al
-1
substrato provoca una distorsione
nel sito attivo, rendendo l’enzima
cataliticamente inattivo
KI
ESI
L’inibitore influenza la funzione
catalitica dell’enzima, ma non il suo
legame con il substrato.
Importante solo per gli enzimi a substrati
multipli.
Varia sia VMAX
KM
che
48
Nessuna
reazione
E' interessante notare che per l’inibizione
incompetitiva, il grado di inibizione aumenta
all'aumentare della concentrazione del substrato. Ciò
è comprensibile in quanto l'inibitore incompetitivo si
lega al solo complesso ES, e la [ES] cresce al crescere
di [ S ].
L'inibitore incompetitívo è inibitore per il suo effetto
sulla Vmax, ma è virtualmente un attivatore per
quanto riguarda la Km.
49
