19.lezione 06-12-2016

TOPI CHIMERA
Topo omozigote
knockout
KNOCKOUT CONDIZIONALI
Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase
particolare di sviluppo (mutazione tempo/sito specifica)
• SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del
gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout.
il sistema Cre-Lox
Scoperto nel batteriofago P1 come meccanismo di
replicazione del genoma virale nel ciclo lisogenico
Il DNA vitale iniettato nel batterio circolarizza
utilizzando Cre-Lox e si replica per produrre nuovi
virus
Il sistema è formato da 2 componeneti:
la ricombinasi Cre che riconosce e taglia sequenze specifiche
chiamate LoxP
il sito LoxP che consiste di 34 bp: due sequenze palindrome di
13 bp spaziate da una sequenza di 8 bp
ATAACTTCGTATA -NNNTANNN-TATACGAAGTTAT
Cre riconosce e lega la regione palindromica di 13-bp in un sito
LoxP formando un dimero.
Il dimero, a sua volta lega un altro dimero su un altro sito LoxP
formando un tetramero.
Cre taglia I filamenti di DNA che vengono poi ricuciti da una DNA
ligasi.
Le sequenze LoxP sono direzionali
A seconda di come sono orientate le sequenze LoxP la ricombinasi Cre produce una
delezione, una inversione o una traslocazione
Stessa direzione -> DELEZIONE
Direzione opposta -> INVERSIONE
Su cromosomi diversi -> TRASLOCAZIONE
Il costrutto per il gene floxed
costrutto
esone x
induz. di Cre
ricombinaz.
e delez. neo
esone y
esone x
introne x
loxP - neo - loxP
neo
esone x introne x
esone z
gene tk
loxP
loxP - neo - loxP
ricombinaz.
omologa
costrutto
ricomb.
introne x
esone z
esone y
gene tk
loxP
esone y
esone z
loxP
loxP
Il gene per la timidino kinasi del virus Herpes simplex rende le cellule
sensibili al Ganciclovir
gene tk
Nel caso di ricombinazione non omologa il gene tk non verra’ eliminato e le cellule potranno
essere eliminate con la selezione dell’antibiotico
Dopo l’eliminazione della resistenza alla neomicina per l’induzione del gene Cre le cellule ES
mutanti sono pronte per essere iniettate nelle blasocisti
Figure 6-50 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-51 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-52 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-56 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-60 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-61 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-63 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-64 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-67 (part 1 of 7) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-67 (part 2 of 7) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-67 (part 3 of 7) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-67 (part 4 of 7) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-74 (part 3 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-76 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)