Trascrizione negli eucarioti RNA pol II trascrive anche i microRNA Sensibilità alla alfa-amanitina una tossina prodotta dal fungo: Amanita phalloides Gli elementi di regolazione della trascrizione in cis ALCUNE PROTEINE CHE LEGANO IL PROMOTORE SONO REPRESSORI (RARE) LA REPRESSIONE AGISCE PIU’ FREQUENTEMENTE A LIVELLO DELLA STRUTTURA DELLA CROMATINA Trascrizione geni eucariotici Fattori generali della trascrizione: Costituiscono insieme alla RNA polimerasi II L’APPARATO BASALE DELLA TRASCRIZIONE TFIIX TFIID= TBP (TATA binding protein)+ varietà di TAF (9) ( TBP associated factors) TFII- H è una chinasi, una ATPasi, una elicasi La regolazione dello stato di fosforilazione del CTD controlla anche passaggi successivi all’inizio di trascrizione Complesso di taglio e poliadenilazione CPSF cleavage and polyadenylation specificity factor CstF cleavage stimulation factor CF1 e CF2 endonucleasi TERMINAZIONE TRASCRIZIONE Due modelli per spiegare la terminazione della trascrizione negli Eucarioti A) Il trasferimento dei fattori di poli-adelinazione dalla RNA POLIMERASI all’RNA innesca un cambio conformazionale della proteina che ne rallenta l’attività e ne provoca l’arresto spontaneo B) La mancanza del cap sulla 2° molecola di RNA viene avvertita dalla polimerasi che si arresta GENI TRASCRITTI DA POLIMERASI II Prodotto della trascrizione è il pre-mRNA SPLICING Tutti geni per mRNA dei vertebrati contengono introni (eccezione di alcuni istoni) 60% - 98% della lunghezza di un gene FINO A 300 NEL GENE PER LA PROTEINA TITINA Negli altri eucarioti la situazione è variabile (lievito POCHISSIMI GENI HANNO INTRONI) Alcuni geni di archeobatteri contengono introni Alcuni geni per tRNA eucariotici contengono introni -Variano in lunghezza da 50 a 10000 nt -Non c’è conservazione di sequenza tra introni dello stesso gene in organismi diversi, anche vicini nella scala evolutiva 20-50 nt Forma a cappio dell’introne RNA splicing si realizza in due tappe SPLICEOSOMA snRNP (piccole particelle ribonucleoproteiche nucleari) e proteine nucleari chiamate fattori di splicing Lo “splicing” si può dividere in due tappe a) Riconoscimento di sequenze consensus sull’RNA substrato e assemblaggio dello spliceosoma b) Reazione di taglio e “ligation” con modifica della struttura dell’RNA substrato Entrambe le catene di DNA possono fungere da filamento stampo DNA GENOMICO DI ADENOVIRUS FATTORI BASALI APPARATO BASALE DELLA TRASCRI ZIONE ATTIVATORI AUMENTANO L’EFFICIENZA DI INIZIO DELLA TRASCRIZIONE IN MODO COSTITUTIVO O REGOLATO, INTERAGISCONO CON I CO-ATTIVATORI O DIRETTAMENTE CON I FATTORI BASALI CO-ATTIVATORI FORNISCONO UNA CONNESSIONE TRA GLI ATTIVATORI E L’APPARATO BASALE Enhancer: elemento che lega fattori di trascrizione regolando la trascrizione Differisce dai promotori in quanto: 1. Necessita di un promotore per funzionare 2. Può essere molto distante dal sito di inizio trascrizione (>10kbp) 3. Lavora in qualsiasi orientamento TRASCRIZIONE EUCARIOTI Fattori di trascrizione fattori basali, attivatori (costitutivi, non costitutivi), co-attivatori, repressori Enhancer Promotore 200bp 100bp Il promotore del gene umano dell’insulina Nero: fattori ubiquitari Rossi:fattori specifici delle cellule beta pancreatiche PDX è un fattore trascrizionale fondamentale per lo sviluppo delle cellule B del pancreas PROMOTORE EUCARIOTICO POLIMERASI II -75 -25 Introni autocatalitici Thomas Cech 1982 Proprietà catalitiche dell’RNA Autosplicing Introni di Gruppo II Introni di gruppo I Possiamo considerare gli snRNA dello spliceosoma come agenti che compensano la mancanza di informazioni di sequenza degli introni dei geni nucleari Essi forniscono le informazioni necessarie per formare particolari strutture secondarie dell’RNA Splicing alternativo: Gli esoni possono essere allungati, accorciati, eliminati o inclusi Gli introni possono essere rimossi o trattenuti, in parte o completamente da un mRNA Lo splicing alternativo può essere mediato da uso : a) b) c) sito di splicing alternativo al 5’ sito alternativo di splicing al 3’ exon skipping o salto dell’esone, la modalità più comune di splicing alternativo nei mammiferi d) introne trattenuto e) esoni mutualmente escusivi C) un esempio di un meccanismo complesso di splicing alternativo in cui è presente contemporaneamente un sito alternativo al 5’ e un salto dell’esone Splicing alternativo (a) Inclusione alternativa di un esone (b) Esoni mutualmente esclusivi (c) Sito di splicing 5’ alternativo (d) Sito di splicing 3’ alternativo (e) Conservazione di un introne Gene regulation through alternative splicing is more versatile than is regulation through promoter activity. Changes in promoter activity alter predominantly the expression levels of the mRNA. In contrast, changes in AS can modulate transcript expression levels and alter the structure of the gene product by inserting, or deleting, novel protein parts. I cambi strutturali nell’mRNA possono avvenire: a) nella regione codificante con: - Introduzione, o delezione di tratti di sequenza - Introduzione di un codone di stop prematuro della traduzione (PTC) b) Nella regione al 5’ o 3’ UTR dell’mRNA Gli effetti: mRNA : a) degradazione dell’mRNA con conseguente regolazione negativa dell’espressione genica b) Alterazioni della stabilità b) Alterazioni nel processo di localizzazione intracellulare Proteina: perdita di funzione o cambiamenti funzionali minimi di difficile individuazione Tra i due casi estremi si osservano alterazioni in: a) proprietà di binding b) localizzazione intracellulare c) attività enzimatica d) stabilità e) modifiche post-traduzionali In media un gene umano genera duo o tre trascritti, casi estremi: gene per la proteina neurexin 3 può formare fino a 1728 trascritti dovuti a AS a 4 differenti siti Gene della tropomiosina Recettore IL-4 Recettore ormone della crescita • The mechanism of splicing has been determined in great detail, in contrast, it is not yet fully understood how splice sites are selected • The major problem is the degeneracy of splicing regulatory sequences, such as the 5 ’ , 3 ’ splice sites, branch points and exonic/intronic sequence elements. These can only be described as consensus sequences that are loosely followed • As splice sites are degenerate, additional sequence elements located in the exon or in adjacent intronic elements aid their recognition by binding to regulatory proteins. These proteins can be subdivided into serine-arginine-rich SR proteins and hnRNPs Architecture of a pre-mRNA and the important cis-acting sequence elements that direct the splicing reaction Exonic and intronic sequences modulate the splice site selection SR: serine-arginine-rich proteins A/B: hnRNPs In general these proteins bind weakly to RNA. Increased specificity is achieved by the binding of multiple proteins to RNA that is aided by protein-protein interactions The formation of a specific protein-RNA complex from several intrinsically weak interactions has several advantages: a) the protein interaction can be influenced by small changes in the concentration of regulatory proteins which allows the alternative usage of exons depending on a tissue and/or development-specific concentration of regulatory factors; through these combination, a small number of splicing factors regulate a large number of pre-mRNA that encode protein isoforms with different biological properties b) phosphorylation of regulatory factors that alter protein-protein interactions can influence splice-site selection Schematic diagram of the sequences and proteins involved in regulating alternative splicing Most of the splicing regulatory mechanisms that have been described act by enhancing or preventing the binding of spliceosome to the pre-mRNA Caratteristiche di un esone non costitutivo mRNA 1 + - - - Sito di splicing 3’ + - - + + - Sito di splicing 5’ mRNA 2