I meccanismi di catalisi della sintesi di DNA e RNA sono identici U U OH Ribo-nucleotide trifosfato TRASCRIZIONE La RNA polimerasi è totalmente processiva Non ha bisogno di innesco Inizia a livello di un promotore Assenza di efficace proof-reading L’RNA prodotto si stacca subito dal DNA Accurata regolazione a livello di ogni singolo gene Trascrittoma = insieme dei trascritti presenti in una cellula Sito di inizio posizione +1 Posizioni - Posizioni + DNA ALLUNGAMENTO INIZIO (regolazione) RNA Comlesso chiuso Complesso aperto TERMINAZIONE Trascrizione iniziale TRASCRIZIONE PROMOTORE FORTE: ha struttura più vicina alla sequenza consenso RNA POL PROCARIOTICA • • • • • beta beta ‘ alfa 1 alfa 2 omega + • Sigma (oloenzima) Core enzimatico inizia la trascrizione “a caso” La trascrizione inizia solo in corrispondenza di un promotore (sequenze -10 e -35) Presente in promotori particolarmente forti Media l’apertura del DNA (AA aromatici) Sito di inizio della trascrizione Proteina rho simile a TRCF TERMINAZIONE rho-indipendente terminatore Mutazioni “negative” Sito di legame dell’attivatore Sito di legame del repressore OPERONE LATTOSIO Lattosio assente Lattosio presente OPERONE TRIPTOFANO Poco Trp attivazione Molto Trp repressione NEGLI EUCARIOTI VARI LIVELLI DI CONTROLLO DELLA ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI: PROCARIOTI: soprattutto a livello TRASCRIZIONALE IN BATTERI: UNA SOLA POLIMERASI che trascrive tutti gli RNA rRNA IN EUCARIOTI: tRNA, rRNA 5S 3 TIPI DIVERSI ( I, II e III ) POL II MEDIA LA TRASCRIZIONE DEGLI mRNA Intervento di numerosi fattori che regolano l’inizio della trascrizione cromosoma INIZIO DELLA TRASCRIZIONE ALLA TATATATA-BOX TBP - riconosce la TATA box - piega il DNA COMPLESSO DI PRE-INIZIO TFIIE e TFIIH Mediano la transizione da complesso chiuso - aperto ULTIMO EVENTO fosforilazione della coda della pol II Varie ripetizioni del peptide Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser I FATTORI TRASCRIZIONALI (ATTIVATORI) RECLUTANO: • proteine che richiamano la RNA pol II • proteine attive nello smantellamento dei nucleosomi e sul rimodellamento della cromatina • proteine che stimolano l’inizio o l’allungamento FATTORI TRASCRIZIONALI in “TRANS” (proteine ) ELEMENTI “IN CIS” ( Sequenze del promotore) ENHANCER DISAGGREGAZIONE DEI NUCLEOSOMI ENZIMI MODIFICATORI DEI NUCLEOSOSMI HAT RIMODELLAMENTO SWI / SNF ATPasi CONTROLLO COMBINATORIO ELICA DI RICONOSCIMENTO INTERAZIONI PROTEINE - DNA ZINC FINGERS LEUCINE ZIPPER AMINOACIDI IDROFOBICI A DISTANZA DI 7 aa (1 GIRO DI ELICA = 3.6 aa) LEUCINE ZIPPER DOMINIO ELIXELIX-LOOPLOOP-ELIX b-HLH dimerizzazione Legame al DNA INIBITORI DELLA TRASCRIZIONE E’ attiva solo in batteri (ANTIBIOTICO) E’ attiva in tutti gli organismi E’ UN VELENO !! E’ attiva solo in eucarioti Inibisce pol II e (parzialmente) pol III E’ UN VELENO !! hnRNA (heterogeneus nuclear RNA) oppure pre-mRNA oppure trascritto primario che diventa mRNA (insieme di molecole eterogenee citoplasmatiche) + rRNA 28S rRNA 18S tRNA - Elettroforesi in gel di agarosio con etidio bromuro FORMAZIONE DEL Cap al 5’ dell’ mRNA GTP GMP Legame 5’ – 5’ Legame al ribosoma metilazione 5’ mRNA Poli-adenilazione dell’mRNA poliA-polimerasi Terminazione RNAsi 5’ - 3’ “SILURO” RNAsi 5’ - 3’ “rho – simile” 5’ NT “non tradotto” 3’ NT Numero introni per gene Sequenze consenso presenti sul pre-mRNA e che guidano lo splicing Sito di splicing 5’ (donatore) Y=CoU R=GoA N=AoGoCoU Sito di splicing 3’ (accettore) Prima Trans-eserificazione Avvicina gli esoni Seconda Trans-eserificazione degradazione - Formazione del cappio - Giunzione degli esoni adiacenti - Rilascio dell’introne Esone n Prima transtrans-esterificazione Esone n+1 Seconda transtrans-esterificazione Esone n Esone n+1 Introne a cappio SPLICING ALTERNATIVO • Nei trascritti del 75% dei geni umani • In genere 2 prodotti diversi, in alcuni casi molti di più Il meccanismo di splicing “ignora” l’esone 3 oppure il 4 SPLICING ALTERNATIVO Modalità diverse di splicing alternativo Le diverse forme di mRNA possono essere prodotte contemporaneamente o essere mutualmente esclusive mRNA complessati con proteine specifiche che ne mediano l’esportazione • • • Proteine che regolano dello splicing che si legano alle giunzioni esone - esone che si legano alla coda di poli-A Complesso del poro nucleare Legame al ribosoma Cap GLI INTRONI sono stati persi dai procarioti (introni precoci) o acquisiti dagli eucarioti (introni tardivi) ? A COSA SERVONO I GENI INTERROTTI ? Rimescolamento degli esoni nell’evoluzione. Domini proteici spesso codificati da un esone Domini presenti in proteine diverse Duplicazione genica e trasposizione come possibile meccanismo