Lez08 attivazioneO2 Archivo

L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di
biodegradazione
Utilizzo di O2
 Respirazione
Piu’ del 90 % dell’ossigeno è consumato dagli organismi nella catena respiratoria
O2 + 4H+ + 4e2H2O E° = 0.815 V
Questa reazione rappresenta la maggiore sorgente di energia negli organismi aerobici,
quando accoppiata all’ossidazione di composti organici ricchi di elettroni,
come il gluclosio.
 Ossigenazione
L’ossigeno viene utilizzato per la biosintesi di varie molecole nei pathways
metabolici; uno o due atomi di O vengono incorporati nel substrato
Monoossigenazione
RH + ½ O2
ROH
OH
Diossigenazione
+
O2
+
2 e-
+
2H
+
H
OH
H
Perche’ le reazioni di ossigenazione devono essere catalizzate
da enzimi ?
L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di
biodegradazione
Aspetti termodinamici della riduzione di O2
Potenziali standard di riduzione di O2
E°, V vs. NHE, pH 7, 25 °C
O2 + eO2- + e- + 2H+
H2O2 + e- + H+
OH + e- + H+
O2 + 2e- + 2H+
H2O2 + 2e- + 2H+
O2 + 4H+ + 4e-
e-
O2
O2
+
- e , 2H
O2H2O2
H2O + OH
H2O
H2O2
2H2O
2H2O
H2O2
e-, H+
-0.33 (1)
+0.89
+0.38
+2.31
+0.281 (2)
+1.349
+0.815
e-, H+
H2O + OH·
2H2O
La completa riduzione di O2 richiede 4 elettroni, ma la maggior parte dei riducenti può
trasferire 1 o 2 elettroni per volta
L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di
biodegradazione
Aspetti termodinamici della riduzione di O2
La reazione (1), monoelettronica, richiede riducenti molto
forti.
La reazione (2), bielettronica, è termodicamente più favorita.
Le sostanze organiche sono generalmente riducenti
deboli per reazioni che coinvolgono 1 elettrone.
R· + e- + H+  R-H
pot. rid. elevato
La riduzione a 2 e- (reazione 2) è perciò quella
termodinamicamente favorita dalle sostanze organiche.
Le reazioni a 2 e- sono però reazioni molto lente
L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di
biodegradazione
Aspetti termodinamici della riduzione di O2
Esempi di reazioni di idrossilazione ed
epossidazione di sostanze organiche
Queste reazioni sono termodinamicamente permesse
tuttavia sono molto lente in assenza di catalizzatori
CH4 + ½ O2
C6H6 + ½ O2
C6H5OH + ½ O2
C 2 H4 + ½ O 2
C 5 H5 N + ½ O 2
CH3OH
C6H5OH
CH4(OH)2
C 2 H4 O
C5H5NO
H (kcal/mol)
-30
-43
-42
-25
-13
L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di biodegradazione
Aspetti cinetici della riduzione di O2
Barriera cinetica alla reazione diretta di O2 con substrati
organici
O2 – stato fondamentale: tripletto (2 e- spaiati)
RH – stato fondamentale: singoletto (no e- spaiati)
ROOH (prodotto) – stato fondamentale: singoletto
(no e- spaiati)
La reazione può avvenire solo con Eatt. molto elevata che consenta di portare
il prodotto in stato di tripletto
O2 + RH
ROOH
non puo’ avvenire in un unico stadio veloce ma attraverso 2 passaggi successivi con E att alta
O2 + RH
ROOH
ROOH lenta ROOH
oppure O2 potrebbe passare a stato di singoletto
O2 + 22.5 Kcal/mol
O2+ RH
O2
ROOH
L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di
biodegradazione
L’ossigeno nello stato di tripletto può partecipare a reazioni di ossidazione
monoelettroniche di sostanze organiche, senza alterare la molteplicità di spin;
tali reazioni sono però termodinamicamente sfavorite
O2 + RH
O2- + R· + H+
Reazioni bielettroniche sono termodinamicamente favorite, ma violano la
molteplicità di spin
O2 + RH
ROOH
Ossidazioni monoelettroniche che coinvolgono uno ione
metallico sono favorite e spin permesse
O2 + Mn+
Mn+1-O2-
O2 + Fe2+
Fe3+-O2-
L’attivazione dell’O2 da parte del ferro in
ossigenazioni bielettroniche
E’ necessario Fe2+
Fe2+ + O2
Fe 2+-O2
Fe3+-O2-·
Fe3+-O2-· + e-
Fe3+-O2-·
potrebbe essere la specie attiva, invece
Fe2+-O2-·
Fe3+-O22-
Fe3+-O22è preferita
monoossigenasi
diossigenasi
L’attivazione dell’O2 da parte del ferro in
ossigenazioni bielettroniche
Fe3+-O2-·
Fe
2+-O
(1)
2
Fe2+ + O2
(2)
Fe3+ + O2-·
 perdita di controllo
Fe3+-O2-· + e-
Fe2+-O2-·
Fe3+-O22-
Un elettrone in più deve essere immediatamente disponibile.
Occorrono in totale 2 e- (o almeno devono essere disponibili ad una velocità che sia
maggiore delle reazioni 1 e 2)
Chi fornisce l’elettrone addizionale?
Enzimi idrossilanti
centro Fe2S2
MMO
Fe(II) adiacente
Cit P450
flavoproteina
L’attivazione dell’O2 da parte del ferro in
ossigenazioni bielettroniche
Fe3+enzimi
Fe2+ enzimi
(resting state)
(resting state)
 cit P450
 sMMO
 Alcano monoossig.
(putida monoossina)
la riduzione precede sempre il
legame dell’O2
Fe3+-O22Specie comune
FeIV=O
 diossigenasi
idrossilanti
il ferro è già pronto per
legare O2
Risposta dei microorganismi ai composti
xenobiotici
 Esempio: degradazione di idrocarburi aromatici e alifatici
Ossigenasi
 Monoossigenasi
RH + O2 + 2e- + 2H+
ROH + H2O
 Diossigenasi
COOH
+
O2
COOH
+ NADH +
H
OH
H
+
+
NAD
+
Cis-diidro-diolo
OH
+
CHO
O2
COOH
OH
Acido muconico
OH
CH3
+
COOH
O2
COOH
OH
OH
Semialdeide muconica
Monoossigenasi
RH + O2 + 2e- + 2H+
ROH + H2O
Enzimi che catalizzano queste reazioni:
1) Metano monoossigenasi (MMO) 2 Fe3+ non eme
1 Cu-Cu + 1 Cu + 1 Zn(Cu)
2) Citocromo P450
1 Fe3+ eme
3) Tirosinasi
2 Cu2+
Per 1) e 2) lo stadio iniziale è la riduzione
Fe3+ + eFe2+
Fe2+ lega O2 per dare Fe3+-O2Fe3+-O2- + eFe3+-O22-
Monoossigenasi
 Le monoossigenasi catalizzano l’inserzione di un
atomo di ossigeno nel substrato organico
 Il secondo atomo di ossigeno viene ridotto a H2O da
un riducente esterno (monoossigenasi esterna)
S + RH2 + O2
SO + H2O + R
 o dal substrato stesso (monoossigenasi interna)
SH2 + O2
SO +H2O
Metano monoossigenasi
 Il metano viene prodotto nell’ambiente come prodotto finale del metabolismo
anaerobico di batteri metanogenici
 Il metano viene utilizzato da batteri metanotrofici (Methylococcus capsulatus e
Methylosinus trichosporium) che ossidano il metano come fonte di carbonio e di energia
 Parte del carbonio proveniente dal metano forma la biomassa dei batteri stessi, parte viene
eliminato come CO2.
 La reazione di ossidazionedel metano a metanolo necessita di catalizzatori perche’
CH4 è inerte, con altqa energia di legame (C-H, 104 kcal/mol)
 Il passaggio iniziale dell’ossidazione di CH4, in cui viene rotto il legame C-H, è catalizzato
dall’enzima metano monoossigenasi (MMO).
CH4 + O2 + NAD(P)H + H+
CH3OH + NAD(P) + H2O
MMO catalizza l’ossidazione di altri idrocarburi saturi, insaturi, lineari, ramificati e ciclici
fino a 8 atomi di C.
Metano monoossigenasi
 MMO nei batteri metanotrofi puo’ esistere sia in forma solubile (sMMOH)
che insolubile (pMMO) (legata alle membrane).
 Tutti i batteri metanotrofici producono la forma insolubile.
In condizioni di deficienza di rame molti ceppi batterici producono anche la
forma solubile.
L’espressione rame-dipendente delle MMO è regolata a livello di trascrizione.