L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di biodegradazione Utilizzo di O2 Respirazione Piu’ del 90 % dell’ossigeno è consumato dagli organismi nella catena respiratoria O2 + 4H+ + 4e2H2O E° = 0.815 V Questa reazione rappresenta la maggiore sorgente di energia negli organismi aerobici, quando accoppiata all’ossidazione di composti organici ricchi di elettroni, come il gluclosio. Ossigenazione L’ossigeno viene utilizzato per la biosintesi di varie molecole nei pathways metabolici; uno o due atomi di O vengono incorporati nel substrato Monoossigenazione RH + ½ O2 ROH OH Diossigenazione + O2 + 2 e- + 2H + H OH H Perche’ le reazioni di ossigenazione devono essere catalizzate da enzimi ? L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di biodegradazione Aspetti termodinamici della riduzione di O2 Potenziali standard di riduzione di O2 E°, V vs. NHE, pH 7, 25 °C O2 + eO2- + e- + 2H+ H2O2 + e- + H+ OH + e- + H+ O2 + 2e- + 2H+ H2O2 + 2e- + 2H+ O2 + 4H+ + 4e- e- O2 O2 + - e , 2H O2H2O2 H2O + OH H2O H2O2 2H2O 2H2O H2O2 e-, H+ -0.33 (1) +0.89 +0.38 +2.31 +0.281 (2) +1.349 +0.815 e-, H+ H2O + OH· 2H2O La completa riduzione di O2 richiede 4 elettroni, ma la maggior parte dei riducenti può trasferire 1 o 2 elettroni per volta L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di biodegradazione Aspetti termodinamici della riduzione di O2 La reazione (1), monoelettronica, richiede riducenti molto forti. La reazione (2), bielettronica, è termodicamente più favorita. Le sostanze organiche sono generalmente riducenti deboli per reazioni che coinvolgono 1 elettrone. R· + e- + H+ R-H pot. rid. elevato La riduzione a 2 e- (reazione 2) è perciò quella termodinamicamente favorita dalle sostanze organiche. Le reazioni a 2 e- sono però reazioni molto lente L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di biodegradazione Aspetti termodinamici della riduzione di O2 Esempi di reazioni di idrossilazione ed epossidazione di sostanze organiche Queste reazioni sono termodinamicamente permesse tuttavia sono molto lente in assenza di catalizzatori CH4 + ½ O2 C6H6 + ½ O2 C6H5OH + ½ O2 C 2 H4 + ½ O 2 C 5 H5 N + ½ O 2 CH3OH C6H5OH CH4(OH)2 C 2 H4 O C5H5NO H (kcal/mol) -30 -43 -42 -25 -13 L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di biodegradazione Aspetti cinetici della riduzione di O2 Barriera cinetica alla reazione diretta di O2 con substrati organici O2 – stato fondamentale: tripletto (2 e- spaiati) RH – stato fondamentale: singoletto (no e- spaiati) ROOH (prodotto) – stato fondamentale: singoletto (no e- spaiati) La reazione può avvenire solo con Eatt. molto elevata che consenta di portare il prodotto in stato di tripletto O2 + RH ROOH non puo’ avvenire in un unico stadio veloce ma attraverso 2 passaggi successivi con E att alta O2 + RH ROOH ROOH lenta ROOH oppure O2 potrebbe passare a stato di singoletto O2 + 22.5 Kcal/mol O2+ RH O2 ROOH L’attivazione dell’O2 nelle reazioni di biodegradazione L’ossigeno nello stato di tripletto può partecipare a reazioni di ossidazione monoelettroniche di sostanze organiche, senza alterare la molteplicità di spin; tali reazioni sono però termodinamicamente sfavorite O2 + RH O2- + R· + H+ Reazioni bielettroniche sono termodinamicamente favorite, ma violano la molteplicità di spin O2 + RH ROOH Ossidazioni monoelettroniche che coinvolgono uno ione metallico sono favorite e spin permesse O2 + Mn+ Mn+1-O2- O2 + Fe2+ Fe3+-O2- L’attivazione dell’O2 da parte del ferro in ossigenazioni bielettroniche E’ necessario Fe2+ Fe2+ + O2 Fe 2+-O2 Fe3+-O2-· Fe3+-O2-· + e- Fe3+-O2-· potrebbe essere la specie attiva, invece Fe2+-O2-· Fe3+-O22- Fe3+-O22è preferita monoossigenasi diossigenasi L’attivazione dell’O2 da parte del ferro in ossigenazioni bielettroniche Fe3+-O2-· Fe 2+-O (1) 2 Fe2+ + O2 (2) Fe3+ + O2-· perdita di controllo Fe3+-O2-· + e- Fe2+-O2-· Fe3+-O22- Un elettrone in più deve essere immediatamente disponibile. Occorrono in totale 2 e- (o almeno devono essere disponibili ad una velocità che sia maggiore delle reazioni 1 e 2) Chi fornisce l’elettrone addizionale? Enzimi idrossilanti centro Fe2S2 MMO Fe(II) adiacente Cit P450 flavoproteina L’attivazione dell’O2 da parte del ferro in ossigenazioni bielettroniche Fe3+enzimi Fe2+ enzimi (resting state) (resting state) cit P450 sMMO Alcano monoossig. (putida monoossina) la riduzione precede sempre il legame dell’O2 Fe3+-O22Specie comune FeIV=O diossigenasi idrossilanti il ferro è già pronto per legare O2 Risposta dei microorganismi ai composti xenobiotici Esempio: degradazione di idrocarburi aromatici e alifatici Ossigenasi Monoossigenasi RH + O2 + 2e- + 2H+ ROH + H2O Diossigenasi COOH + O2 COOH + NADH + H OH H + + NAD + Cis-diidro-diolo OH + CHO O2 COOH OH Acido muconico OH CH3 + COOH O2 COOH OH OH Semialdeide muconica Monoossigenasi RH + O2 + 2e- + 2H+ ROH + H2O Enzimi che catalizzano queste reazioni: 1) Metano monoossigenasi (MMO) 2 Fe3+ non eme 1 Cu-Cu + 1 Cu + 1 Zn(Cu) 2) Citocromo P450 1 Fe3+ eme 3) Tirosinasi 2 Cu2+ Per 1) e 2) lo stadio iniziale è la riduzione Fe3+ + eFe2+ Fe2+ lega O2 per dare Fe3+-O2Fe3+-O2- + eFe3+-O22- Monoossigenasi Le monoossigenasi catalizzano l’inserzione di un atomo di ossigeno nel substrato organico Il secondo atomo di ossigeno viene ridotto a H2O da un riducente esterno (monoossigenasi esterna) S + RH2 + O2 SO + H2O + R o dal substrato stesso (monoossigenasi interna) SH2 + O2 SO +H2O Metano monoossigenasi Il metano viene prodotto nell’ambiente come prodotto finale del metabolismo anaerobico di batteri metanogenici Il metano viene utilizzato da batteri metanotrofici (Methylococcus capsulatus e Methylosinus trichosporium) che ossidano il metano come fonte di carbonio e di energia Parte del carbonio proveniente dal metano forma la biomassa dei batteri stessi, parte viene eliminato come CO2. La reazione di ossidazionedel metano a metanolo necessita di catalizzatori perche’ CH4 è inerte, con altqa energia di legame (C-H, 104 kcal/mol) Il passaggio iniziale dell’ossidazione di CH4, in cui viene rotto il legame C-H, è catalizzato dall’enzima metano monoossigenasi (MMO). CH4 + O2 + NAD(P)H + H+ CH3OH + NAD(P) + H2O MMO catalizza l’ossidazione di altri idrocarburi saturi, insaturi, lineari, ramificati e ciclici fino a 8 atomi di C. Metano monoossigenasi MMO nei batteri metanotrofi puo’ esistere sia in forma solubile (sMMOH) che insolubile (pMMO) (legata alle membrane). Tutti i batteri metanotrofici producono la forma insolubile. In condizioni di deficienza di rame molti ceppi batterici producono anche la forma solubile. L’espressione rame-dipendente delle MMO è regolata a livello di trascrizione.