Il ruolo degli ormoni nel interazione pianta patogeno - e

dopo la percezione…
Risposte tra 1 min e 2h
The perception step is followed by activation of
protein kinases (PK) or inhibition of protein
phosphatases (PP) that, in turn, trigger the Ca2+
influx. Within the first 5 min, nearly 20
phosphoproteins showed an increase in
phosphorylation status
Extracellular Ca2+ influx, depending on PK activation,
triggers ROS production, MAPK activation, PK
activation upstream of the NO production, anion
effluxes and plasma membrane depolarization,
glucose (Glc) import inhibition, microtubule
depolymerization, and may lead to the H+-ATPase
inhibition
La risposta locale
I ROS
La famiglia dei ROS intesa in senso stretto consiste in:
Anione superossido O2.Idroperossil radicale HO2.
Perossido d'idrogeno H2O2
Idrossil radicale HO.
Il superossido, la sua forma protonata e l'idrossil radicale hanno
un breve tempo di vita mentre l' H2O2 è relativamente stabile
e può passare attraverso le membrane
Tra i ROS, l'idrossil-radicale è particolarmente tossico a causa
della sua straordinaria capacità di reagire spontaneamente
con diverse molecole organiche come i fenoli, gli acidi grassi,
le proteine e gli acidi nucleici
ROS nell'interazione pianta-patogeno
I ROS sono fattori chiave nella predisposizione e nel
mantenimento sia dell'inaccessibilità che
dell'accessibilità dell'ospite per i patogeni
Infatti da un lato i ROS sono implicati nella signal
transduction e nell'esecuzione delle reazioni di
difesa come nel rafforzamento della parete cellulare
e nella rapida morte cellulare (HR). Dall'altro i ROS
si accumulano anche nelle reazioni compatibili in cui
sembrano paradossalmente connessi con la
limitazione della diffusione della morte cellulare
Diversi tipi di ROS possono stimolare effetti
diametralmente opposti in dipendenza sia della loro
distribuzione spaziotemporale che delle loro
concentrazioni subcellulari
ROS nell'interazione pianta-patogeno
I ROS svolgono diversi ruoli nell'interazione che vanno
da un effetto benefico che porta allo stabilirsi di una
reazione incompatibile ad un effetto coadiuvante
l'infezione (patogeni necrotrofi)
Le cellule vegetali rispondono alle infezioni batteriche
con un rapido e transiente accumulo bifasico dei
ROS
Mentre il primo ciclo di accumulo avviene sia nelle
interazioni compatibili che in quelle incompatibili la
seconda, prolungata, fase precede la morte cellulare
e dipende dalla presenza di un'interazione specifica
R/Avr che porta all'incompatibilità
Il burst ossidativo
• Il burst ossidativo è una risposta comune a tutti i tipi di
stress sia biotico che abiotico ed includono l’HR e la
risposta all’ozono
• Ad esempio in tabacco e Arabidopsis un burst ossidativo
bifasico o un prolungato accumulo di ROS risultano
nell’attivazione della PCD
• In diverse specie vegetali è stata osservata una chiara
correlazione spaziale tra l’accumulo di ROS e le lesione
cellulari
• In tabacco, betulla e pomodoro ad es. c’è una chiara
correlazione tra il perossido d’idrogeno e le lesioni tardive
mentre l’aso è maggiormente collegato alla morte cellulare
in Arabidopsis e malva, indicando un ruolo specie-specifico
dei ROS nella modulazione della PCD
NADPHox come sorgente di ROS
L'accumulo molto precoce di H2O2 nell'apoplasto dopo
il contatto col patogeno suggerisce che almeno in
parte questo derivi dalla dismutazione dell'anione
superossido prodotto dal complesso della NADPH
ox
Infatti in tabacco l'esposizione al patogeno causa una
up-regolazione di due isoforme di NADPH ox
Quindi la produzione di aso e la sua dismutazione
regolano la presenza di ROS nell'apoplasto, quando
è molto attiva la NADPHox e il tasso di dismutazione
è alto si accumula H2O2 mentre quando questo
tasso è basso si accumula aso
La regolazione della NADPHox
La precoce induzione di rapidi flussi ionici attraverso la
membrana plasmatica sono coinvolti direttamente nell'induzione
del burst ossidativo
2+ binding domain e non
Le proteine RBOH contengono dei Ca
hanno le subunità citoplasmatiche separate come quelle delle
cellule animali (p67, p47...) quindi gli ioni calcio svolgono un
ruolo importante nel controllo della produzione di aso
 Anche gli spostamenti anionici (Cl ; NO ) sono coinvolti
3
nell'attivazione del burst ox
Altri importanti regolatori del complesso NADPHox sia nelle
piante che negli animali sono le protein kinasi e le fosfatasi, le
small GTPasi e le fosfolipasi. Infatti una small GTPasi della
famiglia Rac è implicata nella produzione di ROS e nella PCD

NADPH provided by the pentose phosphate pathway
induced in the first minutes of plant-pathogen interaction

..dopo l’attivazione
•Ci sono almeno 3 vie che
indipendentemente portano ad una
riprogrammazione trascrizionale in
seguito all’attivazione della difesa
•La prima è legata ai geni EDS1
(enhanced disease susceptibility) o
PAD4 che interagiscono fisicamente tra
loro in vivo
•EDS1/PAD4 interagiscono
principalmente con le proteine CC-NBLRR
•La riprogrammazione trascrizionale
seguente al riconoscimento del
patogeno è dipendente dall’accumulo a
livello nucleare di EDS1
NDR1
•La seconda è legata a NDR1 (non
race specific disease resistance) che
codifica per una
glicosilfasfatidilinositolo(GPI)
anchored protein
•Negli animali queste proteine si
trovano nei rafts lipidici (specialised
membrane domains enriched in
certain lipids cholesterol and proteins
) e sono associate con complessi
recettoriali.
•NDR1 interagisce principalmente
con le proteine TIR-NB-LRR (ad es.
interagisce con RIN4 e con RPM1)
RPW8
•Una terza via è
rappresentata dai geni R
RPW8 1 e 2 che
conferiscono resistenza a
numerose powdery
mildews (oidio) e
codificano per delle
proteine con domini CC
ma senza le regioni NB e
LRR
Ricapitolando….
Dopo la percezione dei PAMP del patogeno o dopo un
interazione avr/R si depolarizza la membrana e si ha un
efflusso di ioni Ca con attivazione di calmoduline/calmoduline
kinasi e canali ionici di membrana
Questi fattori contribuiscono all’attivazione della NADPHox (burst
ossidativo) e di altre cascate MAP kinasiche nonché
all’attivazione della NO sintasi
Queste pathway contribuiscono indipendentemente o
sinergicamente all’attivazione dei fattori EDS1/PAD4 o NDR1
Cosa controllano questi fattori? In primis la sintesi di fitormoni
Il ruolo degli ormoni nell’interazione
pianta-patogeno
• Il complesso interplay degli jasmonati con l’acido
salicilico e l’etilene fornisce alle piante un
potenziale regolativo in grado di controllare il destino
dell’interazione pianta-patogeno
• Gli ormoni acido jasmonico, salicilico e l’etilene sono i
principali regolatori dell’immunità innata nelle
piante
Acido Jasmonico
Ruolo del JA
• A seconda del tipo di interazione ospite-patogeno il JA,
l’SA e l’Et sono coinvolti in modo differenziale nella PTI,
infatti le pathway di signalling difensivo che si attivano
sono diverse a seconda dello “stile di vita” del patogeno
• Le risposte difensive stimolate dal SA sono normalmente
associate con la PCD e questo tipo di risposta è effettiva
contro i biotrofi ma è non efficiente o addirittura
peggiorativa nel caso dei necrotrofi
Il ruolo del JA
• Le risposte difensive stimolate dal JA sono invece effettive
contro i necrotrofi, infatti mutanti jar1 (ridotta sensibilità al
metiljasmonato) e fad3-8 (ridotta biosintesi di JA) di At
risultano essere suscettibili ad alcune specie normalmente
non patogeniche di Pythium, un oomicete necrotrofico
• Il mutante JA-insensitive coi1 mostra aumentata
suscettibilità a Erwinia carotovora ed ai funghi nectrotrofi
Alternaria brassicola e Botrytis cinerea
• Un overespressione di una JA carbossimetil-transferasi
aumenta i livelli endogeni di MeJA e risulta in una
maggiore resistenza a B. cinerea
Jasmonate signaling
La catena di trasduzione del segnale che lega la
sintesi del JA ai cambiamenti da questo indotti
nell’espressione genica consiste in un
quartetto di fattori interagenti:
Un JA signal
SCF-COI1 – E3 ubiquitina ligasi SCF complex
JAZ proteins – proteine repressore targeted da
COI1 per la degradazione attraverso il proteasome
26S
Fattori di trascrizione (TF) che regolano
positivamente l’espressione dei JA responsive
genes
Jasmonate signaling
Le cellule che contengono
bassi livelli di JA i geni
responsive al JA sono
repressi (OFF) dalle JAZ
proteins che bloccano
l’attività dei fattori di
trascrizione (TF: e.g. MYC2)
coinvolto nell’espressione
degli early response gene
La transizione dallo stato
represso a quello attivo (ON)
è iniziata da stimoli
ambientali (e.g. biotic stress)
che inducono un aumento di
forme bioattive del JA
Jasmonate signaling
I JA bioattivi (cerchio arancio)
come il coniugato JA-Ile si
legano al dominio LRR di
COI1.
L’interazione delle JAZ con il
COI1 legato al JA porta alla
formazione di un complesso
ternario JA-JAZ-COI1 in cui
JAZ viene poliubiquinata
(cerchi neri) e
seguentemente degradata
dal proteasoma 26S
Jasmonate signaling
Il signaling è attenuato dal
metabolismo dei JA bioattivi
verso le forme inattive
dell’ormone (esagono
arancio) cosi come dalla
sintesi de novo delle proteine
JAZ
Alcuni batteri fitopatogeni come
P. syringae producono la
coronatina un analogo
strutturale del JA-Ile
Il legame ad alta affinità della
COR con il complesso COI1JAZ promuove la distruzione
proteolitica di JAZ
Modulazione del sistema a 4
Lo switch tra lo stato bloccato e quello attivo dell’espressione
dei geni JA responsive è quindi stimolato dalla proteolisi di
JAZ. Questa transizione è iniziata in risposta a diversi tipi di
stress ed è dovuta
JA stimola il turnover di jaz attraverso un meccanismo che richiede COI1
e il proteasoma 26S
JA promuove una interazione diretta tra COI1 e JAZ
Questo semplice sistema di switch ormonale fornisce uno
stretto accoppiamento temporale tra l’aumento
intracellulare di JA e i cambiamenti nella gene expression.
Ad es. un rapido accumulo di JA (>5 min) in seguito a
wounding avviene praticamente in coincidenza con
l’espressione degli early JA-responsive genes
I JAs bioattivi
Il neo sintetizzato JA è soggetto a diverse modifiche
enzimatiche che danno origine a una pletora di derivati tra
cui quelli con AA come l’Ile o la valina. Nonostante molti JA
non coniugati siano attivi per se come il JA, il MeJA e le
OPDA non sono attivi nell’interazione COI1-JAZ
Infatti il segnale primario per questo complesso sono i
coniugati JA-Ile o JA-Val mentre i non coniugati potrebbero
agire attraverso un sistema diverso da quello COI1-JAZ
I mutanti jar1 sono difettivi nella coniugazione di JA con Ile,
infatti JAR1 è una GH3 conjugating enzyme che esibisce
una elevata affinità di substrato sia con JA che con Ile
I fenotipi associati con i mutanti jar1 indicano che JA-Ile sono
fondamentali per la resistenza ai necrotrofi e a diversi tipi di
stress abiotico
I JAs bioattivi
La coronatina sopprime le risposte immunitarie dell’ospite
attivando la JA signaling pathway attraverso un COI1dependent manner.
La similarità strutturale di COR con JA-Ile suggerisce che la
tossina agisca mimando JA-Ile
Infatti COR è capace di stimolare l’interazione COI1-JAZ e
inoltre è 100 volte più attiva di JA-Ile nel farlo
La degradazione di JAZ mediata da COR fornisce un classico
esempio di come i patogeni possano alterare le pathway
di signaling ormonale (dell’acido salicilico) nell’ospite per
promuovere l’infezione
L’acido salicilico
•
EDS1/PAD4 è necessario per due
passaggi. È richiesto per
l’attivazione di EDS5
•
EDS5 agisce a monte di sid2 nel
regolare la biosintesi di SA, infatti la
sua espressione è inalterata nel
mutante sid2 (sid codifica per una
isocorismato sintasi)
•
SA può attivare l'espressione delle
PR proteins e la resistenza
attraverso 2 meccanismi. Il primo
richiede i geni NPR1 e TAG2 che
contrastano l'effetto inibitorio del
soppressore inducibile di NPR1
(SNI1)
•
Un segnale lipidico generato da
SFD-1 è necessario per l'attivazione
della pathway del SA dip. da NPR1
Biosintesi del SA
• L'attivazione della pathway
di signalling mediata dai
geni R è capace di attivare
la sintesi di SA
• SA si accumula sia a livello
locale che sistemico in seguito
a un infezione e induce la
sintesi di diverse PR proteins
• La mancata produzione di SA
previene l'induzione della SAR
• Viene degradato dalla
salicilato idrossilasi codificata
dal gene nahG presente
anche in molti batteri
fitopatogeni
L’acido salicilico
•
EDS1/PAD4 è necessario per due
passaggi. È richiesto per
l’attivazione di EDS5
•
EDS5 agisce a monte di sid2 nel
regolare la biosintesi di SA, infatti la
sua espressione è inalterata nel
mutante sid2 (sid codifica per una
isocorismato sintasi)
•
SA può attivare l'espressione delle
PR proteins e la resistenza
attraverso 2 meccanismi. Il primo
richiede i geni NPR1 e TAG2 che
contrastano l'effetto inibitorio del
soppressore inducibile di NPR1
(SNI1)
•
Un segnale lipidico generato da
SFD-1 è necessario per l'attivazione
della pathway del SA dip. da NPR1
NPR1: non-expresser of PR
genes
• Anche noto come NIM1 o SAI1
• Regolatore Positivo della SAR
• Agisce a valle di SA, a monte
dei PR genes
• npr1 mutanti sono suscettibili a
diversi patogeni
• Over-espressione di NPR1
genera broad-spectrum
resistance
• Unico, ma simile a NFκ-B
(regulator of immunity in
animals)
Avr
R gene
SA
NPR1
PR-1 PR-2 PR-5
SAR
Relazione tra NPR1 e i ROS
• Nelle piante lo stato redox è capace di regolare NPR1,
infatti questo normalmente si accumula come oligomero
che si mantiene inattivo grazie a dei ponti disolfuro nel
citosol
• Dopo l'elicitazione la riduzione dei ponti disolfuro rilascia
delle unità monomeriche che traslocano nel nucleo e
interagiscono con la forma ridotta del fattore di
trascrizione TGA1 che a sua volta attiva l'espressione dei
geni di difesa dipendenti da SA
I fattori TGA
• Interagiscono con
NPR1
• Sono bZIP
transcription factors
• 6 membri in
Arabidopsis (TGA16)
• Si legano ad
elementi as-1
• NPR1 non solo induce i PR genes ma
anche i secretion-related genes
• Questi secretion-related genes sono
necessari per un trasporto efficiente delle
PR proteins e per l'induzione della SAR
• NPR1 interagisce con un cis-elemento
(TL1) per indurre I secretion-related genes
separatamente dai PR gene element (as1)
Il ruolo dell’etilene nel interazione
ospite-patogeno
• Il fitormone etilene è il principale modulatore in molti aspetti
della vita di una pianta tra cui i vari meccanismi attraverso i
quali una pianta reagisce all’attacco di un patogeno
• Il signaling intracellulare “acceso” dall’Et porta ad una
cascata di fattori di trascrizione che consiste primariamente
dei regolatori EIN3 e secondariamente dei fattori ERF
• Questi controllano l’espressione di diversi geni coinvolti in
vari aspetti della resistenza sistemica indotta
• Sono presenti livelli significativi di cross-talk tra le diverse
pathways di risposte difensive controllate dal SA e dal JA
che alla fine risulta in una risposta di difesa differenziata
La biosintesi di etilene
• L’Et è sintetizzato a partire dalla metionina che è convertita ad Sadenosilmetionina (AdoMet) dalla S-adomet sintasi (ADS). Adomet è il
principale donatore di gruppi metilici nelle piante ed è coinvolto nelle
reazioni di metilazione dei lipidi, proteine o acidi nucleici
• L’adomet è convertita dall’enzima ACS (ACC sintasi) a
metiltioadenosina che attraverso il ciclo di Yang è trasformata in
aminociclopropano-1-carbossilato (ACC) il precursore dell’Et
• L’ACC è ossidato dalla ACC ox (ACO) per formare Et, cianuro e CO2
Regolazione trascrizionale della
sintesi dell’Et
• ADS è coinvolta in molti metabolismi oltre alla sintesi dell’Et,
infatti la sua espressione non viene indotta in modo particolare
dagli stress
• ACO, che è codificata da una famiglia multigenica, è
differenzialmente espressa durante lo sviluppo o in risposta
all’attacco del patogeno oltre che a stress di natura abiotica. In
particolare 2 geni aco (aco1/2) sono upregolati dai fattori di
avirulenza AvrPto e AvrPtoB. Quindi la sua espressione è
controllata anche a livello trascrizionale
• ACS è presente in almeno 10 copie geniche in At che hanno
un ruolo fondamentale nella sintesi di Et che è infatti regolata
attraverso il controllo trascrizionale dei geni acs in risposta a
diversi tipi di stimoli. Atacs2 è fortemente upregolato in
condizioni di attacco da parte di patogeni necrotrofici come B.
cinerea mentre Atacs5 e 11 sono downregolati quanto At è
attaccata da biotrofici come P. syringae
Percezione e signalling citoplasmico
•
Et prodotto in seguito a stimolo interno
od esterno è percepito dalla cellula e
questo segnale è ulteriormente
trasmesso attraverso una singola e
ben conservata cascata di segnali
•
L'analisi dei mutanti ein2 ha messo in
evidenza 5 recettori coinvolti nei primi
step di percezione dell'Et, ETR1-2,
ERS1-2 e EIN4. Questi hanno una
buona omologia con i regolatori a due
componenti batterici
•
ETR1 e ERS1 sono presenti nella
membrana del reticolo endoplasmatico
come omodimeri legati con un ponte
disolfuro
•
Ogni omo-dimero forma una tasca
idrofobica che rappresenta un sito di
legame per l'Et (mediata da un
cofattore rameico)
Percezione e signaling citoplasmico
•
Altri domini presenti nei recettori
ETR sono: un cGMP binding site e
una regione HK. Il ruolo di questi
domini nella percezione dell'Et ancora
non è chiara, anche se la
fosforilazione esercitata attraverso un
dominio SERK (presente nella
subfamiglia 2 dei recettori) è
necessaria per trasmettere l'Et
signalling a valle
•
Tutti questi recettori per l'Et sono inibiti
dal legame con l'ormone e agiscono
come regolatori negativi delle
risposte all'Et
•
Quindi la percezione dell‘Et avviene a
livello dell'ER che rappresenta un
punto di giunzione per i diversi
processi cellulari che includono
diverse risposte allo stress in cui l'Et è
un regolatore chiave
Percezione e signaling citoplasmico
•
Studi sul mutante ctr1 (constitutive
triple response) di At hanno portato
all'individuazione di CTR1 come
regolatore negativo delle risposte
all'Et. Oltre ad avere un dominio a
funzione sconosciuta nell'N terminale
possiede un dominio SERK al C
terminale (che lo rende simile alle
Rak-like kinases)
•
Anche CTR1 si trova nell'ER anche
se non ha nessun segnale di
riconoscimento per la membrana ma
la sua localizzazione è suggerita
dall'interazione con i recettori per
l'Et. Sembra che sia l'interazione con i
recettori che l'attività kinasica siano
necessari per la regolazione negativa
delle risposte all'Et
Percezione e signaling citoplasmico
•
In assenza di Et il legame con i
recettori mantiene CTR1 attivo
agendo cosi come regolatore
negativo abile nel reprimere le
risposte a valle indotte dall'Et.
•
Il legame dell'Et con i recettori
causa un cambiamento
conformazionale di CTR1 che risulta
nel rilascio del suo effetto inibitorio
•
Un altro mutante risultante dallo
screening per l'insensibilità all'Et è
risultato essere ein2. EIN2 possiede
due domini, uno idrofilico che è
coinvolto nell'interazione P-P e uno
idrofobico che contiene 12 eliche
transmebrana che la rendono simile
alle Nramp proteins coinvolte nel
trasporto transmembrana dei metalli
Trasmissione nucleare dell'Et signal
•
La completa perdita di sensibilità
all'Et nei mutanti ein2 indica un ruolo
centrale nella trasduzione del segnale
da parte di EIN2. L'overespressione
della parte C terminale sembra essere
sufficiente ad attivare in modo
costitutivo le risposte all'Et
•
Quindi il segnale dell'Et arriva nel
nucleo attraverso la derepressione di
EIN2 da parte di CTR1 e porta
all'attivazione dei fattori di trascrizione
EIN3 e EIN3-like
•
EIN3 ed EIL1 sono correlati tra loro e
sono i fattori più importanti nella
sensibilità all'Et
•
La modulazione dell'attività di questi
fattori dall'Et non avviene a livello
trascrizionale ma attraverso il controllo
proteolitico dei livelli di EIN3 da parte
del complesso SCF ubiquitina ligasi
Trasmissione nucleare dell'Et signal
•
In assenza di Et EIN3 sono continuamente
degradate attraverso AtEBF1 (F-box
protein che destabilizzano le proteine
target) e il proteasoma e in tale modo si
previene l'attivazione dei loro target
trascrizionali. Mentre, in presenza di Et la
degradazione di EIN3 è soppressa
consentendo così a questo fattore di
incrementarsi in quantità e di promuovere
gli eventi a valle
•
Dato che diverse PK sono poste a monte di
EIN3 è possibile che la sua fosforilazione
inibisca l'associazione con AtEBF1
prevenendone quindi la sua degradazione
•
EIN3 riconosce il suo target nel DNA
chiamato EIN3 binding site (EBS) o
primary Et response element (PERE) che
si trova nei promotori dei geni che
codificano per proteine che si legano negli
elementi di risposta all'Et
Trasmissione nucleare dell'Et signal
•
Il fattore di trascrizione ERF1 è un
immediato target per EIN3. ERF1
appartiene alla famiglia dei fattori di
risposta all'Et anche chiamati proteine che
si legano agli elementi di risposta all'Et
(EREBs).
•
Questi fattori di trascrizione si legano nel
cosiddetto GCC box che è un elemento
presente nel promotore di molti geni
responsive all'Et come ad es. quelli che
codificano per le PR proteins
•
Il GCC box è un elemento che agisce in
cis e che consiste di una sequenza
conservata di 11 bp (TAAGAGCCGCC)
necessaria e sufficiente per la regolazione
da parte dell'Et dei geni responsive
•
Gli ERF mostrano un'alta omologia con i
fattori di trascrizione che si legano ai siti
DREB (dehydration responsive element)
nei promotori dei geni che sono
responsive allo stress abiotico
Trasmissione nucleare dell'Et signal
•
La superfamiglia AP/ERF di fattori di
trascrizione comprende circa 145 membri in At
•
In aggiunta alla regolazione trascrizionale
attraverso i fattori EIN3, i fattori Erf sono
regolati a livello post mediante la
fosforilazione, infatti AtERF5 contiene un sito
riconosciuto da una MAPK e la sua
fosforilazione aumenta la sua capacità di
legame ai GCC box
•
Molti ERF sono degli attivatori trascrizionali
come AtERF1, 2 e 5 mentre una seconda
classe di proteine ERF come AtERF3, 4, 7 e
10 reprimono l'espressione dei geni che
presentano un GCC box
•
In tutti gli ERF è presente un motivo AA di
repressione genica chiamato EAR (ERF
associated amphiphilic repression).
L'overespressione di ERF4 conferisce un
fenotipo Et insensibile e reprime l'espressione
di tutti i geni contenenti nel promotore un GCC
box
Etilene nella malattia
• La biosintesi di Et è attivata in molte piante in seguito
ad attacco patogenico e la sua produzione induce dei
geni effettori relativi alla difesa attraverso una cascata di
eventi di cui il penultimo step è rappresentato
dall'attivazione dei fattori di trascrizione ERF-like
• Il ruolo specifico dell'Et nella difesa è centrato su 3 fronti
poiché induce
– Proteine che partecipano nel build-up delle barriere
fisiche
– Enzimi del metabolismo secondario coinvolti nella
biosintesi delle fitoalessine
– Proteine relative alla patogenesi (PR)
Cross talk ormonale